O documento descreve a técnica de imunohistoquímica, incluindo seus princípios, vantagens, desvantagens e aplicações. A imunohistoquímica combina técnicas histológicas, imunológicas e bioquímicas para identificar antígenos em amostras biológicas através da reação com anticorpos específicos.

1. UNIVERSIDADE FEDERAL DA BAHIA
INSTITUTO DE CIÊNCIAS DA SAÚDE – ICS
DEPARTAMENTO DE BIOINTERAÇÃO
DISCIPLINA: IMUNOLOGIA I – ICS 045
Trabalho realizado pela Doutoranda de Imunologia da UFBA Patrícia Meira, sob
orientação dos Professores Robert Schaer, Roberto Meyer, Claudia Brodskin e
Ricardo Portela. Atualizado em Fevereiro de 2010.

3. • A imunohistoquímica combina técnicas histológicas,
imunológicas e bioquímicas objetivando identificar
componentes celulares ou tissulares (denominados
antígenos) através da reação com anticorpos específicos, em
uma secção histológica, esfregaço ou suspensão celular.
• A denominação imunohistoquímica é habitualmente
utilizada para a avaliação de fragmentos tissulares.
Imunocitoquímica, por sua vez, se refere à avaliação a nível
celular.

4. • Essa técnica imunológica possibilita visualizar distribuição e
localização de componentes celulares específicos na
célula/tecido. Para tal, o antígeno deve permanecer
insolúvel e sua estrutura terciária deve estar preservada,
permitindo a ligação com o anticorpo.

5. o Vantagens
• Custo baixo a moderado.
• Alta sensibilidade e especificidade.
• Permite a análise de 1 ou múltiplos antígenos
simultaneamente.
• Possibilidade de detecção e localização de proteínas
intracelulares, bem como do tráfego intracelular. Para
essa finalidade, as membranas celulares são solubilizadas
com Triton.
• É possível analisar 1 antígeno particular em vários tecidos
em uma mesma lâmina.
• Aplicável a células vivas.
• Padronização e realização simples.
• Necessidade de pequenas quantidades de tecido.

6. o Desvantagens
• Necessidade de mão de obra especializada.
• Processamento demorado da amostra.
• Não automação.
• Preparações não permanentes.
• Técnicas especiais para fixação e inclusão de tecidos para
imunohistoquímica nem sempre estão presentes.
• Necessidade de microscopia especializada (quando
usando fluorocromos).
• Variabilidade do resultado conforme a leitura realizada
pelo observador na imunohistoquímica por fluorescência.

8. • O anticorpo de detecção, antígeno-específico, é marcado
com uma substância fluorescente, elemento radioativo, ouro
coloidal ou enzima.
• As amostras são, então, incubadas com substratos
enzimáticos (quando Ac está marcado com enzima),
produzindo um produto que sofre precipitação direta no
corte histológico, gerando uma coloração castanha ou
vermelha, que reflete a distribuição do antígeno alvo no
tecido/célula analisado.

9. • A reação é feita em lâminas de microscopia e a observação é
realizada em microscópio óptico comum ou fluorescente.
• Frequentemente o anticorpo de detecção é biotinilado
(conjugado com biotina, uma vitamina com alta afinidade
por estreptoavidina) nos ensaios enzimáticos. Essa
metodologia serve para ampliar o sinal gerado, tornando o
método mais sensível.

10. Fluorocromo Excitação (nm) Emissão (nm) Coloração
DAPI 365 420 Azul
Fluoresceína (FITC) 495 525 Verde
Hoechts 33258 360 470 Azul
R-ficocianina 555, 618 634 Vermelha
B-ficoeritrina 545, 565 575 Laranja, vermelha
R-ficoeritrina 480, 545, 565 578 Laranja, vermelha
Rodamina (TRICT) 552 570 Vermelha
Texas red 596 620 Vermelha

11. Enzima Cromógeno Cor do produto final
Peroxidase
horseradish
3-amino-9-etilcarbazol Vermelho
4-cloro-1-naftol Azul
Reagente Hanker-Yates Azul escuro
Pironina alfa-naftol Vermelho púrpura
Fosfatase alcalina Naftol-AS-BI-Fosfato / Nova
Fucsina (NABP/NF)
Vermelho intensao
Bromocloroindolil Fosfato /
Tetrazolina Nitro Azul
(BCIP/NBT)
Púrpura escuro
intenso
Beta-D-galactosidase
derivada de bactéria
5-bromo-4-cloro-3 indolil beta-
D-galactopiranosídeo (BCIG)
Azul intenso

13. Slide 3 of 23
Secções Histológicas
Recuperação Antigência
Bloqueio Enzima Endógena
Anticorpo Secundário
Anticorpo Primário
Observação (Microscopia)
Bloqueio Background
Substrato Cromógeno
Counterstain
Montagem

14. • O preparo da amostra a ser analisada deve seguir as etapas
normais das histotécnicas habituais:
1) Colheita da amostra biológica.
2) Preservação por fixação ou congelamento em nitrogênio
líquido.
• Fixadores: formaldeído 4 a 10%, paraformaldeído 4%,
periodato-lisina-paraformaldeído (PLP), glutaraldeído,
Carnoy (etanol:clorofórmio:ácido acético glacial 7:2:1)
etc.

15. 3) Desidratação
É realizada com álcool absoluto.
4) Clareamento
Para tal, é utilizado o xilol.
Os efeitos lesivos causados pelo uso do xilol podem ser
revertidos por tripsina.
5) Inclusão em blocos de parafina
A temperatura não deve ultrapassar 60 °C.
6) Obter secções em micrótomo e re-hidratar com xilol e álcool
em diferentes concentrações.

16. Células (pellet) Células em monocamada
Secções tissulares com vários
tipos celulares e componentes
da matriz extracelular

17. o A fixação nas técnicas histológicas rotineiras utiliza
formalina, que pode mascarar alguns epítopos antigênicos,
fazer ligação cruzada ou destruí-los. Por esse motivo, torna-
se necessário realizar o desmascaramento, facilitando o
acesso do anticorpo ao epítopo alvo. A recuperação
antigênica pode ser feita por diversas técnicas:
• Digestão enzimática proteolítica: tripsina, quimotripsina,
pepsina, proteinase K.
• Pelo calor: microondas, banho-maria, panela de pressão.
• Forma combinada: digestão enzimática + calor.

18. o Normalmente ocorre atividade de peroxidase em hemácias,
granulócitos, hepatócitos, sistema nervoso central e tecidos
sensíveis a estrogênio.
o As peroxidases endógenas, citocromo oxidase e catalase
produzem produtos de reação com a diaminobenzidina
(DAB), sendo necessário o bloqueio das mesmas com:
• Peróxido de hidrogênio (0,3-0,5%) em metanol.
• Azida sódica (0,1%) em H2O2 (0,3%).

19. o Isoenzimas de fosfatase alcalina são encontradas na mucosa
intestinal, túbulos proximais renais, regiões calcificadas,
superfície de células endoteliais arteriais e capilares,
neutrófilos, linfócitos, etc.
o O bloqueio da fosfatase alcalina é realizado com:
• Levamizole 1-5mmol/L adicionado na solução substrato
da enzima.
o A fosfatase ácida é encontrada em muitos tecidos e células
como próstata, medula óssea, hemácias e plaquetas. Para o
bloqueio desta enzima (não afetada pelo levamizole) é
essencial que o pH da solução do substrato apresente pH ≥
8,0.

20. o A biotina endógena é uma vitamina e coenzima presente em
diversos tecidos, particularmente fígado, pulmão, baço, rins,
tecido adiposo, glândula mamária e cérebro.
o O bloqueio é realizado com:
• Tampões alcalinos.
• Leite desnatado.
• Pré-incubação com avidina.

22. • Método direto.
• Método indireto.
• Método da Peroxidase-Antiperoxidase (PAP).
• Método do Complexo Avidina-Biotina-Peroxidase (ABC).
• Método da Estreptoavidina-Biotina-Peroxidase (ABP).
• Método da Estreptoavidina-Fosfatase Alcalina (SAAP).

24. Antígeno
Tissular/Celular
Anticorpo + Enzima
Substrato

25. Antígeno
Tissular/Celular
Anticorpo primário
Anticorpo secundário
(+ Enzima)
Substrato

26. Antígeno
Tissular/Celular
Anticorpo primário
Anticorpo secundário
Anticorpo anti-peroxidase
Anticorpo terciário conjugado

27. Secções
Parafinizadas
• Desparafinizar antes
do uso.
• Pode necessitar de
recuperação antigênica.
• Bloquear enzimas
endógenas.
Secções
Congeladas
Fixação: ar Fixação: acetona
Bloquear enzimas
endógenas
Incubação Ac primário
Incubação Ac secundário
Incubação Ac terciário

29. • Inativação inadequada de enzimas endógenas.
• Difusão do Ag investigado do local de síntese para o tecido
circundante.
• Presença de Ag em altas concentrações no plasma
perfundindo o tecido anteriormente à sua fixação.
• Injúria física do tecido por dessecação ou fixação
inadequada.
• Autólise.

30. • Pigmentos teciduais coloridos similares ao produto final da
reação.
• Reação cruzada inespecífica do Ac quando o epítopo do Ag a
ser corado é partilhado com outras proteínas.
• Ingestão do Ag por fagócitos, resultando em coloração não
normalmente observada nessas células.

32. o A imunohistoquímica pode ser utilizada:
• Em neoplasias
• Diferenciar uma proliferação celular maligna e
benigna.
• Diagnóstico histogenético de neoplasias
morfologicamente indiferenciadas.
• Subtipagem de neoplasia para seleção terapêutica.
• Caracterização de produtos de secreção de células
neoplásicas (ex: hormônios).

33. o A imunohistoquímica pode ser utilizada:
• Em neoplasias
• Caracterizar a origem de carcinomas.
• Identificar micrometástases.
• Avaliação prognóstica (ex: detecção de receptores
hormonais em neoplasia mamária).
• Orientação terapêutica.

34. o A imunohistoquímica pode ser utilizada:
• Para detecção de antígenos:
• Virais: dengue, febre amarela, citomagalovírus,
adenovírus, etc.
• Bacterianos: micobactérias, leptospiras.
• De Fungos: Paracoccidioides, Histoplasma, etc.
• De Protozoários: Toxoplasma, Trypanosoma cruzi,
Leishmania sp, Plamodium sp.
• De Helmintos: Schistosoma.

35. Imunohistoquímica para CD68
em região de infarto
isquêmico em córtex cerebral:
identificação de macrófagos
no centro necrótico
Imunohistoquímica para GFAP em
região de infarto isquêmico em
córtex cerebral: ausência de
astrócitos no centro necrótico e
gliose na periferia
GAFP = Proteína glial ácida fibrilar

36. Imunohistoquímica anti- ERB2
Imunohistoquímica anti-
tirosina hidroxilase em
estrutura axonal

37. Imunohistoquímica: detecção
de múltiplos antígenos