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Imunofluorescencia
O documento descreve as técnicas de imunofluorescência direta e indireta, que permitem detectar e localizar antígenos e anticorpos marcando-os com fluorocromos. Essas técnicas são qualitativas e semi-quantitativas, de alta sensibilidade e especificidade, e são usadas no diagnóstico de doenças infecciosas em medicina humana e veterinária.
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- 1. UNIVERSIDADE FEDERAL DABAHIA INSTITUTO DE CIÊNCIAS DA SAÚDE – ICS DEPARTAMENTO DE BIOINTERAÇÃO DISCIPLINA: IMUNOLOGIA I – ICS 045 Trabalho realizado pela Acadêmica de Medicina Veterinária da UFBA Aretha Alves Borges da Silva sob orientação dos Professores Robert Schaer, Roberto Meyer, Claudia Brodskin e Ricardo Portela. Atualizado em Fevereiro de 2010.
- 3. • A imunofluorescênciapermite a detecção e localização de antígenos em células e tecidos utilizando anticorpos específicos, marcados com fluorocromos, de modo que a localização dos antígenos se torna visível ao microscópio de fluorescência. • De acordo com o mesmo princípio, podemos detectar e localizar anticorpos em fluidos biológicos usando seu antígeno correspondente.
- 4. • Baseia-se nacapacidade das moléculas de anticorpo se ligarem covalentemente a fluorocromos sem perder sua reatividade específica com o antígeno. • Teste qualitativo/semi-quantitativo. • Método de alta sensibilidade e alta especificidade.
- 5. o FLUOROCROMOS: • Nostestes de imunofluorescência são empregados conjugados constituídos de anticorpos ligados covalentemente a moléculas reveladoras denominadas fluorocromos. • 1941: primeira vez que anticorpos foram conjugados com fluorocromos. • Fluorocromos são substâncias que absorvem luz ultravioleta e emitem luz visível, ou seja, ficam fluorescentes.
- 6. o FLUOROCROMOS: •São utilizadosvários fluorocromos diferentes nos laboratórios clínicos para imunofluorescência. •Isotionato de fluoresceína e compostos da rodamina são os fluorocromos mais usados para conjugação com anticorpos para torná-los fluorescentes sob condições adequadas de iluminação.
- 7. o MICROSCÓPIO DEEPIFLUORESCÊNCIA: • A reação imunofluorescente que é desencadeada no microscópio de epifluorescência ocorre através da emissão de luz de cor quando o fóton é excitado por luz de curto comprimento de onda (UV). • Para deixar passar somente a emissão secundária desejada, devem-se utilizar filtros apropriados dependendo da cor do fluorocromo.
- 8. DIRETA INDIRETA Detecção deAg Detecção de AcDetecção de Ag o TIPOS DE REAÇÃO:
- 10. O anticorpo específicomarcado com Fluorocromo (conjugado) é adicionado e se fixa ao antígeno, formando um imunocomplexo estável. O anticorpo não ligado é removido por lavagens. O preparado é observado em microscópio de fluorescência. Y Y Y Y Y Y Y Antígeno pesquisado Conjugado
- 11. o VANTAGENS • Altaespecificidade e sensibilidade • Possibilidade de detecção de proteínas intracelulares e de sua localização. o DESVANTAGENS • Alto custo do microscópio de fluorescência • Necessidade de um conjugado para cada antígeno que se deseja identificar ou localizar • Subjetividade da leitura
- 12. o APLICAÇÕES • Detecçãodireta de microrganismos em secreções, na urina, nas fezes, em cortes de tecidos etc. Também é utilizada na fenotipagem de células tumorais. • Em bacteriologia, um dos poucos métodos de IFD ainda usados em laboratória clínico é a identificação do Streptococcus do grupo A.
- 14. PARA A PESQUISADE ANTÍGENOS Incuba-se a célula ou tecido em que se quer pesquisar o antígeno com o anticorpo específico obtido em animal ou um monoclonal, levando à formação de um imunocomplexo. Realiza-se lavagem para retirada do anticorpo não ligante excedente. O preparado é observado em microscópio de fluorescência. YY YYYY A preparação é incubada com um conjugado antiimunoglobulina, marcado com fluorocromo, produzido em outra espécie de animal. Y Y YY Antígeno pesquisado Conjugado Anticorpo Monoclonal Y Y
- 15. Antígenos padronizados sãofixados a lâminas de vidro. PARA A PESQUISA DE ANTICORPOS Realizam-se lavagens para a retirada dos anticorpos não ligados. O soro do paciente é diluído, colocado sobre o antígeno e incubado para permitir a formação do complexo antígeno-anticorpo. A preparação é incubada com o conjugado fluorescente e, se houver anticorpo no soro, o conjugado reage com o anticorpo específico para o antígeno. Observa-se o preparado em microscópio de fluorescência. YYY Y Y Y YY YY Antígeno padronizado Conjugado Anticorpo pesquisado Y Y
- 16. o VANTAGENS • Sensibilidade •Especificidade • Reprodutibilidade • De simples padronização e execução • O mesmo conjugado pode ser usado em sistemas diferentes • Para determinar as classes e subclasses de anticorpos são utilizados conjugados específicos o DESVANTAGENS • Necessidade de microscópio de fluorescência • Subjetividade na leitura • Não-automação
- 17. o APLICAÇÕES • Medicinahumana • Diagnóstico sorológico de várias doenças infecciosas como a Doença de Chagas, a SIDA/AIDS, as hepatites e complexos em doenças auto-imunes. • Medicina Veterinária • Toxoplasmose, Neosporose, Raiva, Campilobacteriose Genital Bovina.
- 18. As técnicas deimunofluorescência ainda são empregadas na rotina laboratorial, mas estão sendo gradativamente substituídas por testes imunoenzimáticos, principalmente devido à necessidade de microscopia, subjetividade de leitura e impossibilidade de automação.