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Trabalho realizado pelos acadêmicos de Medicina da UFBA Adriana  Campos, Nivaldo Cardozo Filho, Sabrina Oliveira e Silvana Asfora, sob orientação dos Professores Roberto Meyer, Ivana Nascimento, Robert Schaer  Cláudia Brodskyn, Songelí Freire e Denise Lemaire, do Laboratório de  Imunologia do Instituto de Ciências da Saúde da UFBA. Atualizado em setembro de 2003  Aula 10 ELISA (“enzyme-linked immunosorbent assay”)
-O teste é feito em placas plásticas de microtitulação ou em tubos ( suporte sólido ), onde se coloca o Ag ou Ac em concentrações adequadas. -Utiliza-se principalmente placas de poliestireno com 96 poços dispostos em  12  fileiras verticais, cada uma com 8 poços. -O teste identifica e quantifica Ag ou Ac presente na amostra (soro do paciente ou outro líquido  biológico), utilizando  um  dos  dois  mencionados  reagentes,  conjugados  com enzimas. -A reação ocorre em meio líquido. A atividade enzimática é proporcional à concentração de Ag ou Ac da amostra. -A quantidade de Ag ou Ac da amostra é mensurada pela determinação da quantidade de produto final corado, através de leitura em fotocolorímetro. -O produto final corado surge por ação da enzima que converte um substrato incolor em um produto colorido (ou o substrato alterado pela enzima induz mudança de cor de uma substância indicadora).  -Principais tipos de ELISA: indireto, sanduíche, competição e captura.
.Lavagem para retirada de Ag  livre :  .Lavagem para retirada de Ac  não fixado : .Adição do conjugado:  .Incubação   .Incubação   ELISA  indireto .Poços de uma fileira horizontal da placa, revestidos com o mesmo Ag padronizado .Adição de soro-teste: (1)  e (2)
.Lavagem para retirada de conjugado livre .Adição de cromógeno que é ativado pela parte enzimática do conjugado  .Positivo  .Negativo .Placa de ELISA evidenciando o resultado: No diagnóstico sorológico de doenças infecto-contagiosas, onde  a detecção  de anticorpos IgG, IgA ou IgE seja signifi- cativa. A detecção de IgM por esta técnica pode levar a resultado falso-positivo, por ação do fator reumatóide, autoanticorpo que quase sempre é uma IgM anti-IgG. Exemplos onde o seu uso é intenso: diagnós- tico sorológico da Doença de Chagas e da SIDA/AIDS Utilização do ELISA indireto: “ Cut-off”: ponto de corte. Cont. negativo Cut-off Cont. positivo
ELISA sanduíche   1. Placa de Elisa revestida com Ac específico   2.Adição de solução-teste contendo Ag   3. Lavagem para retirada  do Ag não capturado   4. Adição de outro Ac marcado, nova lavagem e revelação Utilização: esta técnica é muito usada para a dosagem de hormônios, marcadores tumorais e outras proteínas séricas, bem como para a detecção de antígenos virais e de outros patógenos, nas fezes, na urina em secreções etc. Pode detectar 10 -12  a 10 -14 g. Para este teste se tornar quantitativo, é necessário  a  construção  de  uma curva com os  valores de densidade ótica obtidos a partir da  reação com quantidades  conhecidas  (padrões)  do antígeno a ser dosado. O valor de D.O. obtido com a amostra (teste),  será então usado para  interpolação na mencionado curva.
ELISA por competição   1. Placa de Elisa revestida com Ac específico 4. Quanto maior a quantidade de Ag-teste, menor a possibilidade de ligação do Ag marcado e assim, menor a intensidade de cor emitida   3. Lavagem para retirada de excesso de Ag Utilização: Na dosagem de  hormônios, marcadores tumorais  e ou- tras  proteínas  séricas.  No diagnóstico  sorológico  de  algumas  doenças  como  SIDA/AIDS  2. Adição de Ag-teste: Adição de Ag-marcado: Competição para ligar Ac
ELISA de Captura Esta técnica  é  muito  utilizada para dosar IgM, para se evitar a ação do fator reumatóide. O fator reumatóide é um autoanticorpo geralmente da classe  IgM,  específico para IgG. Este fator encontra-se  elevado  em  algumas situações,  particularmente  nas  doenças  reumáticas.  Tal anticorpo pode se ligar na IgG específica (contra o antígeno teste), presente no soro do paciente, gerando assim um resultado falso positivo caso se use um conjugado anti-IgM, como no ELISA indireto. Observe agora uma ELISA de captura para pesquisa de IgM humana contra  T.gondii:   -Poço revestido com IgG monoclonal contra IgM  humano  -Adição da amostra (contendo IgM)  -Incubação -Lavagem -Adição de Ag do  T.gondii   marcado com enzima -Incubação -Lavagem
-Incubação  -Adição de reagente bloqueador (solução de parada) -Revelação: leitura em fotocolorímetro. Utilização do ELISA captura: É  principalmente  usado  para  a  detecção de anticorpos da classe IgM contra os mais  diversos antígenos (virais, bacterianos, de protozoários etc.), em todas as doenças em que  seja importante identificar o seu recente aparecimento, como por exemplo na rubéola, to- xoplasmose ou citomegalia da gestante. -Adição de cromógeno (  )/ substrato (  )
Os testes “ELISA” são realizados: de  modo  totalmente manual , no qual até a leitura final no fotocolorímetro é feita poço  a  poço;  parcialmente  manual ,  no qual as lavagens e leitura final são feitas em equipamentos automáticos e, finalmente, de modo  totalmente automatizado ,  no qual todo o procedimento  é  executado  em  “ sistemas automáticos de  imunoensaios”,  equipamentos “robôs”,  com  todas  as  etapas  do teste  guiadas  por computador.  Abaixo é apresentado um desses sistemas, usados no Laboratório de Imunologia do ICS-UFBA:  Equipamento automático  para realização de “ELISA”

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Ap10 - Elisa

  • 1. Trabalho realizado pelos acadêmicos de Medicina da UFBA Adriana Campos, Nivaldo Cardozo Filho, Sabrina Oliveira e Silvana Asfora, sob orientação dos Professores Roberto Meyer, Ivana Nascimento, Robert Schaer Cláudia Brodskyn, Songelí Freire e Denise Lemaire, do Laboratório de Imunologia do Instituto de Ciências da Saúde da UFBA. Atualizado em setembro de 2003 Aula 10 ELISA (“enzyme-linked immunosorbent assay”)
  • 2. -O teste é feito em placas plásticas de microtitulação ou em tubos ( suporte sólido ), onde se coloca o Ag ou Ac em concentrações adequadas. -Utiliza-se principalmente placas de poliestireno com 96 poços dispostos em 12 fileiras verticais, cada uma com 8 poços. -O teste identifica e quantifica Ag ou Ac presente na amostra (soro do paciente ou outro líquido biológico), utilizando um dos dois mencionados reagentes, conjugados com enzimas. -A reação ocorre em meio líquido. A atividade enzimática é proporcional à concentração de Ag ou Ac da amostra. -A quantidade de Ag ou Ac da amostra é mensurada pela determinação da quantidade de produto final corado, através de leitura em fotocolorímetro. -O produto final corado surge por ação da enzima que converte um substrato incolor em um produto colorido (ou o substrato alterado pela enzima induz mudança de cor de uma substância indicadora). -Principais tipos de ELISA: indireto, sanduíche, competição e captura.
  • 3. .Lavagem para retirada de Ag livre : .Lavagem para retirada de Ac não fixado : .Adição do conjugado: .Incubação .Incubação ELISA indireto .Poços de uma fileira horizontal da placa, revestidos com o mesmo Ag padronizado .Adição de soro-teste: (1) e (2)
  • 4. .Lavagem para retirada de conjugado livre .Adição de cromógeno que é ativado pela parte enzimática do conjugado .Positivo .Negativo .Placa de ELISA evidenciando o resultado: No diagnóstico sorológico de doenças infecto-contagiosas, onde a detecção de anticorpos IgG, IgA ou IgE seja signifi- cativa. A detecção de IgM por esta técnica pode levar a resultado falso-positivo, por ação do fator reumatóide, autoanticorpo que quase sempre é uma IgM anti-IgG. Exemplos onde o seu uso é intenso: diagnós- tico sorológico da Doença de Chagas e da SIDA/AIDS Utilização do ELISA indireto: “ Cut-off”: ponto de corte. Cont. negativo Cut-off Cont. positivo
  • 5. ELISA sanduíche 1. Placa de Elisa revestida com Ac específico 2.Adição de solução-teste contendo Ag 3. Lavagem para retirada do Ag não capturado 4. Adição de outro Ac marcado, nova lavagem e revelação Utilização: esta técnica é muito usada para a dosagem de hormônios, marcadores tumorais e outras proteínas séricas, bem como para a detecção de antígenos virais e de outros patógenos, nas fezes, na urina em secreções etc. Pode detectar 10 -12 a 10 -14 g. Para este teste se tornar quantitativo, é necessário a construção de uma curva com os valores de densidade ótica obtidos a partir da reação com quantidades conhecidas (padrões) do antígeno a ser dosado. O valor de D.O. obtido com a amostra (teste), será então usado para interpolação na mencionado curva.
  • 6. ELISA por competição 1. Placa de Elisa revestida com Ac específico 4. Quanto maior a quantidade de Ag-teste, menor a possibilidade de ligação do Ag marcado e assim, menor a intensidade de cor emitida 3. Lavagem para retirada de excesso de Ag Utilização: Na dosagem de hormônios, marcadores tumorais e ou- tras proteínas séricas. No diagnóstico sorológico de algumas doenças como SIDA/AIDS 2. Adição de Ag-teste: Adição de Ag-marcado: Competição para ligar Ac
  • 7. ELISA de Captura Esta técnica é muito utilizada para dosar IgM, para se evitar a ação do fator reumatóide. O fator reumatóide é um autoanticorpo geralmente da classe IgM, específico para IgG. Este fator encontra-se elevado em algumas situações, particularmente nas doenças reumáticas. Tal anticorpo pode se ligar na IgG específica (contra o antígeno teste), presente no soro do paciente, gerando assim um resultado falso positivo caso se use um conjugado anti-IgM, como no ELISA indireto. Observe agora uma ELISA de captura para pesquisa de IgM humana contra T.gondii: -Poço revestido com IgG monoclonal contra IgM humano -Adição da amostra (contendo IgM) -Incubação -Lavagem -Adição de Ag do T.gondii marcado com enzima -Incubação -Lavagem
  • 8. -Incubação -Adição de reagente bloqueador (solução de parada) -Revelação: leitura em fotocolorímetro. Utilização do ELISA captura: É principalmente usado para a detecção de anticorpos da classe IgM contra os mais diversos antígenos (virais, bacterianos, de protozoários etc.), em todas as doenças em que seja importante identificar o seu recente aparecimento, como por exemplo na rubéola, to- xoplasmose ou citomegalia da gestante. -Adição de cromógeno ( )/ substrato ( )
  • 9. Os testes “ELISA” são realizados: de modo totalmente manual , no qual até a leitura final no fotocolorímetro é feita poço a poço; parcialmente manual , no qual as lavagens e leitura final são feitas em equipamentos automáticos e, finalmente, de modo totalmente automatizado , no qual todo o procedimento é executado em “ sistemas automáticos de imunoensaios”, equipamentos “robôs”, com todas as etapas do teste guiadas por computador. Abaixo é apresentado um desses sistemas, usados no Laboratório de Imunologia do ICS-UFBA: Equipamento automático para realização de “ELISA”