Tecnicas de microscopia

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Tecnicas de microscopia

  1. 1. Universidade Estadual de Feira de Santana Departamento de Ciências Biológicas Disciplina: PROTISTAS FOTOSSINTETIZANTES TÉCNICAS DE MICROSCOPIA 1. MICROSCÓPIO ÓPTICO O microscópio, de uma maneira geral, compõem-se de duas partes: a mecânica e a óptica. Parte Mecânica: Braço - preso à base; estrutura rígida que suporte o canhão, platina, condensador e a fonte luminosa; Canhão - tubo onde se dispõem as partes ópticas de ampliação, geralmente possuindo movimento vertical; Revolver - peça giratória, onde se conectam as objetivas, permitindo a mudança das mesmas; Platina - mesa de trabalho, onde se coloca a lâmina para exame; Chariot- dispositivo preso à platina, destinado a movimentar a lâmina em exame; Parafuso Macrométrico - destinado a deslocar verticalmente o canhão, aproximando ou afastando as objetivas da lâmina em observação. Serve para a localização grosseira; Parafuso Micrométrico - têm a mesma função da macrométrica, porém serve para a localização fina. Parte óptica: Sistema de Iluminação: Fonte luminosa; Diafragma íris - localiza-se abaixo do condensador, destinando-se a aumentar ou restringir o feixe luminoso; Condensador - preso à parte inferior da platina, o condensador converge à luz em direção à preparação. Sistema de Ampliação: Objetivas - sistema óptico conectado ao revolver, fornece imagem real, aumentada, do material; Oculares - sistema óptico encaixado no extremo superior do canhão, ampliando a imagem fornecia pelas objetivas. 1.2 UTILIZAÇÃO E CUIDADOS COM O MICROSCÓPIO Transporte - segurar o braço com uma das mãos e apoiar a base com a outra, mantendo o aparelho na posição vertical, para evitar que partes ópticas se soltem e caiam. Choques devem ser evitados para que os sistemas ópticos não saiam de concordância. Manter o aparelho sempre limpo e evitando poeira, pois esta é inimiga dos instrumentos ópticos. Iluminação - pode ser regulada aproximando ou afastando o condensador de platina e abrindo ou fechando o diafragma, sempre observando através da ocular. Deve-se regular constantemente a luz, adaptando-a para preparações mais opacas ou mais transparentes. Focalização - girando o revolver, selecionar a objetiva de menor aumento. Caso esteja muito próxima à platina, subir o canhão, empregando o parafuso macrométrico. Colocar a preparação (lâmina) sobre a platina. Olhando por fora do aparelho, baixa-se à objetiva bem próxima à preparação. Em seguida, olhando pela ocular e empregando o parafuso macrométrico, sobe-se o canhão até observar uma imagem mais ou menos nítida. Por fim, utilizando-se o parafuso micrométrico, faz-se à localização fina. Deve-se manter o parafuso micrométrico próximo a metade do seu curso a fim de permitir movimentos livres para cima e para baixo. 2. MICROSCÓPIO ESTEREOSCÓPICO (LUPA)
  2. 2. A lupa é utilizada constantemente para materiais muito grandes ou muito opacos para serem observados ao microscópio. É utilizada ainda na preparação de material para observação ao microscópio, como por exemplo, realização de cortes, dissociação de tecidos, localização de estruturas, etc. Possui um sistema de iluminação inferior, principalmente para materiais mais transparentes e outro de iluminação superior, para materiais opacos. Os mesmos cuidados descritos para o microscópio devem ser tomados com a lupa e, em especial, não fazer preparações diretamente sobre a platina, mas sim sobre lâmina de vidro ou papel vegetal. 3. PREPARAÇÃO DO MATERIAL 3.1. Confecção de Cortes: A microscopia óptica só permite a observação de objetos transparentes ou translúcidos; logo, exige materiais cortados em secções finas para permitir a transmissão da luz. Os cortes podem ser feitos com auxílio de micrótomo (geralmente para preparação de lâminas permanentes) ou de lâminas de barbear novas (lâminas semipermanentes ou de curta duração). Materiais resistentes podem ser segurados com os dedos polegar e indicador e, materiais delicados, podem ser presos em um suporte macio e homogêneo, como medula de imbaúba, isopor, etc. Bons cortes podem ser obtidos colocando-se o material sobre papel vegetal e observando este à lupa. Após prender este como dedo indicador, secionar com gilete nova (manter um ângulo de 30 graus em relação ao material) fazendo movimentos contínuos e suaves com a mesma, sobre o material. Os cortes selecionados podem ser removidos com um pincel e colocados sobre a lâmina com água ou álcool 70%. Normalmente, para se obter um bom corte é necessário fazer vários, selecionando apenas os melhores. 3.2. Montagem das Lâminas O material para exame deve ser montado em lâminas de vidro especiais para microscopia e recoberto com lamínula, também de vidro. A lâmina deve estar limpa, sendo um bom critério para avaliar sua limpeza, colocar uma gota de água sobre a mesma. Se a gota se espalhar, tendendo a ocupar ampla superfície, a lâmina pode ser considerado limpa, caso contrário deve ser novamente lavada. As lâminas podem ser lavadas com detergente e guardadas em álcool 70%. A preparação deve ser feita colocando uma gota do meio de montagem sobre a lâmina, com auxilio de um estilete, pinça ou pincel. Se necessário, dissocia-se o material com dois estiletes, observando-se à lupa. Cobre-se a preparação com a lamínula, tomando cuidado para evitar bolhas de ar. O excesso de líquido de montagem, que extravasa pelos bordos da lamínula deve ser retirado com papel absorvente, evitando-se que a platina do microscópio se molhe. A substituição de um líquido de montagem por outro, por exemplo, um corante, pode ser feito sem a remoção da lamínula. Para isso, coloca-se uma gota do novo líquido sobre a lâmina, junto ao bordo da lamínula. Do outro lado de lamínula encosta-se um pedaço de papel de filtro que por capilaridade promoverá a substituição. Preparações semipermanentes são feitas evitando-se a evaporação do líquido de montagem. Neste coso é importante empregar como líquido de montagem um fechado (formol a 4%) para evitar a decomposição do material. A vedação da lamínula pode ser feita com esmalte de unha incolor. Para isso a lâmina e a face superior de lamínula devem estar bem limpas e secas. Uma preparação em lâmina pode ser mantida, ainda, por curtos períodos (uma semana ou menos) em uma câmara úmida feita com placa de Petri, especialmente quando o líquido de montagem for glicerina a 30%. Uma boa lâmina, onde se faz uma boa observação, deve apresentar as seguintes características:
  3. 3. • Isenta de bolhas de ar; • Conter pequena quantidade de material, pois as preparações muitos densas impedem a passagem de luz; • Ter líquido em toda extensão entre a lâmina e lamínula; • A lamínula não deve estar flutuando (o excesso de líquido pode ser retirado com papel absorvente); • Nunca deve haver líquido sob a lâmina. A platina não deve ser molha. 4. ILUSTRAÇÃO Selecionar as partes e estruturas para documentar o estudo, iniciando pelo aspecto geral, em observação macroscópica em lupa e finalmente ao microscópio. Neste último, inicia-se com a objetiva de menor aumento, passando-se para aumentos maiores conforme o que se pretende observar. As legendas nunca devem faltar e devem ser indicadas por meio de traços bem visíveis e cuja extremidade se localize sobre a estrutura correspondente. 5. SOLUÇÕES FIXADORAS E CORANTES EMPREGADOS EM ESTUDOS DE ALGAS Solução de Formalina (1 litro): Formol P.A.................... 40 ml + Água destilada ............ 960ml Solução de Transeau: Formol a 40% 100 ml + Álcool a 96o G. L 300 ml + Água destilada 600 ml Solução de Lugol Acético: Iodo 20 g + KI 20 g + água destilada 200 ml + Acido acéticos 20 g Solução de Karo: É um meio de montagem usado em preparação de lâminas semi-permanentes. Evita o dessecamento do material pela evaporação da água da lâmina. Xarope de açúcar de milho (Karo) 50ml + Água destilada 50ml + 3 cristais de fenol Coloração: consiste em passar o material em soluções de corantes ou reagentes. Assim o material apresentará uma cor ou duas ou mais cores diferentes, ou então apenas algumas estruturas ficarão coradas. Os corantes empregados na aula são: Azul de anilina: corante aquoso que têm afinidade por protéina, corando componentes protéicos em azul. Azul de anilina. 0,05 g + Água destilada 100,0 mL Azul de toluidina : corante aquoso, cora o material de diferentes cores no espectro da côr rosa até azul devido a metacromasia. Azul de toluidina. 0,05g + Água destilada .100,0mL Nos dois casos acima, após a coloração, lavar os cortes em água destilada e posteriormente colocar solução de karo. Para realizar a vedação das bordas da lamínula utilizar esmalte incolor, este procedimento evita a evaporação do meio de montagem. Para evidenciar flagelos e mucilagem das algas utiliza-se o emprego da tinta nanquim, tal procedimento deixa a lâmina fosca e enegrecida permitindo evidenciar tais estruturas.

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