O documento descreve a técnica de citometria de fluxo, que permite contar e classificar células em suspensão através da análise de parâmetros como tamanho, complexidade e marcação com anticorpos fluorescentes. A técnica é utilizada em imunologia para fenotipagem de leucócitos e células tumorais e mede múltiplos parâmetros celulares de forma rápida e simultânea.

1. UNIVERSIDADE FEDERAL DA BAHIA
INSTITUTO DE CIÊNCIAS DA SAÚDE – ICS
DEPARTAMENTO DE BIOINTERAÇÃO
DISCIPLINA: IMUNOLOGIA I – ICS 045
Trabalho realizado pela Doutoranda de Imunologia da UFBA Danielle Dantas Lima
sob orientação dos Professores Robert Schaer, Roberto Meyer, Cláudia Brodskin e
Ricardo Portela. Atualizado em Fevereiro de 2010.

3. o DEFINIÇÃO:
• É uma técnica utilizada para contar, examinar e classificar partículas
microscópicas suspensas em meio líquido em fluxo. Permite a
análise de vários parâmetros simultaneamente, sendo conhecida
também por citometria de fluxo multiparamétrica. Através de um
aparelho de detecção óptico-eletrônico são possíveis análises de
características físicas e/ou químicas de uma simples célula. O
citômetro de fluxo é um aparelho utilizado para avaliação da
emissão de fluorescência das células (FACS – Fluorescence Activated
Cell Sorter).

4. • Os anticorpos monoclonais são os reagentes de escolha
devido à sua especificidade, reação cruzada mínima e
reprodutibilidade. O citômetro de fluxo mede as
propriedades de dispersão de luz pelas as células e a
emissão de luz de anticorpos monoclonais associados a
fluorocromos e ligados à superfície de uma célula.

5. • VANTAGENS
• Mede múltiplos parâmetros em células individuais;
• Grande número de células analisadas com rapidez;
• Disponibilidade de amplo perfil de anticorpos
específicos;
• Análise de antígenos de superfície, intracitoplasmáticos
e intranucleares;

6. o APLICAÇÕES
• Fenotipagem dos leucócitos
• Fenotipagem de células tumorais
- Diagnóstico e classificação das leucemias e dos
linfomas
• Análise de DNA
• Análise da função dos neutrófilos
• Contagem de reticulócitos

7. o APLICAÇÕES EM MEDICINA VETERINÁRIA
• Quantificação de subpopulações linfocitárias
• Quantificação das células CD34+ como indicação da
capacidade de reconstituição hematopoiética após o
transplante de células-tronco
• Avaliação de eritrócitos
• Avaliação de plaquetas

9. • As células, uma vez em suspensão, são orientadas em um fluxo laminar e
interceptadas uma a uma por um feixe de luz (LASER).
• Um número de detectores são apontados ao local onde o fluxo passa
através do feixe de luz; um na linha do feixe de luz (Forward Scatter ou
FSC) e vários perpendiculares a este (Side Scatter ou SSC) além de um ou
mais detectores fluorescentes. Cada partícula suspensa passando através
do feixe dispersa a luz de uma forma, e os fluorocromos fluorescentes
encontrados na partícula podem ser excitados emitindo luz de menor
frequência do que o da fonte de luz. Esta combinação de luz dispersa e
fluorescente é melhorada pelos dectetores, e analisando as flutuações
de brilho de cada detector (uma para cada pico de emissão fluorescente)
é possível explorar vários tipos de informação sobre a estrutura física e
química de cada partícula.

10. Detector de dispersão de
luz em ângulo de 90º
Complexidade celular
SSC (Side Scatter)
Detector de dispersão de
luz frontal
Tamanho celular
FSC (Forward Scatter)
Fonte de Luz Incidente: Laser
de Argon a 488 nm

11. ÂNGULO DE DISPERSÃO FRONTAL (FSC)
ÂNGULO DE DISPERSÃO LATERAL (SSC)
LASER
CÉLULA

12. 3)Dispersão lateral
de luz
1)Suspensão de células
Laser
3)Dispersão de luz
para a frente
4)Filtro
6) Análise
de dados
5)A luz refletida passa
através de filtros e é
detectada por tubos
fotomultiplicadores que
convertem o sinal luminoso
em sinal eletrônico
2) Anticorpos monoclonais associados a
fluorocromos e ligados à superfície de uma
célula

13. Linfócito TCD4
Anticorpos monoclonais marcados
Linfócito TCD8
Citometria de fluxo
Luz fluorescente
Laser
Contagem das
células

14. Gráfico de análise de leucócitos (dispersão lateral e frontal)
Cada ponto significa uma célula identificada pelo citômetro.
Estão divididas pela dispersão frontal (forward) – tamanho da célula - horizontalmente
E também pela dispersão lateral (side) - granulação e complexidade – verticalmente
Os círculos indica células que pertencem a um grupo de tamanho e complexidade próximos

15. Gráfico de análise de leucócitos (com fluorescência)
Neste quadrante estão as
células CD4+ e CD3-
Neste quadrante estão as
células CD4- e CD3-
(células que não linfócitos)
Neste quadrante estão as
células CD4- e CD3+
(outros linfócitos que não Th)
Neste quadrante estão as
células CD4+ e CD3+
(linfócitos Th)