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UNIVERSIDADE FEDERAL DA BAHIA
INSTITUTO DE CIÊNCIAS DA SAÚDE – ICS
DEPARTAMENTO DE BIOINTERAÇÃO
DISCIPLINA: IMUNOLOGIA I – ICS 045
Trabalho realizado pela Acadêmica de Medicina Veterinária da UFBA Aretha Alves
Borges da Silva sob orientação dos Professores Robert Schaer, Roberto Meyer,
Claudia Brodskin e Ricardo Portela. Atualizado em Fevereiro de 2010.
• A imunofluorescência permite a detecção e localização de
antígenos em células e tecidos utilizando anticorpos
específicos, marcados com fluorocromos, de modo que a
localização dos antígenos se torna visível ao microscópio de
fluorescência.
• De acordo com o mesmo princípio, podemos detectar e
localizar anticorpos em fluidos biológicos usando seu antígeno
correspondente.
• Baseia-se na capacidade das moléculas de anticorpo
se ligarem covalentemente a fluorocromos sem perder
sua reatividade específica com o antígeno.
• Teste qualitativo/semi-quantitativo.
• Método de alta sensibilidade e alta especificidade.
o FLUOROCROMOS:
• Nos testes de imunofluorescência são empregados conjugados
constituídos de anticorpos ligados covalentemente a moléculas
reveladoras denominadas fluorocromos.
• 1941: primeira vez que anticorpos foram conjugados com
fluorocromos.
• Fluorocromos são substâncias que absorvem luz ultravioleta e
emitem luz visível, ou seja, ficam fluorescentes.
o FLUOROCROMOS:
•São utilizados vários fluorocromos diferentes nos laboratórios
clínicos para imunofluorescência.
•Isotionato de fluoresceína e compostos da rodamina são os
fluorocromos mais usados para conjugação com anticorpos para
torná-los fluorescentes sob condições adequadas de iluminação.
o MICROSCÓPIO DE EPIFLUORESCÊNCIA:
• A reação imunofluorescente que é desencadeada no
microscópio de epifluorescência ocorre através da emissão
de luz de cor quando o fóton é excitado por luz de curto
comprimento de onda (UV).
• Para deixar passar somente a emissão
secundária desejada, devem-se utilizar filtros
apropriados dependendo da cor
do fluorocromo.
DIRETA INDIRETA
Detecção de Ag Detecção de AcDetecção de Ag
o TIPOS DE REAÇÃO:
O anticorpo específico marcado com
Fluorocromo (conjugado) é adicionado
e se fixa ao antígeno, formando um
imunocomplexo estável.
O anticorpo não ligado é removido por
lavagens.
O preparado é observado em microscópio
de fluorescência.
Y Y
Y
Y
Y
Y
Y
Antígeno pesquisado
Conjugado
o VANTAGENS
• Alta especificidade e sensibilidade
• Possibilidade de detecção de proteínas intracelulares e de sua
localização.
o DESVANTAGENS
• Alto custo do microscópio de fluorescência
• Necessidade de um conjugado para cada antígeno que se deseja
identificar ou localizar
• Subjetividade da leitura
o APLICAÇÕES
• Detecção direta de microrganismos em secreções, na urina, nas fezes,
em cortes de tecidos etc. Também é utilizada na fenotipagem de células
tumorais.
• Em bacteriologia, um dos poucos métodos de IFD ainda usados em
laboratória clínico é a identificação do Streptococcus do grupo A.
PARA A PESQUISA DE ANTÍGENOS
Incuba-se a célula ou tecido em que se
quer pesquisar o antígeno com o
anticorpo específico obtido em animal
ou um monoclonal, levando à formação
de um imunocomplexo.
Realiza-se lavagem para retirada do
anticorpo não ligante excedente.
O preparado é observado em microscópio
de fluorescência.
YY
YYYY
A preparação é incubada com um
conjugado antiimunoglobulina, marcado
com fluorocromo, produzido em outra
espécie de animal.
Y Y YY
Antígeno pesquisado
Conjugado
Anticorpo Monoclonal
Y
Y
Antígenos padronizados são fixados a
lâminas de vidro.
PARA A PESQUISA DE ANTICORPOS
Realizam-se lavagens para a retirada
dos anticorpos não ligados.
O soro do paciente é diluído, colocado
sobre o antígeno e incubado para
permitir a formação do complexo
antígeno-anticorpo.
A preparação é incubada com o
conjugado fluorescente e, se houver
anticorpo no soro, o conjugado reage
com o anticorpo específico para o
antígeno.
Observa-se o preparado em microscópio
de fluorescência.
YYY
Y
Y
Y
YY YY
Antígeno padronizado
Conjugado
Anticorpo pesquisado
Y
Y
o VANTAGENS
• Sensibilidade
• Especificidade
• Reprodutibilidade
• De simples padronização e execução
• O mesmo conjugado pode ser usado em sistemas diferentes
• Para determinar as classes e subclasses de anticorpos são utilizados
conjugados específicos
o DESVANTAGENS
• Necessidade de microscópio de fluorescência
• Subjetividade na leitura
• Não-automação
o APLICAÇÕES
• Medicina humana
• Diagnóstico sorológico de várias doenças infecciosas
como a Doença de Chagas, a SIDA/AIDS, as hepatites e
complexos em doenças auto-imunes.
• Medicina Veterinária
• Toxoplasmose, Neosporose, Raiva, Campilobacteriose Genital
Bovina.
As técnicas de imunofluorescência ainda são
empregadas na rotina laboratorial, mas estão sendo
gradativamente substituídas por testes
imunoenzimáticos, principalmente devido à
necessidade de microscopia, subjetividade de leitura
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Imunofluorescencia

  • 1. UNIVERSIDADE FEDERAL DA BAHIA INSTITUTO DE CIÊNCIAS DA SAÚDE – ICS DEPARTAMENTO DE BIOINTERAÇÃO DISCIPLINA: IMUNOLOGIA I – ICS 045 Trabalho realizado pela Acadêmica de Medicina Veterinária da UFBA Aretha Alves Borges da Silva sob orientação dos Professores Robert Schaer, Roberto Meyer, Claudia Brodskin e Ricardo Portela. Atualizado em Fevereiro de 2010.
  • 2.
  • 3. • A imunofluorescência permite a detecção e localização de antígenos em células e tecidos utilizando anticorpos específicos, marcados com fluorocromos, de modo que a localização dos antígenos se torna visível ao microscópio de fluorescência. • De acordo com o mesmo princípio, podemos detectar e localizar anticorpos em fluidos biológicos usando seu antígeno correspondente.
  • 4. • Baseia-se na capacidade das moléculas de anticorpo se ligarem covalentemente a fluorocromos sem perder sua reatividade específica com o antígeno. • Teste qualitativo/semi-quantitativo. • Método de alta sensibilidade e alta especificidade.
  • 5. o FLUOROCROMOS: • Nos testes de imunofluorescência são empregados conjugados constituídos de anticorpos ligados covalentemente a moléculas reveladoras denominadas fluorocromos. • 1941: primeira vez que anticorpos foram conjugados com fluorocromos. • Fluorocromos são substâncias que absorvem luz ultravioleta e emitem luz visível, ou seja, ficam fluorescentes.
  • 6. o FLUOROCROMOS: •São utilizados vários fluorocromos diferentes nos laboratórios clínicos para imunofluorescência. •Isotionato de fluoresceína e compostos da rodamina são os fluorocromos mais usados para conjugação com anticorpos para torná-los fluorescentes sob condições adequadas de iluminação.
  • 7. o MICROSCÓPIO DE EPIFLUORESCÊNCIA: • A reação imunofluorescente que é desencadeada no microscópio de epifluorescência ocorre através da emissão de luz de cor quando o fóton é excitado por luz de curto comprimento de onda (UV). • Para deixar passar somente a emissão secundária desejada, devem-se utilizar filtros apropriados dependendo da cor do fluorocromo.
  • 8. DIRETA INDIRETA Detecção de Ag Detecção de AcDetecção de Ag o TIPOS DE REAÇÃO:
  • 9.
  • 10. O anticorpo específico marcado com Fluorocromo (conjugado) é adicionado e se fixa ao antígeno, formando um imunocomplexo estável. O anticorpo não ligado é removido por lavagens. O preparado é observado em microscópio de fluorescência. Y Y Y Y Y Y Y Antígeno pesquisado Conjugado
  • 11. o VANTAGENS • Alta especificidade e sensibilidade • Possibilidade de detecção de proteínas intracelulares e de sua localização. o DESVANTAGENS • Alto custo do microscópio de fluorescência • Necessidade de um conjugado para cada antígeno que se deseja identificar ou localizar • Subjetividade da leitura
  • 12. o APLICAÇÕES • Detecção direta de microrganismos em secreções, na urina, nas fezes, em cortes de tecidos etc. Também é utilizada na fenotipagem de células tumorais. • Em bacteriologia, um dos poucos métodos de IFD ainda usados em laboratória clínico é a identificação do Streptococcus do grupo A.
  • 13.
  • 14. PARA A PESQUISA DE ANTÍGENOS Incuba-se a célula ou tecido em que se quer pesquisar o antígeno com o anticorpo específico obtido em animal ou um monoclonal, levando à formação de um imunocomplexo. Realiza-se lavagem para retirada do anticorpo não ligante excedente. O preparado é observado em microscópio de fluorescência. YY YYYY A preparação é incubada com um conjugado antiimunoglobulina, marcado com fluorocromo, produzido em outra espécie de animal. Y Y YY Antígeno pesquisado Conjugado Anticorpo Monoclonal Y Y
  • 15. Antígenos padronizados são fixados a lâminas de vidro. PARA A PESQUISA DE ANTICORPOS Realizam-se lavagens para a retirada dos anticorpos não ligados. O soro do paciente é diluído, colocado sobre o antígeno e incubado para permitir a formação do complexo antígeno-anticorpo. A preparação é incubada com o conjugado fluorescente e, se houver anticorpo no soro, o conjugado reage com o anticorpo específico para o antígeno. Observa-se o preparado em microscópio de fluorescência. YYY Y Y Y YY YY Antígeno padronizado Conjugado Anticorpo pesquisado Y Y
  • 16. o VANTAGENS • Sensibilidade • Especificidade • Reprodutibilidade • De simples padronização e execução • O mesmo conjugado pode ser usado em sistemas diferentes • Para determinar as classes e subclasses de anticorpos são utilizados conjugados específicos o DESVANTAGENS • Necessidade de microscópio de fluorescência • Subjetividade na leitura • Não-automação
  • 17. o APLICAÇÕES • Medicina humana • Diagnóstico sorológico de várias doenças infecciosas como a Doença de Chagas, a SIDA/AIDS, as hepatites e complexos em doenças auto-imunes. • Medicina Veterinária • Toxoplasmose, Neosporose, Raiva, Campilobacteriose Genital Bovina.
  • 18. As técnicas de imunofluorescência ainda são empregadas na rotina laboratorial, mas estão sendo gradativamente substituídas por testes imunoenzimáticos, principalmente devido à necessidade de microscopia, subjetividade de leitura e impossibilidade de automação.