O documento descreve métodos de estudo em histologia, incluindo preparação de lâminas histológicas, coloração, microscopia e técnicas como histoquímica e imuno-histoquímica. Detalha etapas como fixação, processamento, inclusão, microtomia e coloração para análise de tecidos sob microscopia de luz e eletrônica.
Aproveitando as ferramentas do Tableau para criatividade e produtividade
Métodos de estudo em histologia
1. Métodos de estudo em histologia
Métodos de estudo em histologia
Prof. Dr. Caio Maximino
Marabá/PA-2015
2. Métodos de estudo em histologia
Preparação de lâminas histológicas
Preparação
de lâminas
Coloração
Histo- e
citoquímica
Imuno
Hibridação
Microscopia
de luz
Fluorescência
Contraste
de fase
Eletrônica
●
O tecido pode ser preparado pode ser in vivo ou até
mesmo morto;
● Mais comum: preparado histológico permanente
(lâminas histológicas).
COLETA FIXAÇÃO PROCESSAMENTO DESIDRATAÇÃO
DIAFANIZAÇÃO INCLUSÃO MICROTOMIA COLAGEM
COLORAÇÃO MONTAGEM
3. Métodos de estudo em histologia
Coleta da amostra
Obtido principalmente por meio de:
1) Biópsia cirúrgica – através de uma incisão cirúrgica no órgão
ou tecido;
2) Biópsia endoscópica – usada para órgãos ocos (estômago,
intestino, etc.) através de endoscopia;
3) Biópsia por agulha – a amostra (cilindro) é obtida pela punção
do órgão (fígado, pulmão), sem precisar abrir a cavidade
natural;
Preparação
de lâminas
Coloração
Histo- e
citoquímica
Imuno
Hibridação
Microscopia
de luz
Fluorescência
Contraste
de fase
Eletrônica
4. Métodos de estudo em histologia
Coleta da amostra
4)Cirurgias amplas – a amostra corresponde a
peças grandes (ex. tumores) ou órgãos (ex.
mama, útero);
5)Necrópsia – procedimento utilizado para estudo
anatômico de todos os órgãos ou tecidos, no
animal morto.
NOTA: Amostras de tamanho grande devem ser clivadas,
reduzindo a sua espessura – facilita a penetração do
FIXADOR. Tamanho final em torno de 4mm.
Preparação
de lâminas
Coloração
Histo- e
citoquímica
Imuno
Hibridação
Microscopia
de luz
Fluorescência
Contraste
de fase
Eletrônica
5. Métodos de estudo em histologia
Fixação
● Base para uma boa preparação histológica;
● Deve ser completa e adequada
– A amostra deve ser imerso rapidamente no fixador;
– O volume de fixador deve ser no mínimo dez vezes maior que o
volume da peça coletada.
●
Objetivos:
●
Inibir ou parar a autólise tecidual;
●
Coagular ou endurecer o tecido;
● Proteger, através do endurecimento, os tecidos moles no manuseio e
procedimentos técnicos posteriores;
●
Preservar os vários componentes celulares e tissulares;
●
Melhorar a diferenciação óptica dos tecidos;
●
Facilitar a subsequente coloração.
Preparação
de lâminas
Coloração
Histo- e
citoquímica
Imuno
Hibridação
Microscopia
de luz
Fluorescência
Contraste
de fase
Eletrônica
6. Métodos de estudo em histologia
Fixação
Preparação
de lâminas
Coloração
Histo- e
citoquímica
Imuno
Hibridação
Microscopia
de luz
Fluorescência
Contraste
de fase
Eletrônica
FÍSICA QUÍMICA
CALOR OU FRIO FIXADORES QUÍMICOS
Função de insolubilizar as
proteínas dos tecidos
7. Métodos de estudo em histologia
Fixadores químicos
Fixador Efeito Exemplos
Reticuladores (aldeídos) Formação de ligações
covalentes ancora
proteinas de
citoesqueleto
Formaldeído (formalina
tamponada)
Glutaraldeído
Precipitadores (álcoois) Reduzem a solubilidade
das proteínas e
atrapalham interações
hidrofóbicas
Etanol
Metanol
Acetona
Oxidantes Permitem a formação de
ligações cruzadas em
cadeias laterais
Tetróxido de ósmio
Dicromato de potássio
Ácido crômico
Mercuriais ? B-5
Fixador de Zenker
Picratos Reagem com histonas e
proteínas alcalinas,
formando precipitado
Ácido pícrico
Preparação
de lâminas
Coloração
Histo- e
citoquímica
Imuno
Hibridação
Microscopia
de luz
Fluorescência
Contraste
de fase
Eletrônica
8. Métodos de estudo em histologia
Fixadores
Alvo Fixador ideal Fixador a evitar
Proteínas Formalina tamponada,
PFA
OsO4
Enzimas Secções congeladas Fixadores químicos
Lipídeos Secções congeladas,
OsO4
/glutaraldeído
Fixadores alcoólicos,
formalina tamponada
Ácidos nucléicos Fixadores alcoólicos Fixadores aldeídos
Mucopolissacarídeos Secções congeladas Fixadores químicos
Aminas biogênicas Solução de Bouin,
formalina tamponada
Glicogênio Fixadores alcoólicos OsO4
Preparação
de lâminas
Coloração
Histo- e
citoquímica
Imuno
Hibridação
Microscopia
de luz
Fluorescência
Contraste
de fase
Eletrônica
9. Métodos de estudo em histologia
Etapas para inclusão
● Processamento:
– Impregnação do tecido: sustentar células e outras estruturas.
● Desidratação:
– Remoção da água para que o material de inclusão seja
perfundido pelo tecido;
– Álcoois etílico, butílico, metílico e isopropílico, a acetona, o
éter, o clorofórmio e o óxido propileno: 70% - 80% - 90% -
100%.
● Diafanização: clarificação
– Xilol, clorofórmio: permite a retirada de água e álcool –
permite que a parafina impregne o tecido.
Preparação
de lâminas
Coloração
Histo- e
citoquímica
Imuno
Hibridação
Microscopia
de luz
Fluorescência
Contraste
de fase
Eletrônica
10. Métodos de estudo em histologia
Inclusão
● Retirada total do diafanizador e penetração do
meio de inclusão nos vazios deixados pela água
e gordura.
● Preparação para o corte:
– Endurece o tecido – consistência adequada para o
corte.
● Meios de inclusão: OCT, TBS (congelamento),
parafina, celoidina, epóxi
Preparação
de lâminas
Coloração
Histo- e
citoquímica
Imuno
Hibridação
Microscopia
de luz
Fluorescência
Contraste
de fase
Eletrônica
11. Métodos de estudo em histologia
Microtomia
●
Micrótomo para parafina: Secções
5-20 µm
●
Vibrátomo: Material sem inclusão e
a fresco, >30 µm
●
Micrótomo de congelamento:
Material congelado, >30 µm
●
Criostato: Material congelado, 10-
40 µm
●
Ultramicrótomo: Material incluído
em resina, > 1 nm
Preparação
de lâminas
Coloração
Histo- e
citoquímica
Imuno
Hibridação
Microscopia
de luz
Fluorescência
Contraste
de fase
Eletrônica
12. Métodos de estudo em histologia
Micrótomo para parafina
Preparação
de lâminas
Coloração
Histo- e
citoquímica
Imuno
Hibridação
Microscopia
de luz
Fluorescência
Contraste
de fase
Eletrônica
http://webs.uvigo.es/mmegias/6-tecnicas/
13. Métodos de estudo em histologia
Vibrátomo
Preparação
de lâminas
Coloração
Histo- e
citoquímica
Imuno
Hibridação
Microscopia
de luz
Fluorescência
Contraste
de fase
Eletrônica
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14. Métodos de estudo em histologia
Cortes a frio
Preparação
de lâminas
Coloração
Histo- e
citoquímica
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Hibridação
Microscopia
de luz
Fluorescência
Contraste
de fase
Eletrônica
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15. Métodos de estudo em histologia
Coloração para microscopia de luz
●
Técnica tintorial utilizada para facilitar o estudo dos tecidos
sobre a microscopia;
● Os tecidos não corados têm pouca diferenciação óptica;
● A maioria dos corantes se comporta como compostos ácidos
ou básicos:
– Basófilos: se coram bem com corantes básicos;
– Acidófilos: se coram bem com corantes ácidos
Preparação
de lâminas
Coloração
Histo- e
citoquímica
Imuno
Hibridação
Microscopia
de luz
Fluorescência
Contraste
de fase
Eletrônica
16. Métodos de estudo em histologia
Preparação
de lâminas
Coloração
Histo- e
citoquímica
Imuno
Hibridação
Microscopia
de luz
Fluorescência
Contraste
de fase
Eletrônica
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17. Métodos de estudo em histologia
Coloração para microscopia de luz
Básicos:
Azul de toluidina
Azul de metileno
Hematoxilina
Ácidos:
Orange G
Fucsina ácida
Eosina
Ácidos nucléicos
Glicosaminoglicanas
Glicoproteínas ácidas
Mitocôndrias
Grânulos de secreção
Proteínas citoplasmáticas
Colágeno
Preparação
de lâminas
Coloração
Histo- e
citoquímica
Imuno
Hibridação
Microscopia
de luz
Fluorescência
Contraste
de fase
Eletrônica
18. Métodos de estudo em histologia
Principais corantes biológicos –
Uso geral
Preparação
de lâminas
Coloração
Histo- e
citoquímica
Imuno
Hibridação
Microscopia
de luz
Fluorescência
Contraste
de fase
Eletrônica
●
Hematoxilina
– Uso geral quando pareada com
eosina
– Núcleo: Laranja, ciano ou verde
– Citoplasma: Azul, marrom ou preto
– Ácidos nucléicos: azul; RE: azul
●
Eosina
– Uso geral quando pareada com
hematoxilina
– Citoplasma: Rosa
– Hemácias: Laranja ou rosa
– Fibras colágenas, reticulares ou
elásticas: Rosa
●
Azul de toluidina
– Núcleo: Azul
– Citoplasma: Azul
– Hemácias: Azul
– Fibras colágeas: Azul
– Grânulos de mastócitos:
Púrpura
19. Métodos de estudo em histologia
Preparação
de lâminas
Coloração
Histo- e
citoquímica
Imuno
Hibridação
Microscopia
de luz
Fluorescência
Contraste
de fase
Eletrônica
Principais corantes biológicos -
Tricrômios
●
Tricrômio de Masson
– Tecido conectivo
– Núcleo: Preto
– Citoplasma: Vermelho ou rosa
– Hemácias: Vermelho
– Fibras colágenas: Azul ou verde
– Cartilagem: Azul/verde; Músculo: Vermelho
●
Tricrômio de Mallory
– Tecido conectivo
– Núcleo: Vermelho
– Citoplasma: Vermelho claro
– Hemácias: Laranja
– Fibras colágenas: Azul escuro
– Queratina: laranja; cartilagem: azul: matriz
óssea: azul escuro
● AZAN de Heidenhain
– Distinção de células e componente
extracelulares
– Núcleo: Azul ou preto
– Citoplasma: Rosa
– Hemácias: Vermelho
– Fibras colágenas: Azul
– Fibras musculares: Vermelho; cartilagem:
azul; matriz óssea: azul
22. Métodos de estudo em histologia
Contraste de ultrafinos
Preparação
de lâminas
Coloração
Histo- e
citoquímica
Imuno
Hibridação
Microscopia
de luz
Fluorescência
Contraste
de fase
Eletrônica
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23. Métodos de estudo em histologia
Montagem
● Depois de corados – montagem:
– Soluções crescentes de álcool – remoção da água. A
desidratação aumenta a sobrevida do preparado;
● Banho em xilol ou bálsamo do Canadá;
● Coloca-se uma gota do meio de montagem o corte;
● Revestimento com lâmínula;
● Vedação.
Preparação
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Coloração
Histo- e
citoquímica
Imuno
Hibridação
Microscopia
de luz
Fluorescência
Contraste
de fase
Eletrônica
24. Métodos de estudo em histologia
Histo- e citoquímica
●
Métodos usados para localizar estruturas celulares
ou moléculas usando atividade enzimática
●
Procedimentos geralmente realizados sobre tecido
não-fixado ou com pouca fixação
●
Secção em criostato ou vibrátomo para evitar
efeito do calor ou da parafina sobre atv. enzimática
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de lâminas
Coloração
Histo- e
citoquímica
Imuno
Hibridação
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de luz
Fluorescência
Contraste
de fase
Eletrônica
25. Métodos de estudo em histologia
Outros usos
● Fosfatases: Quebram a ligação entre PO4
- e um álcool
em moléculas fosforiladas
●
Desidrogenases: Transferem H de um substrato a
outro. Utilizado para identificar mitocôndrias.
●
Peroxidases: Promovem a oxidação de 3,3'-
diaminobenzidina (DAB). Usado principalmente para
marcar outras proteínas em IHQ.
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Microscopia
de luz
Fluorescência
Contraste
de fase
Eletrônica
26. Métodos de estudo em histologia
IHC e IHQ
●
Exploram interação anticorpo-antígeno para
localizar proteínas específicas que não tenham
necessariamente atividade enzimática
●
A reação pode ser revelada usando anticorpos
conjugados com enzimas (p. ex., AP e HRP) com
fluoróforos.
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de lâminas
Coloração
Histo- e
citoquímica
Imuno
Hibridação
Microscopia
de luz
Fluorescência
Contraste
de fase
Eletrônica
27. Métodos de estudo em histologia
Hibridização in situ
Preparação
de lâminas
Coloração
Histo- e
citoquímica
Imuno
Hibridação
Microscopia
de luz
Fluorescência
Contraste
de fase
Eletrônica
●
Usada para determinar a presença de uma
sequência de DNA ou mRNA
●
Útil principalmente na ausência de anticorpos
específicos
●
Ferramenta essencial para diagnósticos
patológicos, principalmente câncer
28. Métodos de estudo em histologia
Hibridação in situ
Preparação
de lâminas
Coloração
Histo- e
citoquímica
Imuno
Hibridação
Microscopia
de luz
Fluorescência
Contraste
de fase
Eletrônica
29. Métodos de estudo em histologia
Preparação
de lâminas
Coloração
Histo- e
citoquímica
Imuno
Hibridação
Microscopia
de luz
Fluorescência
Contraste
de fase
Eletrônica
30. Métodos de estudo em histologia
Preparação
de lâminas
Coloração
Histo- e
citoquímica
Imuno
Hibridação
Microscopia
de luz
Fluorescência
Contraste
de fase
Eletrônica
31. Métodos de estudo em histologia
Preparação
de lâminas
Coloração
Histo- e
citoquímica
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Microscopia
de luz
Fluorescência
Contraste
de fase
Eletrônica
32. Métodos de estudo em histologia
Microscopia de fluorescência
Preparação
de lâminas
Coloração
Histo- e
citoquímica
Imuno
Hibridação
Microscopia
de luz
Fluorescência
Contraste
de fase
Eletrônica
http://zeiss-campus.magnet.fsu.edu/articles/basics/fluorescence.html
33. Métodos de estudo em histologia
Preparação
de lâminas
Coloração
Histo- e
citoquímica
Imuno
Hibridação
Microscopia
de luz
Fluorescência
Contraste
de fase
Eletrônica
34. Métodos de estudo em histologia
Compostos fluorescentes
●
DAPI e Hoechst: Azul; liga-se ao DNA
●
Faloidina: Liga-se a filamentos de actina
●
Fluoresceína, FITC, Texas Red: Fluoróforos, normalmente
conjugados a anticorpos
●
Proteínas fluorescentes (GFP,dsRed)
●
Moléculas autofluorescentes: NAD(P)H, colágeno, triptofano,
lipofuscina
Preparação
de lâminas
Coloração
Histo- e
citoquímica
Imuno
Hibridação
Microscopia
de luz
Fluorescência
Contraste
de fase
Eletrônica
35. Métodos de estudo em histologia
Compostos fluorescentes
Preparação
de lâminas
Coloração
Histo- e
citoquímica
Imuno
Hibridação
Microscopia
de luz
Fluorescência
Contraste
de fase
Eletrônica
"FluorescentCells" by http://rsb.info.nih.gov/ij/images/. Licensed under Public Domain via Wikimedia
Commons -
https://commons.wikimedia.org/wiki/File:FluorescentCells.jpg#mediaviewer/File:FluorescentCells.jpg
36. Métodos de estudo em histologia
Microscopia de contraste de fase
● Explora pequenas alterações no comprimento
do trajeto óptico para revelar materiais de
índices refrativos diferentes
●
Utilizada para observar células em cultura,
microorganismos, e fatias finas de tecido
Preparação
de lâminas
Coloração
Histo- e
citoquímica
Imuno
Hibridação
Microscopia
de luz
Fluorescência
Contraste
de fase
Eletrônica
37. Métodos de estudo em histologia
Microscopia de contraste de fase
Preparação
de lâminas
Coloração
Histo- e
citoquímica
Imuno
Hibridação
Microscopia
de luz
Fluorescência
Contraste
de fase
Eletrônica
38. Métodos de estudo em histologia
Microscopia eletrônica
Preparação
de lâminas
Coloração
Histo- e
citoquímica
Imuno
Hibridação
Microscopia
de luz
Fluorescência
Contraste
de fase
Eletrônica
39. Métodos de estudo em histologia
Preparação
de lâminas
Coloração
Histo- e
citoquímica
Imuno
Hibridação
Microscopia
de luz
Fluorescência
Contraste
de fase
Eletrônica