Este documento descreve as características básicas da imunofluorescência, incluindo os tipos de reações (direta e indireta), fluorocromos utilizados e aplicações em medicina humana e veterinária. A imunofluorescência permite a detecção e localização de antígenos e anticorpos em amostras biológicas usando anticorpos ou antígenos marcados com fluorocromos, que emitem luz visível quando excitados por luz ultravioleta no microscópio de fluorescência.

1. UNIVERSIDADE FEDERAL DA BAHIA INSTITUTO DE CIÊNCIAS DA SAÚDE – ICSDEPARTAMENTO DE BIOINTERAÇÃODISCIPLINA: IMUNOLOGIA I – ICS 045IMUNOFLUORESCÊNCIATrabalho realizado pela Acadêmica de Medicina Veterinária da UFBA Aretha Alves Borges da Silva sob orientação dos Professores Robert Schaer, Roberto Meyer, Claudia Brodskin e Ricardo Portela. Atualizado em Fevereiro de 2010.

2. CARACTERÍSTICAS BÁSICAS

3. CARACTERÍSTICAS BÁSICAS A imunofluorescência permite a detecção e localização de antígenosemcélulas e tecidosutilizandoanticorposespecíficos, marcados com fluorocromos, de modoque a localização dos antígenos se tornavisívelaomicroscópio de fluorescência.

4. De acordo com o mesmoprincípio, podemosdetectar e localizaranticorposemfluidosbiológicosusandoseuantígenocorrespondente.CARACTERÍSTICAS BÁSICASBaseia-se nacapacidade das moléculas de anticorpo se ligaremcovalentemente a fluorocromossemperdersuareatividadeespecífica com o antígeno.

5. Testequalitativo/semi-quantitativo.

6. Método de altasensibilidade e altaespecificidade.CARACTERÍSTICAS BÁSICAS FLUOROCROMOS:

7. Nos testes de imunofluorescência são empregados conjugados constituídos de anticorpos ligados covalentemente a moléculas reveladoras denominadas fluorocromos.

8. 1941: primeira vez que anticorpos foram conjugados com fluorocromos.

9. Fluorocromos são substâncias que absorvem luz ultravioleta e emitem luz visível, ou seja, ficam fluorescentes.CARACTERÍSTICAS BÁSICAS FLUOROCROMOS:

10. São utilizados vários fluorocromos diferentes nos laboratórios clínicos para imunofluorescência.

11. Isotionato de fluoresceína e compostos da rodamina são os fluorocromos mais usados para conjugação com anticorpos para torná-los fluorescentes sob condições adequadas de iluminação.CARACTERÍSTICAS BÁSICAS MICROSCÓPIO DE EPIFLUORESCÊNCIA:

12. A reação imunofluorescente que é desencadeada no microscópio de epifluorescência ocorre através da emissão de luz de cor quando o fóton é excitado por luz de curto comprimento de onda (UV).

13. Para deixar passar somente a emissão secundária desejada, devem-se utilizar filtros apropriados dependendo da cor do fluorocromo.

14. CARACTERÍSTICAS BÁSICAS TIPOS DE REAÇÃO:Detecção de AgDetecção de AgDetecção de AcINDIRETADIRETA

15. IMUNOFLUORESCÊNCIA DIRETA (IFD)

16. IMUNOFLUORESCÊNCIA DIRETA (IFD)YO anticorpo específico marcado com Fluorocromo (conjugado) é adicionado e se fixa ao antígeno, formando um imunocomplexo estável. YYYYYO anticorpo não ligado é removido por lavagens.O preparado é observado em microscópio de fluorescência.Antígeno pesquisadoYConjugado

17. IMUNOFLUORESCÊNCIA DIRETA (IFD)VANTAGENS

18. Alta especificidade e sensibilidade

19. Possibilidade de detecção de proteínas intracelulares e de sua localização.

20. DESVANTAGENS

21. Alto custo do microscópio de fluorescência

22. Necessidade de um conjugadoparacadaantígenoque se desejaidentificaroulocalizar

23. SubjetividadedaleituraIMUNOFLUORESCÊNCIA DIRETA (IFD) APLICAÇÕES

24. Detecção direta de microrganismos em secreções, na urina, nas fezes, em cortes de tecidos etc. Também é utilizada na fenotipagem de células tumorais.

25. Embacteriologia, um dos poucosmétodos de IFD aindausadosemlaboratóriaclínico é a identificação do Streptococcus do grupo A.IMUNOFLUORESCÊNCIA INDIRETA (IFI)

26. IMUNOFLUORESCÊNCIA INDIRETA (IFI)PARA A PESQUISA DE ANTÍGENOSIncuba-se a célula ou tecido em que se quer pesquisar o antígeno com o anticorpo específico obtido em animal ou um monoclonal, levando à formação de um imunocomplexo. YYYYYYRealiza-se lavagem para retirada do anticorpo não ligante excedente.A preparação é incubada com um conjugado antiimunoglobulina, marcado com fluorocromo, produzido em outra espécie de animal. Antígeno pesquisadoYYYYYConjugadoO preparado é observado em microscópio de fluorescência.YAnticorpo Monoclonal

27. IMUNOFLUORESCÊNCIA INDIRETA (IFI)PARA A PESQUISA DE ANTICORPOSAntígenos padronizados são fixados a lâminas de vidro. O soro do paciente é diluído, colocado sobre o antígeno e incubado para permitir a formação do complexo antígeno-anticorpo. YYYYYYRealizam-se lavagens para a retirada dos anticorpos não ligados. A preparação é incubada com o conjugado fluorescente e, se houver anticorpo no soro, o conjugado reage com o anticorpo específico para o antígeno. Antígeno padronizadoYConjugadoObserva-se o preparado em microscópio de fluorescência. YYYYYAnticorpo pesquisado

28. IMUNOFLUORESCÊNCIA INDIRETA (IFI) VANTAGENS

29. Sensibilidade

30. Especificidade

31. Reprodutibilidade

32. De simples padronização e execução

33. O mesmo conjugado pode ser usado em sistemas diferentes

34. Para determinar as classes e subclasses de anticorpos são utilizados conjugados específicos

35. DESVANTAGENS

36. Necessidade de microscópio de fluorescência

37. Subjetividade na leitura

38. Não-automaçãoIMUNOFLUORESCÊNCIA INDIRETA (IFI)APLICAÇÕES

39. Medicina humana

40. Diagnóstico sorológico de várias doenças infecciosas como a Doença de Chagas, a SIDA/AIDS, as hepatites e complexos em doenças auto-imunes.

41. Medicina Veterinária

42. Toxoplasmose, Neosporose, Raiva, Campilobacteriose Genital Bovina.CONSIDERAÇÕES FINAISAs técnicas de imunofluorescência ainda são empregadas na rotina laboratorial, mas estão sendo gradativamente substituídas por testes imunoenzimáticos, principalmente devido à necessidade de microscopia, subjetividade de leitura e impossibilidade de automação.