ICSA17 - ELISA
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O documento descreve os princípios e aplicações do teste imunológico ELISA (Enzyme-Linked Immunosorbent Assay), incluindo seus tipos (indireto, sanduíche, competição e de captura), etapas, interpretação dos resultados e usos em medicina humana e veterinária para detecção de antígenos e anticorpos.
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- 1. UNIVERSIDADE FEDERAL DA BAHIA INSTITUTO DE CIÊNCIAS DA SAÚDE – ICS DEPARTAMENTO DE BIOINTERAÇÃO DISCIPLINA: IMUNOLOGIA I – ICS 045 http://www.elisa-development.com/ Trabalho realizado pela Acadêmica de Medicina Veterinária da UFBA Ludmilla Soares Sena sob orientação dos Professores Robert Schaer, Roberto Meyer, Claudia Brodskin e Ricardo Portela. Atualizado em Fevereiro de 2010.
- 3. • Teste utilizado para detectar a presença de antígenos (Ag) ou anticorpos (Ac) específicos em fluidos corporais ou sobrenadantes de cultura. • Une a especificidade de uma ligação Ag-Ac com a sensibilidade de uma reação enzimática, permitindo assim a detecção de quantidades mínimas de uma substância em particular e com grande confiabilidade. • Uma enzima, covalentemente ligada a um Ag ou Ac, reage com um substrato, dessa forma levando a oxidação de um cromógeno incolor, o qual então desenvolverá coloração dependente da concentração de Ag/Ac pesquisados.
- 4. • Utiliza-se uma base sólida (placa de poliestireno com 96 poços dispostos em 12 fileiras verticais, cada uma com 8 poços) na qual Ag/Ac irão se ligar através de interações hidrofóbicas. • É um método tanto qualitativo quanto quantitativo.
- 5. o Elementos necessários para a realização: • Ag purificado (caso deseje-se detectar ou quantificar Ac) • Ac purificado (caso deseje-se detectar ou quantificar Ag) • Controles (Positivo, Negativo, Ponto de Corte) – nos ensaios qualitativos • Padrões (soluções com concentração conhecida do analito a ser dosado) – nos ensaios quantitativos • Amostras a serem testadas • Placa de poliestireno • Tampão de lavagem: utilizado para remover o Ag ou Ac livres na placa, Ag ou Ac ligados com pouca avidez e outras moléculas interferentes • Conjugado: Ac ou Ag ligados covalentemente a uma enzima • Cromógeno: substância incolor que, ao ser oxidada pela reação enzimática, produz cor • Leitora de ELISA (espectrofotômetro): converte as diferentes intensidade de cor resultantes ao final do ensaio em valores numéricos (valores de densidade óptica - DO)
- 6. o Elementos necessários para a realização: http://www.dellta.com.br/detalhes.php?prod_id=89 http://portuguese.alibaba.com/product-gs/elisa-plate-flatbottom-271555304.html Placas de ELISA http://www.laborlifescience.com.br/equipamentos_elisa.html Leitoras de ELISA http://www.analiticaweb.com.br/images/produtos/p4ae04e96c bc7f/placa_elisa.jpg
- 7. o Vantagens • Teste com alta sensibilidade (habilidade de detectar quantidades mínimas do Ag ou Ac pesquisados (O ELISA detecta moléculas na ordem de nanogramas) – menor risco de falsos-negativos. • Teste com alta especificidade (característica que indica que o teste em questão identificará somente o Ag ou Ac desejado) – menor risco de falsos-positivos. • Permite que várias amostras sejam testadas ao mesmo tempo. • Realização relativamente rápida, simples e de custo baixo a médio em comparação com outras técnicas de imunodiagnóstico.
- 8. oDesvantagens • Necessidade de mão de obra especializada. • Alguns reagentes podem degradar-se com facilidade, com exposição à luz do sol ou a elevadas temperaturas. • Por ser uma técnica altamente sensível e específica, é muito susceptível a erros de pipetagem, variações nos tempos de incubação e lavagens, e alterações nos reagentes.
- 10. • INDIRETO: detecta principalmente Ac •SANDUÍCHE: detecta principalmente Ag • COMPETIÇÃO: detecta Ag com baixo peso molecular (monovalentes) • CAPTURA: detecção de Acs (principalmente IgM, evitando a ação do fator reumatóide)
- 11. Y Y Y Y Antígeno Y Conjugado Anticorpo Cromógeno 1) Inicialmente, o Ag é adicionado à placa e se adere à superfície dos poços 2) Em seguida, são realizadas lavagens para a retirada do Ag livre nos poços 3) A solução a ser pesquisada é adicionada. Caso contenha Acs específicos contra os Ags presentes na placa, estes se ligarão aos Ags 4) Uma nova série de lavagens é realizada para retirar os Acs que não se ligaram aos Ags 5) É então adicionado o conjugado, que se liga aos Acs 6) Uma nova lavagem retira o conjugado livre 7) O cromógeno e o substrato são adicionados, e se o cromógeno for oxidado pela ação da reação enzimática, haverá desenvolvimento de cor
- 12. o Interpretação dos resultados: • A intensidade da cor é diretamente proporcional à concentração de Ac da amostra pesquisada. • Para determinar quais indivíduos são positivos ou negativos para a doença pesquisada, deve-se calcular um ponto de corte (“cut-off”) para aquele ensaio. Acima dos limites do cut-off, encontram- Contr. Negativo → Cut-off → Contr. Positivo → se os indivíduos positivos e abaixo os negativos. http://www.labimuno.org.br/ensino.cfm?load=aulas • O ELISA Indireto não determina se o indivíduo ESTÁ ou não doente naquele momento. Ele apenas afirma se aquele animal/paciente já teve ou não contato com o agente causador da enfermidade em algum momento de sua vida.
- 13. o Aplicações na medicina humana e veterinária: • Diagnóstico sorológico de doenças infecto-contagiosas, onde a detecção de Ac IgG, IgA ou IgE seja significativa. • Exemplos na Medicina Humana: diagnóstico sorológico da Doença de Chagas e da SIDA/AIDS. • Exemplos na Medicina Veterinária: diagnóstico da Linfadenite Caseosa e da Leishmaniose. • OBS: Não deve-se detectar IgM por esta técnica devido à ação do fator reumatóide. O fator reumatóide é um auto-anticorpo geralmente da classe IgM, específico para IgG. Este fator encontra-se elevado em algumas situações, particularmente nas doenças reumáticas. Tal anticorpo pode se ligar na IgG específica (contra o antígeno teste), presente no soro do paciente, gerando assim um resultado falso positivo caso se use um conjugado anti-IgM, como no ELISA indireto. Para mensuração de IgM, deve-se utilizar o ELISA de captura.
- 14. Y Y Y Y Antígeno Y Conjugado anti-IgM Ac IgM específico pesquisado Y Y Ac IgG Cromógeno Fator Reumatóide 1) O Ag específico é adicionado á placa, e em seguida, são realizadas lavagens para a retirada do excesso não ligado 2) Adiciona-se a amostra do paciente, que contém o Ac IgM pesquisado e o Fator Reumatóide. O Fator Reumatóide pode estar ligado a Acs IgG específicos para o Ag presente na placa, formando imunocomplexos que se ligam a este Ag 3) Adiciona-se o conjugado antiIgM 4) Adiciona-se o cromógeno e o substrato, desenvolvendo-se cor. Devido ao Fator Reumatóide unido à IgG específica, tem-se um resultado superestimado da quantidade de IgM pesquisada, podendo levar até a resultados falsos-positivos
- 15. 1) Um Ac conhecido é adicionado à placa e se liga à sua superfície Y Antígeno Y Conjugado Anticorpo Cromógeno 2) Lavagens são feitas para retirar os Ac livres 3) Adiciona-se a solução com o Ag a ser pesquisado e este, caso presente, se liga aos Ac nos poços 4) Realiza-se lavagens para retirar o Ag não capturado 5) Adiciona-se conjugado específico para o Ag procurado 6) Novas lavagens retiram o conjugado livre 7) O cromógeno e o substrato são adicionados, e se o cromógeno for oxidado pela ação da reação enzimática, haverá desenvolvimento de cor
- 16. o Interpretação dos resultados: • A intensidade da cor é diretamente proporcional à concentração de Ag da Curva Padrão (exemplo) amostra pesquisada. necessária a construção de uma curva com os valores de densidade ótica obtidos a partir da reação de padrões com concentrações conhecidas do Absorvância (450/620) • Para este teste se tornar quantitativo, é antígeno a ser dosado. A curva serve como padrão de comparação para deduzir as quantidades de antígenos nas soluções-teste. Concentração de IgE http://www.shibayagi.co.jp/Prod-E/prod_akrie-211.htm
- 17. o Aplicações na medicina humana e veterinária: • Muito usado para a dosagem de hormônios, marcadores tumorais e outras proteínas séricas, bem como para a detecção de antígenos virais e de outros patógenos nas fezes, na urina e em secreções. Pode detectar 10-12 a 10-14g. • Exemplos na Medicina Humana: Teste de Gravidez (teste de detecção da gonadotropina coriônica humana (HCG) no soro). • Exemplos na Medicina Veterinária: Triagem na indústria de alimentos (pesquisa de patógenos e contaminantes nos alimentos).
- 18. Y Antígeno Y Conjugado Anticorpo Cromógeno 1) Adição do Ac específico aos poços da placa 2) Lavagem para retirar os Ac livres 3) Adição da solução com o Ag a ser pesquisado e de uma outra solução contendo Ag marcado (conjugado) no mesmo poço. Os Ags competem entre si pelo sítio de ligação do Ac e aquele que estiver em maior concentração, se ligará a mais Ac 4) Lavagem para retirar os Ag não capturados 5) Adiciona-se o cromógeno e o substrato. Caso o conjugado tenha se ligado aos Ac da placa, ocorrerá reação enzimática e o cromógeno será oxidado, havendo desenvolvimento de cor
- 19. o Interpretação dos resultados: • A intensidade da cor é INVERSAMENTE proporcional à concentração de ag da amostra pesquisada, ou seja, quanto maior a quantidade de Ag-teste, menor a possibilidade de ligação do Ag marcado e assim, menor a intensidade de cor emitida.
- 20. o Aplicações na Medicina Humana e Veterinária: • Dosagem de hormônios, marcadores tumorais e outras proteínas séricas. Diagnóstico sorológico de algumas doenças. • Exemplo na Medicina Humana: dosagem de T3, T4, testosterona, estradiol, progesterona. • Exemplo na Medicina Veterinária: detecção sorológica de Herpesvírus Bovino tipo I.
- 21. Y Y Y Y Y Y Y Y Antígeno Y Anticorpo IgG Y Anticorpo IgM Conjugado Cromógeno 1) Adição de Ac IgG monoclonal contra IgM aos poços da placa 2) Lavagem para retirar os Ac livres 3) Adição da solução com Ac IgM específico a ser pesquisado 4) Lavagem para retirar o Ac não capturado 5) Adiciona-se Ag específico marcado com uma enzima (conjugado) para o Ac pesquisado 6) Lavagem 7) Adição de cromógeno e de substrato. Se o cromógeno for oxidado pela ação da reação enzimática, haverá desenvolvimento de cor
- 22. o Interpretação dos resultados • Intensidade da cor diretamente proporcional à concentração de Acs. • Por ser um ELISA muito utilizado para a detecção de IgM, é capaz de identificar infecções na fase aguda.
- 23. o Aplicações na Medicina Humana e Veterinária • Principalmente usado para a detecção de anticorpos da classe IgM contra os mais diversos antígenos (virais, bacterianos, de protozoários) em todas as doenças em que seja importante identificar o seu recente aparecimento. Apesar de ser mais utilizado para a detecção de IgM, o ELISA de Captura também pode ser utilizado para a dosagem de outros Acs. • Exemplos na Medicina Humana: diagnóstico de rubéola, toxoplasmose, herpesvírus e citomegalia, em suas fases agudas, da gestante (complexo TORCH). • Exemplo na Medicina Veterinária: diagnóstico da Diarréia Bovina Viral (DVB).