O documento descreve as técnicas de imunofluorescência direta e indireta, que permitem detectar e localizar antígenos e anticorpos marcando-os com fluorocromos. Essas técnicas são qualitativas e semi-quantitativas, de alta sensibilidade e especificidade, e são usadas no diagnóstico de doenças infecciosas em medicina humana e veterinária.

1. UNIVERSIDADE FEDERAL DA BAHIA
INSTITUTO DE CIÊNCIAS DA SAÚDE – ICS
DEPARTAMENTO DE BIOINTERAÇÃO
DISCIPLINA: IMUNOLOGIA I – ICS 045
Trabalho realizado pela Acadêmica de Medicina Veterinária da UFBA Aretha Alves
Borges da Silva sob orientação dos Professores Robert Schaer, Roberto Meyer,
Claudia Brodskin e Ricardo Portela. Atualizado em Fevereiro de 2010.

3. • A imunofluorescência permite a detecção e localização de
antígenos em células e tecidos utilizando anticorpos
específicos, marcados com fluorocromos, de modo que a
localização dos antígenos se torna visível ao microscópio de
fluorescência.
• De acordo com o mesmo princípio, podemos detectar e
localizar anticorpos em fluidos biológicos usando seu antígeno
correspondente.

4. • Baseia-se na capacidade das moléculas de anticorpo
se ligarem covalentemente a fluorocromos sem perder
sua reatividade específica com o antígeno.
• Teste qualitativo/semi-quantitativo.
• Método de alta sensibilidade e alta especificidade.

5. o FLUOROCROMOS:
• Nos testes de imunofluorescência são empregados conjugados
constituídos de anticorpos ligados covalentemente a moléculas
reveladoras denominadas fluorocromos.
• 1941: primeira vez que anticorpos foram conjugados com
fluorocromos.
• Fluorocromos são substâncias que absorvem luz ultravioleta e
emitem luz visível, ou seja, ficam fluorescentes.

6. o FLUOROCROMOS:
•São utilizados vários fluorocromos diferentes nos laboratórios
clínicos para imunofluorescência.
•Isotionato de fluoresceína e compostos da rodamina são os
fluorocromos mais usados para conjugação com anticorpos para
torná-los fluorescentes sob condições adequadas de iluminação.

7. o MICROSCÓPIO DE EPIFLUORESCÊNCIA:
• A reação imunofluorescente que é desencadeada no
microscópio de epifluorescência ocorre através da emissão
de luz de cor quando o fóton é excitado por luz de curto
comprimento de onda (UV).
• Para deixar passar somente a emissão
secundária desejada, devem-se utilizar filtros
apropriados dependendo da cor
do fluorocromo.

8. DIRETA INDIRETA
Detecção de Ag Detecção de AcDetecção de Ag
o TIPOS DE REAÇÃO:

10. O anticorpo específico marcado com
Fluorocromo (conjugado) é adicionado
e se fixa ao antígeno, formando um
imunocomplexo estável.
O anticorpo não ligado é removido por
lavagens.
O preparado é observado em microscópio
de fluorescência.
Y Y
Y
Y
Y
Y
Y
Antígeno pesquisado
Conjugado

11. o VANTAGENS
• Alta especificidade e sensibilidade
• Possibilidade de detecção de proteínas intracelulares e de sua
localização.
o DESVANTAGENS
• Alto custo do microscópio de fluorescência
• Necessidade de um conjugado para cada antígeno que se deseja
identificar ou localizar
• Subjetividade da leitura

12. o APLICAÇÕES
• Detecção direta de microrganismos em secreções, na urina, nas fezes,
em cortes de tecidos etc. Também é utilizada na fenotipagem de células
tumorais.
• Em bacteriologia, um dos poucos métodos de IFD ainda usados em
laboratória clínico é a identificação do Streptococcus do grupo A.

14. PARA A PESQUISA DE ANTÍGENOS
Incuba-se a célula ou tecido em que se
quer pesquisar o antígeno com o
anticorpo específico obtido em animal
ou um monoclonal, levando à formação
de um imunocomplexo.
Realiza-se lavagem para retirada do
anticorpo não ligante excedente.
O preparado é observado em microscópio
de fluorescência.
YY
YYYY
A preparação é incubada com um
conjugado antiimunoglobulina, marcado
com fluorocromo, produzido em outra
espécie de animal.
Y Y YY
Antígeno pesquisado
Conjugado
Anticorpo Monoclonal
Y
Y

15. Antígenos padronizados são fixados a
lâminas de vidro.
PARA A PESQUISA DE ANTICORPOS
Realizam-se lavagens para a retirada
dos anticorpos não ligados.
O soro do paciente é diluído, colocado
sobre o antígeno e incubado para
permitir a formação do complexo
antígeno-anticorpo.
A preparação é incubada com o
conjugado fluorescente e, se houver
anticorpo no soro, o conjugado reage
com o anticorpo específico para o
antígeno.
Observa-se o preparado em microscópio
de fluorescência.
YYY
Y
Y
Y
YY YY
Antígeno padronizado
Conjugado
Anticorpo pesquisado
Y
Y

16. o VANTAGENS
• Sensibilidade
• Especificidade
• Reprodutibilidade
• De simples padronização e execução
• O mesmo conjugado pode ser usado em sistemas diferentes
• Para determinar as classes e subclasses de anticorpos são utilizados
conjugados específicos
o DESVANTAGENS
• Necessidade de microscópio de fluorescência
• Subjetividade na leitura
• Não-automação

17. o APLICAÇÕES
• Medicina humana
• Diagnóstico sorológico de várias doenças infecciosas
como a Doença de Chagas, a SIDA/AIDS, as hepatites e
complexos em doenças auto-imunes.
• Medicina Veterinária
• Toxoplasmose, Neosporose, Raiva, Campilobacteriose Genital
Bovina.

18. As técnicas de imunofluorescência ainda são
empregadas na rotina laboratorial, mas estão sendo
gradativamente substituídas por testes
imunoenzimáticos, principalmente devido à
necessidade de microscopia, subjetividade de leitura
e impossibilidade de automação.