O documento descreve os principais métodos de estudo da estrutura celular, incluindo a microscopia óptica e eletrônica, técnicas de separação de organelas como centrifugação e cromatografia, e métodos de coloração para visualização de estruturas celulares.

1. Métodos de estudo da célula

2. Dimensões das
estruturas celulares e
subcelulares
• Célula vegetal: ± 50µm
• Célula animal: ± 10-20µm
• Bactérias: ± 1-2µm
• Vírus: ± 0,05µm• Vírus: ± 0,05µm
• Núcleo: ± 3-6µm
• Mitocôndrias: ± 0,5µm
• Ribossomos: ± 25nm
• Membrana: ± 10nm

3. Como visualizar células e
diferentes estruturas celulares?diferentes estruturas celulares?

4. Métodos de investigação da estrutura
celular
Microscopia óptica (ou microscopia de luz)
Descobrimento da célula e formulação da teoria celular
Técnicas citoquímicasTécnicas citoquímicas
Identificação e localização de diversas moléculas
constituintes das células
Microscopia eletrônica
Grande poder de resolução; detalhes da estrutura celular
Separação de organelas celulares

5. Estudo celular em Microscopia Óptica
MonoMono--ocularocular BinocularBinocular Múltiplos observadoresMúltiplos observadores

6. Constituído de: parte mecânica + parte óptica (Lembra da prática?)
Parte Óptica 3 sistemas de lentes
Condensador projeta a luz sobre as células
Objetiva recebe o cone de luz, projeta uma imagem aumentada
Ocular recebe imagem da objetiva e amplia

8. Limites de Resolução

9. Estudo celular em Microscopia Óptica
• Exames de tecido à fresco
• Exame de tecidos mortos ou preservados
• Problemas• Problemas
– Células transparentes
– Células pequenas e complexas
• Visualização: coloração

10. Estudo celular em Microscopia Óptica
Exames de tecido à fresco
• Corte fino ou transparente para ser posto na
lâmina

11. Estudo celular em Microscopia
Exames de tecido à fresco
• Espalhamento - células de mucosa bucal
azul de metileno

12. Estudo celular em Microscopia
Exames de tecido à fresco
• Esfregaço – células sanguíneas

15. Estudo celular em Microscopia
Exames de tecido à fresco
• Esmagamento – cromossomos e núcleo em
interfase

16. Estudo celular em Microscopia
CORTES HISTOLÓGICOS
• Cortes extremamente finos para permitir a fixação
na lâmina

17. Estudo celular em Microscopia
FIXAÇÃO E PREPARAÇÃO DE CORTES
FIXAÇÃOFIXAÇÃO DEDE TECIDOSTECIDOS
Formol,Formol, GlutaraldeídoGlutaraldeído,, MisturasMisturas fixadorasfixadoras......
PREPARAÇÃOPREPARAÇÃO DEDE CORTESCORTES HISTOLÓGICOSHISTOLÓGICOSPREPARAÇÃOPREPARAÇÃO DEDE CORTESCORTES HISTOLÓGICOSHISTOLÓGICOS
CortesCortes dede tecidotecido
DesidrataçãoDesidratação
DiafanizaçãoDiafanização
InfiltraçãoInfiltração // ImpregnaçãoImpregnação
CortesCortes emem µµmm
ColoraçãoColoração
MontagemMontagem
VisualizaçãoVisualização

19. DesidrataçãoDesidratação DiafanizaçãoDiafanização InfiltraçãoInfiltraçãoFixaçãoFixação
MicrotomiaMicrotomiaColoraçãoColoraçãoMontagemMontagem

20. Fixação - promove a preservação das características
morfológicas e macromoléculas dos tecidos ou
células.
• Função → impedir a autólise ou degradação
bacteriana do material biológico a ser analisado
• Facilitar os processamentos posteriores de
coloração → muitos corantes apresentam maior
afinidade pelo substrato fixado → promover o
enrijecimento dos orgãos e tecidos.
• Aumentar o contraste na microscopia eletrônica

21. Fixadores → agentes químicos das mais diversas
funções orgânicas;
– Reagem quimicamente com os componentes
celulares, promovendo a sua estabilização.
– Principais componentes celulares que podem ser
preservados → proteínas, ácidos nucléicos,
polissacarídeos e lipídios → os fixadores atuam
sobre estas macromoléculas tornando-as insolúveis.

23. • Desidratação → retirada lenta de água
• Bateria de álcool com concentrações crescentes: 70%,
80%, 90% e 100% → o tempo vai depender do material
e do material de inclusão.
• A água deve ser toda retirada por não ser missível em• A água deve ser toda retirada por não ser missível em
XILOL ou em ÓLEO DE CEDRO → diafanização →
clareamento do material
• Inclusão em parafina → dar maior consistência ao
material.

24. • Microtomia → corte do material em micrótomo.

25. Coloração para Microscopia Óptica
• Corantes básicos ou catiônicos (+) - Liga-se a moléculas com carga (-)
BASOFILIA → a estrutura corada é BASÓFILA
Ex: Azul de Metileno, Azul de Toluidina, Hematoxilina, Orceína,
lugol, Verde-janus B, violeta de genciana
Núcleo → DNA e RNANúcleo → DNA e RNA
Citoplasma → proteínas e carboidratos
• Corantes ácidos ou aniônicos (-) - Liga-se a moléculas com carga (+)
ACIDOFILIA → a estrutura corada é ACIDÓFILA
Ex: Eosina, Ácido Periódico Schiff (PAS), ácido ósmico
Citoplasma e núcleo → proteínas com carga (+)
NEUTROS - Efeito tintorial sobre as estruturas que não revelam
acidofilia nem basofilia. Ex: Vermelho neutro.

26. Quanto ao papel fisiológico:
VITAIS - Coram a célula sem determinar sua morte. Ex: Verde-janus B, azul
de metileno, vermelho neutro, Sudan III.
NÃO-VITAIS - Determinam a morte celular. Ex: Hematoxilina, eosina, lugol,
Coloração para Microscopia Óptica
NÃO-VITAIS - Determinam a morte celular. Ex: Hematoxilina, eosina, lugol,
vermelho escarlate, violeta de genciana.
Quanto às propriedades tintoriais:
ORTOCROMÁTICOS - Conferem a célula a mesma cor que apresentam in
vitro. Exemplos: Azul de metileno, verde-janus B, vermelho neutro.
METACROMÁTICOS - Dão a célula coloração diferente da que apresentam
in vitro. Exemplos: Laranja de acridina, tionina, azul de toluidina.

27. Coloração para Microscopia de
Fluorescência
Envolve a aplicação de técnicas
citoquímicas
Reação com anticorpos ou
corantes fluorescentescorantes fluorescentes
Radiação ultravioleta como
equivalente a fonte de luz em
microscopia óptica

31. Microscópio Eletrônico
Potencial de aumento muito
maior que o óptico
Inventado em 1932 e vem
sendo aperfeiçoado desde
entãoentão
Intervalo de aumento
1.000x a 200.000x.
Poder de resolução = 1nm
(200x maior que o MO)

32. Microscópio Eletrônico
• Feixes de elétrons ao invés de luz
(óptica)
No microscópio eletrônico não há
lentes de cristal e sim bobinas,
chamadas de lenteschamadas de lentes
eletromagnéticas;
• As lentes eletromagnéticas
ampliam a imagem gerada pela
passagem do feixe de elétrons no
material e projetam-na sobre uma
tela, onde é formada a imagem

33. Obtenção dos cortes para M.E.
+ solução de sais de
urânio e chumbo

34. • Não é possível observar material vivo neste tipo de
microscópio;
• O material a ser estudado passa por um complexo
processo:
– Desidratação
– Fixação– Fixação
– Inclusão em resinas especiais (muito duras)
– Cortes ultrafinos obtidos através das navalhas de vidro-
ultramicrótomo;

35. A imagem do objeto é formada simultaneamente à passagem
do feixe de luz através dele.
Bastante difundido no estudo de materiais biológicos, permite
definição de imagens intracelulares, permitindo estudos de
morfologia celular, aspectos gerais das organelas e também da
interação de parasitas com células.
•Tipos de microscópios eletrônicos:
–Transmissão – MET - usado para a observação de cortes
ultrafinos;
–Varredura – MEV - capaz de produzir imagens de alta
ampliação usado para a observação de superfícies;

36. Fagocitose
Célula animal

37. Célula vegetal

38. Cloroplasto
Mitocôndrias
Cloroplasto
Complexo de Golgi

39. Um feixe de elétrons
bombardeia a superfície do
material “varrendo-a”;
então, elétrons secundários
ou refletidos são utilizados
para obter imagens
tridimensionais.
Microscopia Eletrônica de Varredura (MEV)Microscopia Eletrônica de Varredura (MEV)
tridimensionais.
Capaz de produzir imagens
de alta ampliação e
resolução aumentos 10x a
400.000x com grande
profundidade de foco
Poder de resolução de
10nm.

40. As imagens fornecidas pelo MEV possuem um caráter
virtual;
O que é visualizado no monitor do aparelho é a
transcodificação da energia emitida pelos elétrons, ao
contrário da radiação de luz
Microscopia Eletrônica de Varredura (MEV)Microscopia Eletrônica de Varredura (MEV)
contrário da radiação de luz
A topografia de objetos sólidos pode ser examinada com
grande facilidade, as micrografias têm aspecto
tridimensional;

41. Ataque de leveduras à Salmonella

43. Diferentes formas de grãos de pólen

45. MEV MET

46. CENTRIFUGAÇÃOCENTRIFUGAÇÃO
PermitePermite isolarisolar organelasorganelas dede homogeneizadoshomogeneizados celulares,celulares, parapara
análisesanálises químicas,químicas, físicasfísicas ee biológicasbiológicas;;
SEPARAÇÃO DE ORGANELAS CELULARESSEPARAÇÃO DE ORGANELAS CELULARES
OO isolamentoisolamento dede umauma organelaorganela dependedepende dede::
-- seuseu coeficientecoeficiente dede sedimentaçãosedimentação;;
-- densidadedensidade ee viscosidadeviscosidade dada soluçãosolução..
CentrifugaçãoCentrifugação FracionadaFracionada;;
CentrifugaçãoCentrifugação ContraContra GradienteGradiente..

47. Para iniciar a purificação, inicialmente é necessário extrair a proteína de interesse
para um meio líquido, exceto se ela já estiver naturalmente presente em um meio
líquido (sangue, suor, água do mar, meio de cultura, seiva de planta, etc).
células
Homogeneização
Material na
fonte
por ultra-som com
detergente
Vários métodos são
possíveis para transformar
células, órgãos, tecidos em
um homogenado, ou extrato
bruto, como mostra a figura.
tecidos
Homogeneização
(para romper tecidos e células)
por pressão
(prensa francesa)
liquefação
(Potter)
Homogenado
ou
Extrato bruto
Material
de
partida

48. Centrifugação FracionadaCentrifugação Fracionada

49. Centrifugação Contra GradienteCentrifugação Contra Gradiente

50. Cromatografia
• Separação de macromoléculas, como proteínas
e ácidos nucléicos
• “Filtragem” de um macerado celular em uma
matriz porosa, por meio da interação das
macromoléculas com a matrizmacromoléculas com a matriz
– Interação de Troca iônica: dependente de cargas
– Interação hidrofóbica
– Filtração em gel: dependente do tamanho e forma
– Interação por afinidade: enzima-substrato ou
antigeno-anticorpo.

51. Cromatografia
Matriz
Tubos coletores

52. CromatografiaCromatografia dede TrocaTroca IônicaIônica
-A matriz da coluna cromatográfica é
carregada + OU –
- Proteínas ligam ao suporte por
interação de carga.

53. CromatografiaCromatografia dede InteraçãoInteração HidrofóbicaHidrofóbica
- A matriz da coluna
cromatográfica é composta por
partículas com superfície
hidrofóbica;
- Proteínas hidrofóbicas
interagem com o suporte e
retardam sua passagem.

54. CromatografiaCromatografia de Filtração em Gelde Filtração em Gel
- A matriz da coluna
cromatográfica é composta por
partículas porosas, atuando
como uma peneira para acomo uma peneira para a
passagem de proteínas;

55. CromatografiaCromatografia dede AfinidadeAfinidade
- A matriz da coluna
cromatográfica é composta por
antígenos (ou substratos para
enzimas) ligados;
- Proteínas ligam ao suporte
por bioafinidade e
especificidade.

56. Eletroforese
DeterminaDetermina oo tamanhotamanho dasdas
proteínasproteínas;;
IdentificaIdentifica fragmentosfragmentos dede
diferentesdiferentes tamanhostamanhos dede
DNADNA clivadoclivado ouou sintetizadosintetizado..DNADNA clivadoclivado ouou sintetizadosintetizado..
SeparaçãoSeparação dasdas
macromoléculasmacromoléculas porpor cargacarga
(+(+ ouou --)) ee tamanhotamanho (do(do
maiormaior parapara oo menor)menor)

58. Proteínas de diferentes
tamanhos e cargas
Fragmentos de DNA de
diferentes tamanhos

59. -- HibridizaçãoHibridização exex situsitu

60. Resumindo... Existem diversas formas
de se explorar a célula:
Ponto de vista morfológico: Microscopia
óptica fluorescência
eletrônica (transmissão e varredura)
Ponto de vista das organelas e seus constituintes:Ponto de vista das organelas e seus constituintes:
Centrifugação: isolamento de organelas
fracionada e com gradiente
Cromatografia: isolamento de macromoléculas
Troca iônica Interação hidrofóbica
Filtração em gel Afinidade
Eletroforese: análise das macromoléculas