O documento discute estratégias de imunodiagnóstico contra infecções virais, incluindo a detecção do agente viral através de cultivo celular, PCR e microscopia eletrônica, e a detecção da resposta imune do corpo através de sorologia, ELISA, western blot e imunofluorescência.

1. Ácidos nucleicos:
UNIVERSIDADE FEDERAL DA BAHIA
INSTITUTO DE CIÊNCIAS DA SAÚDE
Imunodiagnóstico - 2014.2
I
Imunodiagnóstico contra
Infecções Virais
Discente: Guilherme da Rocha Peres

2. Introdução
★ Vírus (do latim virus, "veneno" ou "toxina")
são pequenos agentes infecciosos (20-300
nm de diâmetro) que apresentam genoma
constituído de uma ou várias moléculas de
ácido nucleico (DNA ou RNA), as quais
possuem a forma de fita simples ou dupla.
★ Parasita intra celular obrigatório.

3. Introdução
imagem: http://blogdebiologiainteracaoufpe.blogspot.com.br/2012/05/virus-caracteristicas-gerais-os-virus-n.html

4. Introdução
imagem: http://slideplayer.com.br/slide/294425/

5. Duas estratégias básicas
★ Detecção do Agente
(vírus ou seus efeitos)
★ Detecção da resposta do corpo
(especialmente anticorpos)

6. Duas estratégias básicas
Imagens: http://pt.wikipedia.org/

7. Em busca dos vírus
► Sinais clínicos (visíveis, clínicos, sintomáticos)
► Detecção do vírus, antígenos ou genomas
● Isolamento (+ detecção imunológica)
● Quantificação (contagem de placas, DICC50)
● PCR
● Hemaglutinação (HA)
● ELISA
● Deteção imunológica (IH ou IF)
● Microscopia eletrônica

8. Cultivo e Identificação
● Inoculação em animais
● Inoculação em ovos embrionados
● Cultivos celulares
● Métodos imunoquímicos
● Microscopia eletrônica
Imagem: http://www.scielo.oces.mctes.pt/scielo.php?pid=S0873-21592009000400007&script=sci_arttext

9. Cultivos Celulares
● cultivos primários (células diplóides)
● linhas celulares (diplóide, 40 passagens )
● células de linhagem (passagens indefinidas)
● Microscopia Eletrônica
● Marcação com Imunofluoresência
● Coração com Hematoxilina-eosina (HE)
● Análise do ECP

10. Cultivos Celulares
ref: http://www.scielo.oces.mctes.pt/scielo.php?pid=S0873-21592009000400007&script=sci_arttext

11. Cultivos de vírus in vitro
● Vidro
● Plástico
● Garrafas Fechadas (Ou Abertas (CO2))
● Garrafas Estacionárias Ou Rolantes
● Tubos de vidro ou plástico
● Tubos com lamínulas (tubos de Leighton)
● Placas de microtécnica 6, 12, 24, 96 orifícios

12. Efeito Citopático
É o dano que o vírus causa à célula !
● lise
● arredondamento
● vacuolização
● formação de sincícios
● inclusões
● picnose
● apoptose

13. Efeitos citopáticos virais

14. Efeitos citopáticos virais
ref: http://pt.slideshare.net/livreinatural/c-u-l-t-i-v-o-e-i-s-o-l-a-m-e-n-t-o

15. Efeitos virais
ref: http://www.scielo.br/scielo.php?pid=S0102-09352002000600002&script=sci_arttext

17. Quantificação viral - pfu
ref: http://jvi.asm.org/content/85/21/11183/F8.expansion.html

18. Detecção com HA
ref: http://pathmicro.med.sc.edu/portuguese/immuno-port-chapter7.htm

19. Detecção com HA
ref: http://pathmicro.med.sc.edu/portuguese/immuno-port-chapter7.htm

20. Detecção com ELISA
ref: http://medical-dictionary.thefreedictionary.com/ELISA
ELISA: With antigen
capture ELISA, the wells
are coated with antibody to
the virus. The sample
containing virus (1) is
addedand, after washing
several times, enzyme
conjugated to an antibody
to the virus is added (2).
Finally, after a further cycle
ofwashing, the enzyme's
substrate (3) is added. A
colored product is formed if
the viral antigen is present
in the sample (4). FromHart
and Shears, 1997.

21. Detecção com ELISA
ref: http://medical-dictionary.thefreedictionary.com/ELISA

22. Detecção Imunológica
Imunohistoquímica (IPX) Imunofluorescência
Antigenos de Herpes Virus
em células endoteliais
Herpes Virus em cultivo celular

23. Imunoperoxidase (IPX)
● Material infectado (células ou tecidos)
+ soro específico (ex: soro humano)
+ conjugado anti-IgG
(ex. anti-IgG humana conjugado à peroxidase)
+ substrato apropriado (ex. carbazol)
_______________________________________
= reação colorida

24. Imunoperoxidase (IPX)
Imagens: ref: CIELO

25. Imunofluorescência Direta
Anticorpo marcado sobre material infectado
● material infectado (suspeito)
+ anticorpo específico marcado com FITC
+ luz UV
__________
= reação colorida

26. Imunofluorescência Indireta
Material infectado (células ou tecidos)
+ soro específico (ex: soro humano)
+ conjugado anti-IgG específico (ex. anti-IgG
humana/FITC)
+ luz UV
___________________________________
= reação colorida

27. Western Blot
Imagem: http://www.ufrgs.br/labvir/material

28. PCR
Imagem: http://www.geneaid.com/products/viral-dnarna/virus-dna

29. Principais origens de
DNA/RNA para PCR
Imagem: http://www.geneaid.com/products/viral-dnarna/virus-dna
● Nódulos linfáticos: HIV
● Swab cervical: HIV, HPV
● Sangue total: HIV, CMV
● Plasma, soro: HIV, HTLV, HCV, HBV
● Liquido cefalorraquídeo: enterovirus
● Esputo, saliva, aspirado naso-faríngeo:
● VRS, Influenza
● Materia fecal: Rota

30. PCR
Imagem: http://www.geneaid.com/products/viral-dnarna/virus-dna
Gel de PCR (influenza) Gel de RNA (Rotavírus)
(corante?)

31. RFLPFragmentação de DNA
Imagem: http://forensicsciencenew.blogspot.com.br/2014/03/the-use-of-dna-typing-in-forensic.html

32. Detecção de Anticorpos (2)
► Quando os sinais clínicos já passaram
► Quando houve algum contato com o vírus
► Detecção de anticorpos:
► (usualmente soro ou LCR)
● Soro-neutralização
● Imunodifusão
● Inibição da hemaglutinação (IH)
● Hemaglutinação passiva
● Imunoperoxidase para anticorpos
● Imunofluorescência indireta
● ELISAs (diversos)
● Western blot

33. Detecção de Anticorpos

34. Sorologia/Neutralização
► Diluir o soro seriadamente: ex:
1/2 1/4 1/8 1/16……….1/512
● Adicionar volume igual de vírus (100 DICC50)
● Incubar a 37oC
● Colocar mistura sobre células
● Última diluição que evita multiplicação viral é o título

35. Imunodifusão

36. Western Blot para Ag

37. Imunofluorescência
Indireta para a detecção de anticorpos:
Material infectado conhecido (células ou tecidos)
+ soro suspeito (ex: soro humano)
+ conjugado anti-IgG específico
(ex. anti-IgG humana conjugado à fluoresceína)
+ luz UV
____________________________________
= reação colorida

38. Imunofluorescência
Herpes Vírus

39. ELISA (direta/indireta/bloqueio)
1a
Geração - Indireto (IgG)
Falsos positivos (artrite reumatoide)
2a
Geração - Indireto (IgG)
Melhora espec. | Detecta HIV 1 e 2
3a
Geração - Sandwich - (IgG / IgM)
Boa sensibilidade, baixa títulação
4a
Geração - Proteínas recombinantes
Alta sensibilidade (HIV)

40. Imunocromatografia
*** - HIV

41. Limitações da Sorologia
►Detecta exposição, não quando ela ocorreu !!!
►Para correlação com a doença:
● Soros pareados
● IgM
● Líquido céfalo raquidiano

42. Conclusões e Discussão
● Os vírus constituem uma ameaça a saúde humana,
animal e vegetal há séculos, milênios.
● A erradicação de algumas doenças é fruto do
desenvolvimento científico humano frente a determinados
vírus. (e.g. Póliomielite)
● Pesquisas constantes trazem um avanço no
entendimento, diagnóstico e tratamento de infecções
virais. (e.g. vacinas de DNA viral / HPV)

43. Conclusões e Discussão
● A mutação gênica é um desafio, tanto em infecções
ortólogas quanto parálogas. Confere resistência.
● A ligação de alguns vírus com o câncer, pode ajudar no
controle de cânceres como garganta, útero, etc.
● A Medicina clínica prática é defasada frente ao
desenvolvimento científico. Precisa de celeração.

44. FIM
Perguntas ?
:-)

45. FIM
Obrigado
:-)

46. Referências
LEHNINGER, A. L. Princípios de bioquímica. São Paulo: Savier, 2005.
ALBERTS, Bruce; Alexander Johnson, Julian Lewis, Kazuo, Martin Raff, Keith Roberts,
and Peter Walters. Molecular Biology of the Cell; Fourth Edition. Nova Iorque e
Londres: Garland Science, 2002. ISBN 0-8153-3218-1.
Watson J, Crick F. (1953). "Molecular structure of nucleic acids; a structure for
deoxyribose nucleic acid" (PDF). Nature 171 (4356): 737–8. PMID 13054692.
Gregory S, et al.. (2006). "The DNA sequence and biological annotation of
human chromosome 1".Nature 441 (7091): 315–21.

47. Referências
http://www.ufrgs.br/labvir/material/aulat8.pdf (acesso 08/12/2014)
http://pt.slideshare.net/livreinatural/c-u-l-t-i-v-o-e-i-s-o-l-a-m-e-n-t-o (acesso 06/12/2014)
http://www.scielo.br/scielo.php?pid=S0102-09352002000600002&script=sci_arttext
(acesso 05/12/2014)
http://jvi.asm.org/content/85/21/11183/F8.expansion.html (acesso 08/12/2014)
http://slideplayer.com.br/slide/294425/ (acesso 01/12/2014)
http://pathmicro.med.sc.edu/portuguese/immuno-port-chapter7.htm (acesso
08/12/2014)

48. Referências
http://www.geneaid.com/products/viral-dnarna/virus-dna (acesso 08/12/2014)
http://www.aids.gov.br/pagina/testagem-para-hiv (acesso 08/12/2014)
http://laboratoriocace.com.br/informes,hepatites-virais-a-b-c-d-e-diagnstico-laboratorial,
5.html (acesso 08/12/2014)
http://www.worldhepatitisalliance.org/pt/prevencao-diagnostico-e-tratamento.html
(acesso 08/12/2014)