O documento descreve as etapas do processo de preparação de lâminas histológicas, incluindo fixação, desidratação, diafanização, inclusão em parafina, corte no micrótomo, desparafinação, coloração e montagem definitiva para exame ao microscópio óptico. O objetivo é obter cortes finos e transparentes dos tecidos para análise da estrutura celular.

1. Curso com plano próprio de Tecnologias e Segurança Alimentar
Biotecnologias – 12 Ano
Professor: Miguel Lino Silva
PREPARAÇÕES
HISTOLÓGICAS

2. Técnicas Histológicas
Procedimentos de preparação de uma lâmina histológica
definitiva para observação em microscopia ótica.
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3. Técnicas Histológicas
• Visa a preparação dos tecidos destinados à
microscopia de luz.
• O exame ao microscópio é feito geralmente por luz
transmitida (a luz deve atravessar o objeto a ser
examinado).
Assim: é necessária a obtenção de fragmentos dos
tecidos que serão coletados em lâminas muito finas e
transparentes.
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4. Preparação definitiva do tecido para exame microscópico
• Fixação
• Desidratação
• Diafanização
• Inclusão/Impregnação
• Corte: Secções ao micrótomo
• Desparafinação e montagem da lâmina
• Coloração (envolve rehidratação e desidratação)
• Montagem definitivo
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5. Fixação
• Destina-se a preservar as células, evitando as
modificações post mortem, conservando a estrutura
morfológica.
• É necessário estabilizar a estrutura das proteínas.
• Os agentes fixadores mais utilizados são o formol
tamponado e o líquido de Bouin.
Ambos fixam as proteínas evitando a sua degradação.
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6. Fixação
• O fixador mais utilizado é o formol, por ser mais acessível
e de uso simples.
• Contudo, os seus resultados geralmente não são
satisfatórios.
• Por isto, é recomendada a dissolução de formol em
tampão fosfatado (Junqueira e Junqueira, 1983).
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7. Fixação
• Outros fixadores: álcool etílico, ácido acético, ácido
pícrico, líquido de Bouin (solução aquosa saturada
constituída por uma mistura de 75% ácido pícrico, 20% de
formol a 40% e 5% volumes de ácido acético).
• O tempo de fixação dependerá do tamanho do fragmento
do tecido, podendo variar entre 6 e 24h.
• É recomendado que o fragmento não ultrapasse os 3 mm
de espessura.
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8. Desidratação
• Objetivo: retirar a água dos tecidos e substituí-la por
álcool.
• São utilizados álcoois graduados (Ex.: 40%, 60%, 80%,
90%, 100%)
• Este procedimento deve ser cadenciado de modo a evitar
artefactos e distorções causadas pela rápida remoção da
água e substituição pelo álcool.
• Para ME, utiliza-se ainda acetona ou óxido de propileno.
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9. Diafanização (ou clareamento)
• Objetivo: retirar o álcool da peça (as substâncias para
impregnação dissolvem-se mal no álcool) e torná-la
transparente.
• Utiliza substâncias solúveis em álcool e capazes de
eliminá-lo, por exemplo o xilol, toluol, benzol, etc.
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10. Inclusão/Impregnação
• Objetivo: infiltração de substâncias endurecedoras nas
peças.
• Permite a obtenção de cortes extremamente delgados.
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11. Inclusão/Impregnação
• É utilizada: parafina histológica ou resinas plásticas.
• As resinas apresentam resultados mais adequados.
• As peças são mergulhadas em parafina fundida a 60C.
• Coloca-se a peça num molde (ex. molde de Leuckart)
sobre a qual se derrama parafina fundida formando-se
um bloco de parafina.
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12. Inclusão/Impregnação
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13. Corte - Microtomia
• Obtenção de cortes delgados, que permitam a sua
observação aos microscópios de luz ou eletrónico.
• De um modo geral, são obtidos cortes entre 5 e 7
micrómetros (50 a 100 nm para ME).
Micrótomo:
• a sua regulação é efetuada em micrómetros
• permite a obtenção do corte na espessura desejada
• formado por uma lâmina (fixa ou descartável) de aço,
afiada, e um braço ao qual se prende o bloco e que se
desloca verticalmente.
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14. Micrótomo
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15. Micrótomo
Micrótomo (tipo “rotativo”) e operação de corte
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16. Crióstato
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17. Corte - Microtomia
Crióstato – é um micrótomo especial mantido numa câmara a
baixa temperatura.
• O congelamento rápido evita a alteração da estrutura da
célula, eliminando a necessidade de fixação e inclusão do
material.
• Apesar dos fragmentos congeladas evitarem alguns
artefactos, elas sofrem de outro problema:
• as estruturas nativas de moléculas individuais, como
proteínas, são bem preservadas, mas a estrutura fina da
célula é frequentemente destruída pelos cristais de gelo.
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18. Desparafinação e Montagem da lâmina
• As fitas obtidas a partir do micrótomo são transferidas
para um banho-maria (ou placa quente), com o auxílio de
uma pinça, para serem distendidas (ténia).
• A água deve estar entre 3 e 8° C abaixo do ponto de fusão
da parafina utilizada.
• Nesta etapa, são retiradas as dobras e evitadas as bolhas
na fita.
• Após a distensão, os cortes são separados
individualmente ou em grupos, conforme a conveniência,
utilizando lâminas de vidro.
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19. Antes de se efetuar a coloração dos cortes, estes terão que
ser sujeitos a uma desparafinação (remoção da parafina)
que é conseguida mergulhando a lâmina com os cortes em
xilol, tornando-os extremamente transparentes.
• Os cortes obtidos podem ser transferidos, inicialmente,
para uma estufa onde ficam alguns minutos (não mais de
dez).
• Os cortes são colocados num suporte vertical numa estufa
a 60° C para secagem, entre 1 e 24 horas.
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Desparafinação e Montagem da lâmina

20. Coloração
Os corantes mais utilizados nos procedimentos histológicos
são a Hematoxilina e a Eosina.
A Hematoxilina é uma base* (catiónicos) que cora,
preferencialmente, componentes ácidos (aniónicos) das
células num tom azulado escuro.
Como os componentes ácidos mais abundantes são o DNA e
o RNA, tanto o núcleo, como certos locais do citoplasma,
ficam azulados.
Estes componentes são chamados de basófilos.
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21. Coloração
A Eosina é um ácido* (aniónico) que cora as estruturas
básicas (catiónicas) da célula de rosa.
Estas estruturas são abundantes no citoplasma (ex.
mitocôndria) e são chamadas de acidófilas.
NEUTROS - Efeito tintorial sobre as estruturas que não
revelam acidofilia nem basofilia. Ex: Vermelho neutro.
Hematoxilina
Eosina
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22. Coloração
Como a maioria dos corantes são aquosos, antes da
coloração há que hidratar os cortes, ou seja, substituir o xilol
por álcool e, de seguida, uma série crescente de
percentagem de água (decrescente de álcool).
Após a coloração é efetuada a desidratação.
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23. Corantes
Quanto ao papel fisiológico:
VITAIS - Coram a célula sem determinar sua morte.
Ex: Verde-janus B, azul de metileno, vermelho neutro, Sudan III.
NÃO-VITAIS - Determinam a morte celular.
Ex: Hematoxilina, eosina, lugol, vermelho escarlate, violeta de
genciana.
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24. Montagem definitiva
A preparação é coberta com uma lamela, que adere à lâmina
devido à utilização de resinas (ex. bálsamo-do-Canadá).
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25. Técnicas Histológicas
A célula e as técnicas histológicas Biotecnologias –12° Ano
Diafinização

26. Técnicas Histológicas
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e hidratação