O documento descreve as características básicas da imunohistoquímica, incluindo sua capacidade de identificar antígenos celulares ou teciduais através da reação com anticorpos específicos. Detalha os princípios da técnica, etapas, sistemas usuais e aplicações como diagnóstico de neoplasias e detecção de agentes infecciosos.

1. UNIVERSIDADE FEDERAL DA BAHIA INSTITUTO DE CIÊNCIAS DA SAÚDE – ICSDEPARTAMENTO DE BIOINTERAÇÃODISCIPLINA: IMUNOLOGIA I – ICS 045IMUNOHISTOQUÍMICATrabalho realizado pela Doutoranda de Imunologia da UFBA Patrícia Meira, sob orientação dos Professores Robert Schaer, Roberto Meyer, Claudia Brodskin e Ricardo Portela. Atualizado em Fevereiro de 2010.

2. CARACTERÍSTICAS BÁSICAS

3. CARACTERÍSTICAS BÁSICASA imunohistoquímica combina técnicas histológicas, imunológicas e bioquímicas objetivando identificar componentes celulares ou tissulares (denominados antígenos) através da reação com anticorpos específicos, em uma secção histológica, esfregaço ou suspensão celular.A denominação imunohistoquímica é habitualmente utilizada para a avaliação de fragmentos tissulares. Imunocitoquímica, por sua vez, se refere à avaliação a nível celular.

4. Essa técnica imunológica possibilita visualizar distribuição e localização de componentes celulares específicos na célula/tecido. Para tal, o antígeno deve permanecer insolúvel e sua estrutura terciária deve estar preservada, permitindo a ligação com o anticorpo.CARACTERÍSTICAS BÁSICAS

5. CARACTERÍSTICAS BÁSICASVantagens

6. Custo baixo a moderado.

7. Alta sensibilidade e especificidade.

8. Permite a análise de 1 ou múltiplos antígenos simultaneamente.

9. Possibilidade de detecção e localização de proteínas intracelulares, bem como do tráfego intracelular. Para essa finalidade, as membranas celulares são solubilizadas com Triton.

10. É possível analisar 1 antígeno particular em vários tecidos em uma mesma lâmina.

11. Aplicável a células vivas.

12. Padronização e realização simples.

13. Necessidade de pequenas quantidades de tecido.CARACTERÍSTICAS BÁSICASDesvantagens

14. Necessidade de mão de obra especializada.

15. Processamento demorado da amostra.

16. Não automação.

17. Preparações não permanentes.

18. Técnicas especiais para fixação e inclusão de tecidos para imunohistoquímica nem sempre estão presentes.

19. Necessidade de microscopia especializada (quando usando fluorocromos).

20. Variabilidade do resultado conforme a leitura realizada pelo observador na imunohistoquímica por fluorescência.PRINCÍPIOS

21. PRINCÍPIO DA TÉCNICAO anticorpo de detecção, antígeno-específico, é marcado com uma substância fluorescente, elemento radioativo, ouro coloidal ou enzima. As amostras são, então, incubadas com substratos enzimáticos (quando Ac está marcado com enzima), produzindo um produto que sofre precipitação direta no corte histológico, gerando uma coloração castanha ou vermelha, que reflete a distribuição do antígeno alvo no tecido/célula analisado.

22. PRINCÍPIO DA TÉCNICAA reação é feita em lâminas de microscopia e a observação é realizada em microscópio óptico comum ou fluorescente.Frequentemente o anticorpo de detecção é biotinilado (conjugado com biotina, uma vitamina com alta afinidade por estreptoavidina) nos ensaios enzimáticos. Essa metodologia serve para ampliar o sinal gerado, tornando o método mais sensível.

23. PROPRIEDADES DOS FLUOROCROMOS

24. ENZIMAS E SEUS CROMÓGENOS

25. PASSOS DA TÉCNICA

26. Secções HistológicasRecuperação AntigênciaBloqueio Enzima EndógenaBloqueio BackgroundAnticorpo Primário Anticorpo SecundárioSubstrato CromógenoCounterstainMontagemObservação (Microscopia)Slide 3 of 23PASSOS DA TÉCNICA

27. O preparo da amostra a ser analisada deve seguir as etapas normais das histotécnicas habituais:1) Colheita da amostra biológica.2) Preservação por fixação ou congelamento em nitrogênio líquido.Fixadores: formaldeído 4 a 10%, paraformaldeído 4%, periodato-lisina-paraformaldeído (PLP), glutaraldeído, Carnoy (etanol:clorofórmio:ácido acético glacial 7:2:1) etc.PREPARO DA AMOSTRA

28. PREPARO DA AMOSTRA3) Desidratação É realizada com álcool absoluto.4) Clareamento Para tal, é utilizado o xilol. Os efeitos lesivos causados pelo uso do xilol podem ser revertidos por tripsina.5) Inclusão em blocos de parafina A temperatura não deve ultrapassar 60 °C.6) Obter secções em micrótomo e re-hidratar com xilol e álcool em diferentes concentrações.

29. AMOSTRASCélulas (pellet)Células em monocamadaSecções tissulares com vários tipos celulares e componentes da matriz extracelular

30. A fixação nas técnicas histológicas rotineiras utiliza formalina, que pode mascarar alguns epítopos antigênicos, fazer ligação cruzada ou destruí-los. Por esse motivo, torna-se necessário realizar o desmascaramento, facilitando o acesso do anticorpo ao epítopo alvo. A recuperação antigênica pode ser feita por diversas técnicas:

31. Digestão enzimática proteolítica: tripsina, quimotripsina, pepsina, proteinase K.

32. Pelo calor: microondas, banho-maria, panela de pressão.

33. Forma combinada: digestão enzimática + calor.RECUPERAÇÃO ANTIGÊNICA

34. BLOQUEIO DE ENZIMA ENDÓGENA PEROXIDASENormalmente ocorre atividade de peroxidase em hemácias, granulócitos, hepatócitos, sistema nervoso central e tecidos sensíveis a estrogênio.

35. As peroxidases endógenas, citocromo oxidase e catalase produzem produtos de reação com a diaminobenzidina (DAB), sendo necessário o bloqueio das mesmas com:

36. Peróxido de hidrogênio (0,3-0,5%) em metanol.

37. Azida sódica (0,1%) em H2O2 (0,3%).BLOQUEIO DE ENZIMA ENDÓGENA FOSFATASEIsoenzimas de fosfatase alcalina são encontradas na mucosa intestinal, túbulos proximais renais, regiões calcificadas, superfície de células endoteliais arteriais e capilares, neutrófilos, linfócitos, etc.