Identificação convencional de fungos filamentosos1
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Identificação convencional de fungos filamentosos1
- 1. Identificação convencional de fungos filamentosos e identificação automatizada e convencional de fungos leveduriformes Disciplina: Micologia Médica Profº.: Luís Henrique Acadêmicos: Carlos Alberto; Joilce Portela; Marcos Allan; Maria Inês e Maria Josenilda
- 2. Introdução • Identificação do fungo de maneira ideal seria: Gênero e espécie • O processamento da amostra passa por 3 fases: Pré-analítica Analítica Processamento da amostra • Indicar a coleta • transporte • Processamento • identificação do microrganismo • laudo e estocagem • Estudos • Dados epidemiológicos
- 3. Isolamento do fungo Semear Exame direto Macroscópico Microcultivo/ análise bioquímica Levedura Filamentoso Gram
- 4. Identificação de fungos filamentosos Cultura pura (Cultura mista é uma causa comum de erro) • 1. Exame Macroscópico Textura: algodonosa, velutina, pulverulenta (furfuráceas), penugentas
- 5. Identificação de fungos filamentosos • 1. Exame Macroscópico Relevo: cerebriformes, rugosa, apiculadas, crateriformes Bordas: vários desenhos (franjas) Pigmentação: anverso e reverso/ difusível ou não Tamanho: variável (quantidade e qualidade do substrato)
- 6. Identificação de fungos filamentosos • 2. Exame Microscópico: É a base do diagnóstico da maioria dos fungos filamentosos Se baseia nas diferenças morfológicas das estruturas reprodutivas e na ontogenia dos esporos Os isolados primários e subcultivo devem ser submetidos a avaliação micromorfológica (40x)
- 7. Identificação de fungos filamentosos • 2. Exame Microscópico - 2 técnicas podem ser empregadas: Técnica Material Montagem Exame Microscópico Direto Amostra biológica Material é colocado entre lâmina e lamínula com líquido de montagem apropriado Microcultivo Fragmento da cultura 1ª ou 2ª em meio sólido ou líquido, Material é previamente depositados sobre lâmina e/ou lâminula Lactofenol azul de algodão (hialinos) Lactofenol de Aman/ KOH/NaOH/ (demáceos)
- 8. Identificação de fungos filamentosos • Exame microscópico Direto
- 9. • Agar “cornmeal” • Potato Dextrose Agar (PDA) • SDA Dextrose Agar (SDA) • Agar malte Identificação de fungos filamentosos • Técnica de microcultivo em lâmina (método 1) • 121ºC • 20- 30min • 30ºC • 3-5 dias
- 10. Identificação de fungos filamentosos • Técnica de microcultivo em lâmina (método 1)
- 11. • Resistencia à cicloheximida • Separar as culturas de: Blastomyces dermatitidis, Paracoccidiodes brasiliensis, Histoplasma capsulatum, Sporothrix schenckii, Coccidioides immitis, Epidermophyton floccosum Microsporum ssp., Trichophyton ssp. Observação Meio Resultado Crescimento SDA e Mycosel Resistente Crescimento SDA Sensível Não SDA Repetir Identificação de fungos filamentosos • 30°C • 7 dias Fungos Oportunistas Absidia, Rhizopus, Mucor e Aspergillus fumigatus
- 12. Identificação de fungos filamentosos • 4.Demonstração de balistosporos • Alguns fungos Zygomycetes tem habilidade de produzir balistosporos – dilatação propulsiva Produção de balistosporos Formação espontânea de colônias periféricas (Basidiobolus e Conidiobolus)
- 13. Identificação de fungos filamentosos • 4.Demonstração de balistosporos • 30ºC • 2-3 dias
- 15. Identificação de fungos filamentosos • 5. Teste da Perfuração do fio de cabelo Distinção entre Trichophyton rubrum e T. Mentagrophytes Extrato de levedura (10%) + fio de cabelo + cultura suspeita → incubar 30°C/ 10-14 dias
- 16. . Teste da Perfuração do fio de cabelo Trichophyton mentagrophytes, Hair perforation test is positive. Trichophyton rubrum, Hair perforation test is negative. Perforations
- 17. Identificação de fungos filamentosos • 6. Testes Fisiológicos • Urease • Habilidade de hidrolisar ou não a Uréia • Distinguir isolados atipicos de Trichophyton rubrum (-) e T. Mentagrophytes (+) • Agar usado: Agar uréia Christensen • Tempo: 3-4 dias controle
- 18. Identificação de fungos filamentosos • 7. Dimorfismo Dimórficos são fungos filamentosos que podem, sob determinadas condições, assumir forma de levedura, diminuindo a capacidade de filamentação - colônias aspecto cremoso • Filamentosa a 25-30⁰C • Levedura a 37 ⁰C É um critério útil para identificação desses fungos patogênicos → Temperatura, composição do meio e concentração de CO₂
- 19. Identificação de fungos filamentosos • 7. Dimorfismo Histoplasma capsulatum, Blastomyces dermatitidis, Paracoccidiodes brasiliensis, Sporothrix schenckii, Coccidioides immitis, gênero Emmonsia, Penicillium marneffei
- 20. Técnica de conversão da fase micelial à fase leveduriforme Todos os procedimentos devem ser feitos em câmara de fluxo laminar • Blastomyces dermatitidis e Paracoccidioides brasiliensis • Agar Kelley • Agar semente de algodão • Sporothrix schenckii, Histoplasma capsulatum • BHIB + glicose +cisteína • Sporothrix schenckii, • BHIA Exame direto – hifas em levedura (semanas) • 1º - 30°C 2º - 37°C
- 22. Identificação de fungos leveduriformes • 1 - Exame Macroscópico • Características: Textura Topografia Bordos Coloração meios sólidos Formação de película meios líquidos
- 23. Colônias de cor laranja a vermelha, aspecto cremoso. Rhodothorula spp Macromorfologia (ágar Sabouraud) Ágar Sabouraud: colônias de cor branca a creme, cremosas e lisas. Candida albicans Em ágar sangue, colônias de cor creme, com formação de franjas que lembram “ estrelas”. Candida krusei Colônia rosa Macromorfologia em Chromagar Macromorfologia
- 24. Identificação de fungos leveduriformes • 2 - Exame Microscópico • Preparações diretas e/ou cultivo em lâmina • Célula leveduras • Blastoporos • Blastosporos • Balistosforos • Pseudo-hifas • Tubos germinativos • Clamidosforos • Artrosporos • Ascos • Ascoporos • Cápsulas
- 25. Pseudohifas: abundantes e ramificadas Clamidósporos terminais estruturas arredondadas de parede espessa Blastoconídeos são ovais e formam aglomerados no septo das pseudohifas. Candida albicans Micromorfologia
- 26. Identificação de fungos leveduriformes • Tubo Germinativo • Objetivo: Identificação presuntiva de Candida albicans e C. stellatoidea (incubado com soro humano a 37°C/ 2-3 horas) Descrição Método 1 Método 2 Meio de cultura Soro humano ou animal Clara de ovo Procedimento 0,3 - 0,5mL (tubo de ensaio) → cultura suspeita (idade 18-72h) → incubar a 37°C / 2-3h → Inocular 1gt entre lâmina e lamínula → microscópico Inocular a cultura suspeita em clara de ovo → incubar a 37°C / 2 - 3h → montagem microscópica (tubos germinativos)
- 27. Identificação de fungos leveduriformes • Tubo Germinativo ALMEIDA, G. M. D., et al.
- 28. Identificação de fungos leveduriformes • Demonstração de cápsula • Indicar presuntivamente o agente etiológico – Cryptococcus neoformans (cápsulas em torno da célula) • Realizada com preparações microscópicas com nanquim ou nigrosina • Suspensão de levedura em água destilada + tinta da China + lâmina e lamínula → microscópio
- 29. Identificação de fungos leveduriformes 3 – Testes fisiológicos ou bioquímicos São usados para identificação final deste grupo de fungos Assimilação de carboidratos Assimilação de nitrato Fermentação de carboidratos Teste de Urease → ZIMOGRAMA Sistemas comerciais AUXANOGRAMA }
- 30. Suspensãode células do fungo Solução- padrão= 106 ufc/mL Comparação para ajuste de turbidez: espectrofotômetro ou visual = INÓCULO
- 31. Auxanograma • Presença de oxigênio • Utilização de fontes de: • Carbono (a partir de açúcares) • Nitrogênio (a partir de nitrato)
- 32. Auxanograma • Meio basal sem fonte de carbono • Sólido ou líquido • Yeast Nitrogen Base (YNB)- 40mL • Inóculo: escala 1 McFarland (2mL) • Incorporar suspensão de levedura ao meio • Aplicação de discos ou açúcar in natura • Incubação 30oC por 24-48h
- 34. Auxanograma • Aplicação de compostos nitrogenados • Peptona (controle positivo) • Nitrato de potássio • Incubação 30oC por 24-48 h até 7 dias • Resultados: presença de zona de crescimento (leitura visual)
- 36. Identificação de fungos leveduriformes Teste da Urease Hidrólise da Uréia Cryptococcus neoformans (99%), Rhodotorula e Trichosporon → urease positivo Rápido crescimento em Agar Uréia de Christensen – coloração rosa escuro (30ºC/5 dias) Teste da Urease rápida Controle positivo: C. neoformans
- 37. Identificação de fungos leveduriformes Sistemas Comerciais Manuais Automatizados (Vitek 2, ID 32C ) Para identificação específica de C. albicans São empregados tiras ou cartelas contendo uma série de galerias plásticas com carboidratos desidratados ou outro substrato bioquímico Inoculação nas galerias → incubação (varia de 4h-2-3 dias) → leitura
- 38. Cultura positiva Exame direto Bactéria Levedura Cultura Pura Sim Não Obter Colônia Pura por isolamento Cápsula + Macromorfologia Colônia bege: Criptococcus sp Colônia salmão/laranja: Rhodothorula sp - Tubo Germinativo - + C. albicans Provas Bioquímicas e Cultivo em Lâmina (continua)
- 40. Obrigado!!!
- 41. Bibliografia • LEVY, C. E. Manual de Microbiologia Clínica para o Controle de Infecção em Serviços de Saúde, 1ª edição, Módulo VII, Editora Agência Nacional de Vigilância Sanitária, Campinas SP., 2004. Disponível em: <http://www.anvisa.gov.br/ servicosaude/manuais/ microbiologia.asp>. Acesso em 17/10/12. • SIDRIM, J. J. C.; ROCHA, M. F. G. Micologia Médica à Luz de Autores Contemporâneos, 1ª edição, Guanabara Koogan, 2004. • ZAITZ. C, et al, Compêndio de Micologia Médica, 2º edição, Rio de Janeiro, Guanabara Koogan, 2010.
- 42. • Micologia Médica à Luz de AutoresContemporâneosSidrim JJC, Rocha MFGGuanabara Koogan
Notas do Editor
- Exame direto ou microscopia com coloração → amostras são semeadas em diversos meios de isolamento (achado micológico)
- O talo de um fungo é tipicamente composto por filamentos tubulares microscópicos, chamados hifas. O conjunto de hifas tem o nome de micélio. A parede das hifas é semi-rígida, e os fungos podem apresentar três tipos morfológicos de hifas. O micélio pode formar uma rede frouxa ou um tecido compacto, como nos cogumelos. Além disso, os micélios podem ser vegetativos ou de reprodução, sendo estes responsáveis pela produção de esporos. As hifas dos micélios de reprodução são, em geral, aéreas, enquanto algumas hifas do micélio vegetativo podem penetrar no meio, em busca de nutrientes. ESTRUTURA DOS FUNGOS Os fungos podem se desenvolver em meios de cultivo especiais formando colônias de dois tipos: – leveduriformes; – filamentosas. As colônias leveduriformes são pastosas ou cremosas, formadas por microrganismos unicelulares que cumprem as funções vegetativas e reprodutivas. As colônias filamentosas podem ser algodonosas, aveludadas ou pulverulentas; são constituídas fundamentalmente por elementos multicelulares em forma de tubo—as hifas. As hifas podem ser contínuas ou cenocíticas e tabicadas ou septadas. Possuem hifas septadas os fungos das Divisões Ascomycota, Basidiomycota e Deuteromycota e hifas cenocíticas, os das Divisões Mastigomycota e Zygomycota. Ao conjunto de hifas, dá-se o nome de micélio. O micélio que se desenvolve no interior do substrato, funcionando também como elemento de sustentação e de absorção de nutrientes, é chamado de micélio vegetativo. O micélio que se projeta na superficie e cresce acima do meio de cultivo é o micélio aéreo. Quando o micélio aéreo se diferencia para sustentar os corpos de frutificação ou propágulos, constitui o micélio reprodutivo. Os propágulos ou órgãos de disseminação dos fungos são classificados, segundo sua origem, em externos e intemos, sexuados e assexuados. Embora o micélio vegetativo não tenha especificamente funções de reprodução, alguns fragmentos de hifa podem se desprender do micélio vegetativo e cumprir funções de propagação, uma vez que as células fúngicas são autônomas. Estes elementos são denominados de taloconídios e compreendem os: – blastoconídios, – artroconídios – clamidoconídios. Os blastoconídios, também denominados gêmulas, são comuns nas leveduras e se derivam por brotamento da célula-mãe. As vezes, os blastoconídios permanecem ligados à célula-mãe, formando cadeias, as pseudo-hifas, cujo conjunto é o pseudomicélio. Os artroconídios são formados por fragmentação das hifas em segmentos retangulares. São encontratos nos fungos do gênero Geotrichum, em Coccidioides immitis e em dermatófitos Os clamidoconídios têm função de resistência, semelhante a dos esporos bacterianos. São células, geralmente arredondadas, de volume aumentado, com paredes duplas e espessas, nas quis se concentra o citoplasma. Sua localização no micélio pode ser apical ou intercalar. Formam-se em condições ambientais adversas, como escassez de nutrientes, de água e temperaturas não favoráveis ao desenvolvimento fúngico. Entre outras estruturas de resistência devem ser mencionados os esclerócios ou esclerotos, que são corpúsculos duros e parenquimatosos, formados pelo conjunto de hifas e que permanecem em estado de dormência, até o aparecimento de condições adequadas para sua germinação. São encontrados em espécies de fungos das Divisões Ascomycota, Basidiomycota e Deuteromycota.
- Vantagem: Permite estudo imediato das características micromorfológicas dos fungos recuperados Desvantagem: Manipulação pode dificultar ou impedir a identificação dos isolados
- T. Mentagrophy invade a bainha e perfura o outro não
- T. Mentagrophy invade a bainha e perfura o outro não
- Textura (pastosa ou mucóide) Topografia (lisa ou rugóide) Bordos (franjas filamentosas em torno da margem da colônia de algumas espécies) Coloração → meios sólidos
- o controle positivo aqui é o C. neoformans porque tem a urease pré-formada e dá um positivo em 4 horas; a cor rosa choque deve-se ao indicador vermelho de fenol que devido ao amoníaco formado da hidrólise da ureia muda para esta cor (inicialmente é alaranjado); a Rodhotorula dá um positivo em 24h e o Trichosporon é mais lento só dando ao fim de 72h; a leitura está na tabela mais à frente.