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UNIVERSIDADE FEDERAL DA BAHIA
INSTITUTO DE CIÊNCIAS DA SAÚDE – ICS
DEPARTAMENTO DE BIOINTERAÇÃO
DISCIPLINA: IMUNOLOGIA I – ICS 045
Trabalho realizado pela Doutoranda de Imunologia da UFBA Danielle Dantas Lima
sob orientação dos Professores Robert Schaer, Roberto Meyer, Cláudia Brodskin e
Ricardo Portela. Atualizado em Fevereiro de 2010.
o DEFINIÇÃO:
• É uma técnica utilizada para contar, examinar e classificar partículas
microscópicas suspensas em meio líquido em fluxo. Permite a
análise de vários parâmetros simultaneamente, sendo conhecida
também por citometria de fluxo multiparamétrica. Através de um
aparelho de detecção óptico-eletrônico são possíveis análises de
características físicas e/ou químicas de uma simples célula. O
citômetro de fluxo é um aparelho utilizado para avaliação da
emissão de fluorescência das células (FACS – Fluorescence Activated
Cell Sorter).
• Os anticorpos monoclonais são os reagentes de escolha
devido à sua especificidade, reação cruzada mínima e
reprodutibilidade. O citômetro de fluxo mede as
propriedades de dispersão de luz pelas as células e a
emissão de luz de anticorpos monoclonais associados a
fluorocromos e ligados à superfície de uma célula.
• VANTAGENS
• Mede múltiplos parâmetros em células individuais;
• Grande número de células analisadas com rapidez;
• Disponibilidade de amplo perfil de anticorpos
específicos;
• Análise de antígenos de superfície, intracitoplasmáticos
e intranucleares;
o APLICAÇÕES
• Fenotipagem dos leucócitos
• Fenotipagem de células tumorais
- Diagnóstico e classificação das leucemias e dos
linfomas
• Análise de DNA
• Análise da função dos neutrófilos
• Contagem de reticulócitos
o APLICAÇÕES EM MEDICINA VETERINÁRIA
• Quantificação de subpopulações linfocitárias
• Quantificação das células CD34+ como indicação da
capacidade de reconstituição hematopoiética após o
transplante de células-tronco
• Avaliação de eritrócitos
• Avaliação de plaquetas
• As células, uma vez em suspensão, são orientadas em um fluxo laminar e
interceptadas uma a uma por um feixe de luz (LASER).
• Um número de detectores são apontados ao local onde o fluxo passa
através do feixe de luz; um na linha do feixe de luz (Forward Scatter ou
FSC) e vários perpendiculares a este (Side Scatter ou SSC) além de um ou
mais detectores fluorescentes. Cada partícula suspensa passando através
do feixe dispersa a luz de uma forma, e os fluorocromos fluorescentes
encontrados na partícula podem ser excitados emitindo luz de menor
frequência do que o da fonte de luz. Esta combinação de luz dispersa e
fluorescente é melhorada pelos dectetores, e analisando as flutuações
de brilho de cada detector (uma para cada pico de emissão fluorescente)
é possível explorar vários tipos de informação sobre a estrutura física e
química de cada partícula.
Detector de dispersão de
luz em ângulo de 90º
Complexidade celular
SSC (Side Scatter)
Detector de dispersão de
luz frontal
Tamanho celular
FSC (Forward Scatter)
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de Argon a 488 nm
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ÂNGULO DE DISPERSÃO LATERAL (SSC)
LASER
CÉLULA
3)Dispersão lateral
de luz
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Laser
3)Dispersão de luz
para a frente
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de dados
5)A luz refletida passa
através de filtros e é
detectada por tubos
fotomultiplicadores que
convertem o sinal luminoso
em sinal eletrônico
2) Anticorpos monoclonais associados a
fluorocromos e ligados à superfície de uma
célula
Linfócito TCD4
Anticorpos monoclonais marcados
Linfócito TCD8
Citometria de fluxo
Luz fluorescente
Laser
Contagem das
células
Gráfico de análise de leucócitos (dispersão lateral e frontal)
Cada ponto significa uma célula identificada pelo citômetro.
Estão divididas pela dispersão frontal (forward) – tamanho da célula - horizontalmente
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Os círculos indica células que pertencem a um grupo de tamanho e complexidade próximos
Gráfico de análise de leucócitos (com fluorescência)
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Neste quadrante estão as
células CD4- e CD3-
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células CD4- e CD3+
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Citometria de fluxo

  • 1. UNIVERSIDADE FEDERAL DA BAHIA INSTITUTO DE CIÊNCIAS DA SAÚDE – ICS DEPARTAMENTO DE BIOINTERAÇÃO DISCIPLINA: IMUNOLOGIA I – ICS 045 Trabalho realizado pela Doutoranda de Imunologia da UFBA Danielle Dantas Lima sob orientação dos Professores Robert Schaer, Roberto Meyer, Cláudia Brodskin e Ricardo Portela. Atualizado em Fevereiro de 2010.
  • 2.
  • 3. o DEFINIÇÃO: • É uma técnica utilizada para contar, examinar e classificar partículas microscópicas suspensas em meio líquido em fluxo. Permite a análise de vários parâmetros simultaneamente, sendo conhecida também por citometria de fluxo multiparamétrica. Através de um aparelho de detecção óptico-eletrônico são possíveis análises de características físicas e/ou químicas de uma simples célula. O citômetro de fluxo é um aparelho utilizado para avaliação da emissão de fluorescência das células (FACS – Fluorescence Activated Cell Sorter).
  • 4. • Os anticorpos monoclonais são os reagentes de escolha devido à sua especificidade, reação cruzada mínima e reprodutibilidade. O citômetro de fluxo mede as propriedades de dispersão de luz pelas as células e a emissão de luz de anticorpos monoclonais associados a fluorocromos e ligados à superfície de uma célula.
  • 5. • VANTAGENS • Mede múltiplos parâmetros em células individuais; • Grande número de células analisadas com rapidez; • Disponibilidade de amplo perfil de anticorpos específicos; • Análise de antígenos de superfície, intracitoplasmáticos e intranucleares;
  • 6. o APLICAÇÕES • Fenotipagem dos leucócitos • Fenotipagem de células tumorais - Diagnóstico e classificação das leucemias e dos linfomas • Análise de DNA • Análise da função dos neutrófilos • Contagem de reticulócitos
  • 7. o APLICAÇÕES EM MEDICINA VETERINÁRIA • Quantificação de subpopulações linfocitárias • Quantificação das células CD34+ como indicação da capacidade de reconstituição hematopoiética após o transplante de células-tronco • Avaliação de eritrócitos • Avaliação de plaquetas
  • 8.
  • 9. • As células, uma vez em suspensão, são orientadas em um fluxo laminar e interceptadas uma a uma por um feixe de luz (LASER). • Um número de detectores são apontados ao local onde o fluxo passa através do feixe de luz; um na linha do feixe de luz (Forward Scatter ou FSC) e vários perpendiculares a este (Side Scatter ou SSC) além de um ou mais detectores fluorescentes. Cada partícula suspensa passando através do feixe dispersa a luz de uma forma, e os fluorocromos fluorescentes encontrados na partícula podem ser excitados emitindo luz de menor frequência do que o da fonte de luz. Esta combinação de luz dispersa e fluorescente é melhorada pelos dectetores, e analisando as flutuações de brilho de cada detector (uma para cada pico de emissão fluorescente) é possível explorar vários tipos de informação sobre a estrutura física e química de cada partícula.
  • 10. Detector de dispersão de luz em ângulo de 90º Complexidade celular SSC (Side Scatter) Detector de dispersão de luz frontal Tamanho celular FSC (Forward Scatter) Fonte de Luz Incidente: Laser de Argon a 488 nm
  • 11. ÂNGULO DE DISPERSÃO FRONTAL (FSC) ÂNGULO DE DISPERSÃO LATERAL (SSC) LASER CÉLULA
  • 12. 3)Dispersão lateral de luz 1)Suspensão de células Laser 3)Dispersão de luz para a frente 4)Filtro 6) Análise de dados 5)A luz refletida passa através de filtros e é detectada por tubos fotomultiplicadores que convertem o sinal luminoso em sinal eletrônico 2) Anticorpos monoclonais associados a fluorocromos e ligados à superfície de uma célula
  • 13. Linfócito TCD4 Anticorpos monoclonais marcados Linfócito TCD8 Citometria de fluxo Luz fluorescente Laser Contagem das células
  • 14. Gráfico de análise de leucócitos (dispersão lateral e frontal) Cada ponto significa uma célula identificada pelo citômetro. Estão divididas pela dispersão frontal (forward) – tamanho da célula - horizontalmente E também pela dispersão lateral (side) - granulação e complexidade – verticalmente Os círculos indica células que pertencem a um grupo de tamanho e complexidade próximos
  • 15. Gráfico de análise de leucócitos (com fluorescência) Neste quadrante estão as células CD4+ e CD3- Neste quadrante estão as células CD4- e CD3- (células que não linfócitos) Neste quadrante estão as células CD4- e CD3+ (outros linfócitos que não Th) Neste quadrante estão as células CD4+ e CD3+ (linfócitos Th)