Este documento descreve os princípios e aplicações da técnica de imunofluorescência. A técnica envolve o uso de anticorpos ou antígenos conjugados a fluorocromos que emitem luz visível quando excitados por radiação UV, permitindo a detecção de antígenos ou anticorpos específicos. A imunofluorescência é usada no diagnóstico de doenças infecciosas e na caracterização de células tumorais.

1. Aula 8 Imunofluorescência Trabalho realizado pelos acadêmicos de Medicina da UFBA Adriana Campos, Nivaldo Cardozo Filho, Sabrina Oliveira e Silvana Asfora, sob orientação dos Professores Roberto Meyer, Ivana Nascimento, Robert Schaer, Cláudia Brodskyn, Songelí Freire e Denise Lemaire, do Laboratório de Imunologia do Instituto de Ciências da Saúde da UFBA. Atualizado em julho de 2003

2. - Princípio da técnica: Anticorpos ou antígenos são conjugados (ligados de modo covalente) a uma substância (fluorocromo), que, quando excitada por radiações UV, emite luz no espectro visível. Assim, como a ligação Ag-Ac é específica, um anticorpo conjugado pode ser usado para detectar um determinado antígeno e vice-versa. A reação é feita em lâminas de mi- croscopia (um pouco mais finas que as comuns) e a obser- vação tem lugar num microcópio com luz UV (microscópio de fluorescência). Principais fluorocromos: fluoresceína (isotiocianato de fluo- resceína – FITC) e rodamina (isotiocianato de tetrametil rodamina – TRICT). Principais modalidades: Imunofluorescência direta e indireta

3. Microscópio de fluorescência com epiluminação (modificado de Stites, Terr e Parslow, 2000) luz UV atinge o ma- terial examinado fluorescência emitida chega ao observador

4. Imunofluorescência Direta Lavagem para retirada dos conjugados não fixados: Adição de anticorpos (em geral monoclonais), conju- gados com um fluo- rocromo. lâmina Montagem da lâmina e observação microscópica Utilização da técnica: muito usada para a detecção direta de mi- crorganismos em secreções, na urina, nas fezes, em cortes de tecidos etc. Também bastante utilizada na fenotipagem de células tumorais Tecido ou esfregaço(com Ag) Tecido ou esfregaço (com Ag)

5. Imunofluorescência Indireta Lavagem para retirada de anticorpos não fixados: Adição de anti-Ac conjugado com fluorocromo: Adição de soro teste, contendo anticorpos específicos contra o Ag em questão. REAÇÃO POSITIVA A lâmina usada possui círculos impressos no vidro, em geral conforme o esque- ma acima, onde estão os an- tígenos. Neles são coloca- dos os controles (positivo e negativo) e os soros testes devidamente diluídos (di- luição seriada). Lâmina Tecido ou esfregaço (com Ag) Tecido ou esfregaço (com Ag)

6. Lavagem para retirada do conjugado não fixado: Montagem da lâmina e observação em microscópio de imunofluorescência de uma reação positiva. Tecido ou esfregaço (com Ag)

7. REAÇÃO NEGATIVA Adição de soro teste que não contem anticorpos específicos para o antígeno em questão Lavagem para retirada de anticorpos não fixados: Adição de anti-Ac conjugado com fluorocromo: Tecido ou esfregaço (com Ag) Tecido ou esfregaço (com Ag)

8. Lavagem para retirada dos conjugados não fixados: Montagem da lâmina e observação microscópica de uma reação negativa Utilização da técnica: a imunofluorescência indireta é muito usada para o diagnóstico sorológico de várias doenças infecciosas como a Doença de Chagas, a SIDA/AIDS, as hepatites etc. É uma técnica onde se consegue alta sensibilidade e especificidade. Apesar de poder detectar anticorpos IgM espe- cíficos, ela é muito útil para o diagnóstico de doenças crônicas, onde a de- tecção de anticorpos IgG ou IgA confirma a suspeita clínica, como na refe- rida Doença de Chagas. Tem como maior desvantagem o uso do microscó- pio de imunofluorescência, cuja a luz é UV, além do fato de ser um teste qualitativo ou semi-quantitativo e nunca quantitativo (quem detecta a reação é o olho humano). Tecido ou esfregaço (com Ag)

9. Visualização pela imunofluorescência Larvas de S. mansoni após reação de imuno- fluorescência direta imunofluorescência com FITC fotografia preto–e-branco de uma cercária, contra a qual se dirigiu anticorpos fluores- ceinados

10. Ac contra Ag tecidual conjugado com rodamina (TRICT) Ac contra Ag tecidual, conjugado com fluoresceína ( FITC ) Anticorpos contra antígenos teciduais conjugados com rodamina e com fluoresceína (obviamente dirigidos contra antígenos diferentes). Mais algumas fotos de imunofluorescência: FIM