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Microscópio, Técnicas de Observação e
de Coloração de Células
Prof. Hamilton Felix Nobrega
Aula 02   Microscopio de Luz e Técnicas de Observação e Coloração
Aula 02   Microscopio de Luz e Técnicas de Observação e Coloração
 Quais as teorias sobre a origem da vida?
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 Para uma adequada observação das células ao microscópio, é fundamental a
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 Polarização  Fluorescência
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 Microscópio eletrônico de transmissão (MET)
 Microscópio eletrônico de varredura (MEV)
2)
Formado por:
 Fonte luminosa → luz branca
(lâmpada com filamento de
tungstênio)
 Óptica → lentes
ampliação
condensação
 Mecânica
 Sistema de iluminação
Fonte de luz → Lentes
O posicionamento estratégico das lentes no microscópio
proporcionam a formação de uma imagem Invertida
 Fonte luminosa: Trajeto da luz
 Fonte luminosa:
Trajeto da luz
Também chamados de
microscópios fotônicos, os
microscópios ópticos possuem
três conjuntos principais de
lentes ópticas, fabricadas em
vidro ou cristal.
 Óptica
Um dos conjuntos é o condensador, cujas lentes tem a função
de concentrar os raios luminosos que atravessam o objeto em
observação.
Outro conjunto são as lentes objetivas, as mais importantes ao
microscópio, responsáveis pela formação a imagem.
Outro conjunto são as lentes objetivas, as mais importantes ao
microscópio, responsáveis pela formação a imagem.
4x = Vermelha
10x = Amarela
40x = Azul claro
100x = Preta/ branca
O terceiro conjunto é composto pelas lentes oculares, que
ficam próximas ao olho do observador e na qual se projetam as
imagens.
A luz, após ser concentrada no
condensador, atravessa o objeto em
observação, passa pelas lentes da
objetiva e da ocular e chega ao olho
do observador como uma imagem
ampliada.
Multiplicando o aumento fornecido pela objetiva, calculamos o valor
final de observação.
Por exemplo: Se empregarmos uma ocular de 10x e uma objetiva
de 40x, o valor final da ampliação será de 400x.
Aula 02   Microscopio de Luz e Técnicas de Observação e Coloração
Os microscópios modernos fornecem aumentos médios entre 100x
e 1.500x. Se um objeto que mede 0,01mm de diâmetro (invisível ao
olho nu) for ampliado 1.000x, sua imagem ampliada terá 10mm
(1cm) e poderá ser visualizada.
Poder de Resolução (PR): “Capacidade de uma lente (ou
do próprio microscópio) em formar imagens com
detalhes mínimos”
Limite de Resolução (LR): “Menor distância entre 2 pontos
distintos do objeto, que poderão ser individualizados na
imagem final”
Mecânica Função
Base Serve de apoio
Parafuso
micrométrico
Permite movimentos verticais lentos de pequena amplitude da platina
para focagem
Parafuso
macrométrico
Permite movimentos verticais de grande amplitude da platina para
focagem
Revólver Suporte das lentes objetivas, permite trocar a lente objetiva rodando
sobre um eixo
Braço fixo à base, serve de suporte às lentes e à platina
Canhão Suporta a ocular na extremidade superior
Platina Base de suporte e fixação da preparação, tem uma abertura central
(sobre a qual é colocada a preparação) que deixa passar a luz.
Pinça Ajudam a fixar a preparação
Charriot Peça que permite movimentar a lâmina sobre a platina.
Lâmpada Emite o feixe luminoso
Aula 02   Microscopio de Luz e Técnicas de Observação e Coloração
Estudo de capilares
 Médicos rejeitaram a microscopia;
 Descrições sobre capilares eram
falsas;
Marcello Malpighi
(1628-1694)
“ Nossa opinião é que a anatomia
de uma estrutura sumamente
pequena, interna de uma víscera,
que foi exaltada nestes tempos, é
de uso a nenhum médico”
Os primeiros que estudaram as células,
notaram que elas eram preenchidas por
um líquido viscoso que foi denominado
citoplasma.
Nas células vegetais sempre se
observava um envoltório bem definido, a
parede celular.
Deduziram então, que as células animais
também tivessem algum tipo de
envoltório, o qual chamaram de
membrana plasmática.
O microscópio confirmou que havia essa finíssima camada envolvendo o
citoplasma.
Os primeiros que estudaram as células,
notaram que elas eram preenchidas por
um líquido viscoso que foi denominado
citoplasma.
Nas células vegetais sempre se
observava um envoltório bem definido, a
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Deduziram então, que as células animais
também tivessem algum tipo de
envoltório, o qual chamaram de
membrana plasmática.
O microscópio confirmou que havia essa finíssima camada envolvendo o
citoplasma.
Tempos depois, Robert Brown, em suas
observações ao microscópio, lançou a
hipótese de que a estrutura ovóide que
havia no interior das células, era um
componente importante e fundamental,
o qual ele chamou de núcleo.
Desde então, os biólogos passaram a
admitir que todas as células tem três
partes fundamentais: membrana,
citoplasma e núcleo.
Com o desenvolvimento de
novas tecnologias microscópicas,
descobriu-se que o citoplasma
contém diversas estruturas, além
do núcleo.
Descobriu-se também que as
bactérias e arqueas
(procariontes) não possuem um
núcleo e são estruturalmente
mais simples que as demais
células.
Como podemos observar, a
criação do microscópio foi um
marco nos estudos sobre as
células.
Para ser observado ao microscópio, o material biológico precisa
ser a uma série de procedimentos, denominados de técnicas
citológicas.
Há diversas técnicas de preparação de amostras de acordo com
o material a ser estudado e do tipo de análise que se deseja
obter.
Geralmente são colocados
sobre uma placa de vidro
retangular - a lâmina - e
cobertos por uma placa de
vidro bem fina - a lamínula.
 Observação in vivo (exame a fresco)
Técnica relativamente simples. O material biológico é colocado
sobre a lâmina e observado.
Utilizada frequentemente para se observar células vegetais vivas.
 Fixação das células
Técnica utilizada para evidenciar detalhes internos das células.
Nesse caso, o material tem que passar por diferentes tratamentos
antes de ser observado.
Geralmente o primeiro tratamento é a fixação, que consiste em
matar rapidamente as células, preservando o máximo de sua
estrutura interna.
Para obter esse efeito, costuma-se mergulhar as células em
líquidos fixadores (formol, ácido acético, etc)
 Coloração das células
As estruturas celulares mesmo fixadas, apresentam baixo
contraste.
Técnicas de realce das estruturas foram desenvolvidas, através da
coloração de certas estruturas celulares.
Após fixadas, as células são mergulhadas em corantes
citológicos. Os corantes tem afinidade por certas estruturas da
célula.
Após a coloração, a amostra é lavada e observada ao microscópio.
As estruturas coradas destacam-se das demais, permitindo a sua
visualização.
 Fixação e coloração das células
 Coloração das células
Uma técnica bem comum é a coloração com hematoxilina (azul-
arroxeado) e eosina (alaranjado).
Hematoxilina tema afinidade com o núcleo
celular e pouca afinidade com o
citoplasma.
A eosina tem grande afinidade pelo
citoplasma celular.
• Também é possível observar células a fresco com
coloração.
Corantes especiais
como o azul de
metileno penetram na
célula e evidenciam
suas estruturas sem
matá-la.
 Esfregaço
Técnica utilizada para material biológico com células isoladas ou
pouco unidas entre si.
Evita que células
fiquem empilhadas e
permite observá-las
isoladamente.
 Esmagamento
Técnica utilizada para células frouxamente associadas, como as
partes moles de tecidos vegetais e animais.
O material geralmente já fixado e corado é colocado entre uma
lâmina e uma lamínula de vidro e esmagado pela pressão suave do
dedo polegar.
Em alguns casos, pode-se
aquecer previamente o material
para que as células se separem
com mais facilidade.
 Corte manual
Quando o material biológico
tem células firmemente
unidas entre si, é
necessário cortá-lo em
fatias bem finas,
denominadas:
Cortes histológicos
 Inclusão e corte com micrótomo
O estudo microscópico detalhado das células requer que elas
sejam cortadas em fatias muito finas. Por isso, são submetidas a
tratamentos e procedimentos que facilitam o corte.
O mais comum é chamado de inclusão. Neste, o material é
mergulhado é uma substância líquida que depois endurece,
preenchendo-o e envolvendo-o completamente.
A substância mais comumente utilizada é a parafina. Quando o
material fica solidificado dentro do molde, pode ser cortado em
fatias bem finas, com uso do micrótomo.
Aula 02   Microscopio de Luz e Técnicas de Observação e Coloração
 Inclusão e corte com micrótomo
 Inclusão e corte com micrótomo
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 Fracionamento celular por centrifugação
Essa técnica envolve a maceração das células e sua
homogeneização. Em seguida, o homogeneizado celular é
submetido a centrifugação.
De acordo com a velocidade de aceleração da centrifugação,
determinadas partes da célula são separadas. Por exemplo, os
núcleos celulares são separados a uma força de 600 g.
O líquido sobrenadante é colocado novamente para centrifugar
para separação de outras organelas, a outra velocidade. As
mitocôndrias, por exemplo, são separadas a 20.000 g
 Fracionamento celular por centrifugação
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Aula 02 Microscopio de Luz e Técnicas de Observação e Coloração

  • 1. Microscópio, Técnicas de Observação e de Coloração de Células Prof. Hamilton Felix Nobrega
  • 4.  Quais as teorias sobre a origem da vida?  Qual a teoria mais aceita sobre o surgimento da vida?  Como surgiu a Biologia?  Quais as duas hipóteses sobre a origem das primeiras células?  A quem se dá o crédito pela criação do primeiro microscópio?  Quem utilizou o microscópio para observar micro-organismos pela primeira vez?  Qual o cientista famosos pela criação do método de esterilização?  O que é célula e porque recebeu esse nome?  O que diz a teoria celular?  Como surgiu os laboratórios de análises clínicas?  Para uma adequada observação das células ao microscópio, é fundamental a aplicação de algumas técnicas biológicas específicas. Que técnicas são essas?
  • 6.  Principal instrumento da Biologia Celular e Histologia • De luz (ML) / óptico (campo claro) Modificado (variações) com propósitos especiais  Contraste de fase  Invertido  Polarização  Fluorescência • Eletrônico (ME) - imagens mais aumentadas / feixe de elétrons  Microscópio eletrônico de transmissão (MET)  Microscópio eletrônico de varredura (MEV) 2)
  • 7. Formado por:  Fonte luminosa → luz branca (lâmpada com filamento de tungstênio)  Óptica → lentes ampliação condensação  Mecânica  Sistema de iluminação
  • 8. Fonte de luz → Lentes O posicionamento estratégico das lentes no microscópio proporcionam a formação de uma imagem Invertida  Fonte luminosa: Trajeto da luz
  • 10. Também chamados de microscópios fotônicos, os microscópios ópticos possuem três conjuntos principais de lentes ópticas, fabricadas em vidro ou cristal.  Óptica
  • 11. Um dos conjuntos é o condensador, cujas lentes tem a função de concentrar os raios luminosos que atravessam o objeto em observação.
  • 12. Outro conjunto são as lentes objetivas, as mais importantes ao microscópio, responsáveis pela formação a imagem.
  • 13. Outro conjunto são as lentes objetivas, as mais importantes ao microscópio, responsáveis pela formação a imagem. 4x = Vermelha 10x = Amarela 40x = Azul claro 100x = Preta/ branca
  • 14. O terceiro conjunto é composto pelas lentes oculares, que ficam próximas ao olho do observador e na qual se projetam as imagens.
  • 15. A luz, após ser concentrada no condensador, atravessa o objeto em observação, passa pelas lentes da objetiva e da ocular e chega ao olho do observador como uma imagem ampliada. Multiplicando o aumento fornecido pela objetiva, calculamos o valor final de observação. Por exemplo: Se empregarmos uma ocular de 10x e uma objetiva de 40x, o valor final da ampliação será de 400x.
  • 17. Os microscópios modernos fornecem aumentos médios entre 100x e 1.500x. Se um objeto que mede 0,01mm de diâmetro (invisível ao olho nu) for ampliado 1.000x, sua imagem ampliada terá 10mm (1cm) e poderá ser visualizada.
  • 18. Poder de Resolução (PR): “Capacidade de uma lente (ou do próprio microscópio) em formar imagens com detalhes mínimos” Limite de Resolução (LR): “Menor distância entre 2 pontos distintos do objeto, que poderão ser individualizados na imagem final”
  • 19. Mecânica Função Base Serve de apoio Parafuso micrométrico Permite movimentos verticais lentos de pequena amplitude da platina para focagem Parafuso macrométrico Permite movimentos verticais de grande amplitude da platina para focagem Revólver Suporte das lentes objetivas, permite trocar a lente objetiva rodando sobre um eixo Braço fixo à base, serve de suporte às lentes e à platina Canhão Suporta a ocular na extremidade superior Platina Base de suporte e fixação da preparação, tem uma abertura central (sobre a qual é colocada a preparação) que deixa passar a luz. Pinça Ajudam a fixar a preparação Charriot Peça que permite movimentar a lâmina sobre a platina. Lâmpada Emite o feixe luminoso
  • 21. Estudo de capilares  Médicos rejeitaram a microscopia;  Descrições sobre capilares eram falsas; Marcello Malpighi (1628-1694) “ Nossa opinião é que a anatomia de uma estrutura sumamente pequena, interna de uma víscera, que foi exaltada nestes tempos, é de uso a nenhum médico”
  • 22. Os primeiros que estudaram as células, notaram que elas eram preenchidas por um líquido viscoso que foi denominado citoplasma. Nas células vegetais sempre se observava um envoltório bem definido, a parede celular. Deduziram então, que as células animais também tivessem algum tipo de envoltório, o qual chamaram de membrana plasmática. O microscópio confirmou que havia essa finíssima camada envolvendo o citoplasma.
  • 23. Os primeiros que estudaram as células, notaram que elas eram preenchidas por um líquido viscoso que foi denominado citoplasma. Nas células vegetais sempre se observava um envoltório bem definido, a parede celular. Deduziram então, que as células animais também tivessem algum tipo de envoltório, o qual chamaram de membrana plasmática. O microscópio confirmou que havia essa finíssima camada envolvendo o citoplasma.
  • 24. Tempos depois, Robert Brown, em suas observações ao microscópio, lançou a hipótese de que a estrutura ovóide que havia no interior das células, era um componente importante e fundamental, o qual ele chamou de núcleo. Desde então, os biólogos passaram a admitir que todas as células tem três partes fundamentais: membrana, citoplasma e núcleo.
  • 25. Com o desenvolvimento de novas tecnologias microscópicas, descobriu-se que o citoplasma contém diversas estruturas, além do núcleo. Descobriu-se também que as bactérias e arqueas (procariontes) não possuem um núcleo e são estruturalmente mais simples que as demais células.
  • 26. Como podemos observar, a criação do microscópio foi um marco nos estudos sobre as células.
  • 27. Para ser observado ao microscópio, o material biológico precisa ser a uma série de procedimentos, denominados de técnicas citológicas. Há diversas técnicas de preparação de amostras de acordo com o material a ser estudado e do tipo de análise que se deseja obter. Geralmente são colocados sobre uma placa de vidro retangular - a lâmina - e cobertos por uma placa de vidro bem fina - a lamínula.
  • 28.  Observação in vivo (exame a fresco) Técnica relativamente simples. O material biológico é colocado sobre a lâmina e observado. Utilizada frequentemente para se observar células vegetais vivas.
  • 29.  Fixação das células Técnica utilizada para evidenciar detalhes internos das células. Nesse caso, o material tem que passar por diferentes tratamentos antes de ser observado. Geralmente o primeiro tratamento é a fixação, que consiste em matar rapidamente as células, preservando o máximo de sua estrutura interna. Para obter esse efeito, costuma-se mergulhar as células em líquidos fixadores (formol, ácido acético, etc)
  • 30.  Coloração das células As estruturas celulares mesmo fixadas, apresentam baixo contraste. Técnicas de realce das estruturas foram desenvolvidas, através da coloração de certas estruturas celulares. Após fixadas, as células são mergulhadas em corantes citológicos. Os corantes tem afinidade por certas estruturas da célula. Após a coloração, a amostra é lavada e observada ao microscópio. As estruturas coradas destacam-se das demais, permitindo a sua visualização.
  • 31.  Fixação e coloração das células
  • 32.  Coloração das células Uma técnica bem comum é a coloração com hematoxilina (azul- arroxeado) e eosina (alaranjado). Hematoxilina tema afinidade com o núcleo celular e pouca afinidade com o citoplasma. A eosina tem grande afinidade pelo citoplasma celular.
  • 33. • Também é possível observar células a fresco com coloração. Corantes especiais como o azul de metileno penetram na célula e evidenciam suas estruturas sem matá-la.
  • 34.  Esfregaço Técnica utilizada para material biológico com células isoladas ou pouco unidas entre si. Evita que células fiquem empilhadas e permite observá-las isoladamente.
  • 35.  Esmagamento Técnica utilizada para células frouxamente associadas, como as partes moles de tecidos vegetais e animais. O material geralmente já fixado e corado é colocado entre uma lâmina e uma lamínula de vidro e esmagado pela pressão suave do dedo polegar. Em alguns casos, pode-se aquecer previamente o material para que as células se separem com mais facilidade.
  • 36.  Corte manual Quando o material biológico tem células firmemente unidas entre si, é necessário cortá-lo em fatias bem finas, denominadas: Cortes histológicos
  • 37.  Inclusão e corte com micrótomo O estudo microscópico detalhado das células requer que elas sejam cortadas em fatias muito finas. Por isso, são submetidas a tratamentos e procedimentos que facilitam o corte. O mais comum é chamado de inclusão. Neste, o material é mergulhado é uma substância líquida que depois endurece, preenchendo-o e envolvendo-o completamente. A substância mais comumente utilizada é a parafina. Quando o material fica solidificado dentro do molde, pode ser cortado em fatias bem finas, com uso do micrótomo.
  • 39.  Inclusão e corte com micrótomo
  • 40.  Inclusão e corte com micrótomo
  • 41.  Inclusão e corte com micrótomo
  • 42.  Fracionamento celular por centrifugação Essa técnica envolve a maceração das células e sua homogeneização. Em seguida, o homogeneizado celular é submetido a centrifugação. De acordo com a velocidade de aceleração da centrifugação, determinadas partes da célula são separadas. Por exemplo, os núcleos celulares são separados a uma força de 600 g. O líquido sobrenadante é colocado novamente para centrifugar para separação de outras organelas, a outra velocidade. As mitocôndrias, por exemplo, são separadas a 20.000 g
  • 43.  Fracionamento celular por centrifugação