Este documento descreve técnicas de imunoensaio como a imunoquimioluminescência, imunofluorometria e radioimunoensaio. A imunoquimioluminescência quantifica anticorpos ou antígenos no soro usando uma reação enzimática que emite luz. A imunofluorometria mede a fluorescência emitida após a ligação de um fluorocromo. O radioimunoensaio usa isótopos radioativos, mas está sendo substituído por outras técnicas devido ao manejo de materiais radio

1. Trabalho realizado pelos acadêmicos de Medicina da UFBA Adriana Campos, Nivaldo Cardozo Filho, Sabrina Oliveira e Silvana Asfora, sob orientação dos Professores Roberto Meyer, Ivana Nascimento, Robert Schaer, Cláudia Brodskyn, Songelí Freire e Denise Lemaire, do Laboratório de Imunologia do Instituto de Ciências da Saúde da UFBA. Atualizado em setembro de 2003 Aula 12 Nesta aula serão abordados a imunoquimioluminescência , a imunofluorometria , além de um resumo dos principais aspectos do radioimunoensaio .

2. Imunoquimioluminescência

3. -Exames feitos por quimioluminescência são basicamente automatizados. -Quantificam Ag ou Ac presentes no soro. São muito usados para a dosagem de hormônios, marcadores tumorais e diversas outras proteínas séricas. -Vários soros podem ser testados e diferentes moléculas po- dem ser quantificadas de uma só vez. -A técnica se baseia na ligação Ag – Ac. Como no ELISA, um dos dois reagentes é conjugado com uma substância que quan- do ativada, emite luz visível. Então, a luz emitida é proporcio- nal à concentração do reagente pesquisado. -Os tipos mais utilizados são: competição e sanduíche.

4. Fase sólida em que uma microesfera de poliestireno é revestida com Ac monoclonal contra o Ag específico Adição de soro do paciente O conjunto é incubado com agitação intermitente Quimioluminescência (como exemplo, um tipo sanduíche)

5. Lavagem para retirada de Ag não fixado: Adição de Ac monoclonal, anti-Ag pesquisado, conjugado à enzima . Lavagem para retirada de Ac conjugado à enzima, não fixado O conjunto é incubado

6. Adição de substrato da enzima O substrato quimioluminescente sofre hidrólise na presença da enzima, produzindo substâncias instáveis que culminam com emissão de luz Incubação O exemplo acima é o que acontece com o substrato luminescente AMPPD. Alternativamente a substância luminescente pode ser desestabilizada por uma súbita mudança do pH e da concentração do meio (éster de acridina) ou ainda um elemento, como por exemplo o rutênio, dissociado do Ag ou do Ac por uma descarga elétrica no final da reação, culminando com a emis- são de luz. A imunoluminescência pode atingir uma sensibilidade de 10 -15 a 10 -16 g.

7. Os imunoensaios de quimioluminescência são realizados em aparelhos automatizados, onde todo o processo é guiado por computadores. São apresentados abaixo quatro desses equipa- mentos, usados no Laboratório de Imunologia do ICS-UFBA: “ Elecsys 1010”da “Roche” “ Access”, da “Sanofi-Winthrop” “ Immulite”, da “DPC” “ACS 180”, da “Ciba-Corning”

8. Imunofluorimetria

9. -Este método é muito utilizado para dosagens de proteínas séricas, hormônios, marcadores tumorais, anticorpos específicos para alérgenos etc. -O teste é basicamente automatizado. -O resultado baseia-se na fluorescência emitida, mensurada pelo fluorômetro. -A fluorescência emitida é intensa, porém pouco duradoura. -Utiliza-se Ac ou Ag conjugado com um fluorocromo. - Fluorocromos como fluoresceína e rodamina podem ser utilizados, entretanto lantanídeos como o európio são os mais usados. -Os tipos mais utilizados são: competição e sanduíche. - Pode detectar 10 -12 a 10 -16 g.

10. + Fase Sólida contendo Ac monoclonal contra Ag + Padrão, controle e amostra Ac monoclonal marcado com Eu, contra um outro epítopo do Ag Incubação + Solução de amplificação: dissocia os ions európio do Ac marcado na solução, e com eles forma estruturas fluorescentes + Os ensaios do tipo apresentado a seguir, se baseiam na poten- cialização da emissão de luz vi- sível, a partir da dissociação de lantanídeos. Ag - Eu - Eu - Eu Eu Fluorimetria exemplo: sanduíche, usando o európio

11. Como referido anteriormente, as técnicas imunofluorimétricas são realizadas quase sempre em equipamentos automatizados. A seguir é apresentado o fluorômetro pertencente ao Laboratório de Imunologia do ICS – UFBA. Sistema automático de imunoensaios, por fluorimetria, marca “ Wallac”, modelo “Autodelfia”.

12. Um resumo sobre radioimunoensaio

13. Uma outra técnica para imunodosagem e imunodiagnóstico é o radioimunoensaio (RIA). Esta técnica foi a primeira a ser desen- volvida para dosagem de hormônios e outras substâncias pre- sentes em pequenas concentrações em fluidos biológicos e tem como base a ligação Ag – Ac. Apesar de ainda usada, está sendo substituída pela imuno- fluorimetria, ELISA e imunoluminescência, tendo em vista que envolve material radioativo. O princípio e as modalidades são os mesmos dos outros ensaios acima mencionados – a diferença está na substância indicadora de reação, que neste caso é um isótopo radioativo e em geral se utiliza o 125 I. Trata-se de um ensaio de grande reprodutibilidade, especificida- de e sensibilidade (em torno de 10 -12 g), entretanto, tem como desvatagens a manipulação de isótopo radioativo ( 125 I é emis- sor de radiação gama), a validade curta do referido reagente ra- dioativo (o 125 I tem meia vida de 58 dias) e a demora da execu- ção do teste, já que a leitura final de cada amostra deve levar 1 minuto (“counts per minute”).