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Carregado porRicardo Portela
ICSA17 Imunologia (Prática) - Anticorpos monoclonais
O documento descreve o método de produção de anticorpos monoclonais através da fusão de linfócitos B com células de mieloma imortalizadas, resultando em hibridomas que secretam anticorpos idênticos. Os anticorpos monoclonais têm diversas aplicações em imunodiagnóstico, biologia celular, imunoterapia e pesquisa.
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ICSA17 Imunologia (Prática) - Anticorpos monoclonais
- 1.
- 2. Os anticorpos quesurgem num animal em resposta a um único antígeno complexo são heterogêneos. São formados vários clones diferentes de células B que diferenciam-se em plasmócitos, cada um deles expressando e secretando, respectivamente, um tipo de anticorpo, capaz de reagir com um diferente epítopo no antígeno complexo. Estes anticorpos são denominados policlonais. linfócitos/plasmócitos ... anticorpos antígeno
- 3. Os anticorpos quesurgem a partir de um único clone de células, como, por exemplo, num tumor de plasmócitos (mieloma) são homogêneos, isto é, são iguais entre si. São ditos anticorpos monoclonais. Esse histograma mostra uma distribuição típica de afinidades de anticorpos em um antissoro para um determinante antigênico comparando-as com a afinidade única com que um anticorpo monoclonal se liga ao seu determinante antigênico. Anticorpo monoclonal Afinidade de anticorpo (K) Fração de anticorpo total (%) (escala log) Plasmócitos derivados de um único linfócito B pro- duzem anticorpos monoclonais, portanto idênticos entre si.
- 4. Anticorpos Policlonal Monoclonal Anticorpos quesão coletados do soro de animais inoculados reconhece múltiplos sítios antigênicos do material inoculado Um hibridoma individual de linfócito B é clonado e cultivado em meio de cultivo reconhece um sítio antigênico do material inoculado
- 5. & Anticorpos monoclonais -1975 PrêmioNobel - 1984 Georges Köhler (1946-1995) Cesar Milstein (1927-2002)
- 6. Anticorpos monoclonais epoliclonais
- 8. Pure single Ab Afterimmunization, the mouse spleen contains B cells producing specific antibodies. Each B cell produces only one kind of antibody, which binds to its specific antigen. Conventional antiserum is the mixture of all antibodies produced by B cells from spleen. If a single B cell was picked up and cultured, then it will produce only one kind of antibody. But B cell can not survive well in the culture. Myeloma cell can be cultured in the test tube, but can not produce useful antibody.Each hybridoma line can produce pure single antibody, called monoclonal antibody.If B cell is fused with myeloma, the fused cell might be cultured and produce antibody. 1 2 3 4 m m m m 1 2 3 4 1 2 3 4 Monoclonal antibodies Cell fusion Spleen cells + Myeloma x Antiseum Antigen Immunization A mixture of all Ab 1 23 4 BA LB/c 1 2 3 4 1 23 4 B cell
- 9. O método envolvefusão celular (ou hibridização de células somáticas), entre um linfócito B normal produtor de anticorpo e uma linhagem de mieloma , seguindo-se subsequentemente a seleção de células fusionadas que secretem anticorpo da especificidade desejada , derivada do linfócito B normal. Tais linhagens celulares imortalizadas, produtoras de anticorpos e derivados de fusões, são chamadas hibridomas. Os anticorpos que elas produzem são anticorpos monoclonais Células do baço isoladas de camundongo imunizado com antígeno X. Método de produção de anticorpo monoclonal (tecnologia dos hibridomas) Antígeno X Os monoclo- nais têm sido produzidos prin- cipalmente em camundongos. Veja a seguir
- 10. Mistura de célulasdo baço incluindo algumas produtoras de anticorpos anti -X Linhagem tumoral de mieloma mutante, imortalizada e não cresce em meio seletivo (HAT). É incapaz de produzir anticorpos. Fusão in vitro Mistura de células fusionadas e não fusionadas. Seleção in vitro em meio de cultivo - HAT
- 11.
- 13. Pesquisa de anticorpoanti- X nos sobrenadantes para posterior expansão dos clones positivos Hibridomas produzindo anti corpo anti- X (Ac monoclonal anti-X). . Somente células fusionadas híbridas (hibridomas) crescem. Preparada a diluição no cultivo de modo que em cada poço fique só uma célula mãe /clone.
- 14. Diluição Limitante •Um clonepor poço •Certeza de que um tipo de clone está proliferando em um poço •Teste de detecção •Diluição limitante •Teste de detecção •Expansão – produção dos AcMo
- 16. O sucesso dessatécnica depende do desenvolvimento das linhagens de mieloma que cresçam em meio normal de cultura mas não cresçam em um meio seletivo (HAT - hipoxantina, aminopterina e timidina), porque lhes faltam genes funcionais, necessários para a síntese de DNA pela via de salvação (genes que codificam as enzimas TK e HGPRT). Esses genes estão presentes nas células normais, de modo que somente os híbridos e os linfócitos B continuam a crescer no meio seletivo.
- 17. Após a fusão,a aminopterina presente no meio bloqueia a síntese de DNA pela via de novo. As células podem então utilizar a via de salvação, já que o meio é suplementado com timidina e hipoxantina. Como as linhagens mutantes, não expressam as enzimas necessárias para a referida via de salvação, não vão conseguir sobreviver nesse meio. Como os linfócitos normais possuem vida curta em cultura, somente os clones híbridos sobreviverão e proliferarão secretando anticorpos com a especificidade da célula mãe que cresceu sozinha e foi selecionada no poço no início do procedimento.
- 18. Via de novo Fosforribosil pirofosfato + Uridilato Nucleotídeos Viade salvação Timidina Hipoxantina timidina cinase (TK) hipoxantina guanina fosforribosil transferase (HGPRT)bloqueio com aminopterina Veja um resumo dos dois caminhos possíveis para a síntese de nucleotídeos pela célula. Se a via de novo estiver bloqueada (como abaixo), só resta a via de salvação:
- 19. Vias de síntesede nucleotídeos
- 20. A hibridização delinfócitos é o melhor método para produzir um anticorpo monoclonal contra um determinante antigênico conhecido. Este anticorpo pode ser usado para identificar antígenos desconhecidos presentes numa mistura, porque cada anticorpo é específico para apenas um determinante antigênico . Algumas das aplicações mais comuns dos anticorpos monoclonais incluem as que se seguem.
- 21. 2. Imunodiagnóstico: odiagnóstico de muitas doenças infecciosas e degenerativas, depende da detecção de antí- genos e/ou anticorpos específicos na circulação ou nos tecidos, usando anticorpos monoclonais em imunoensaios. anticorpos monoclonais soro do paciente contendo antígeno com vários epitopos idênticos aglutinação partículas de latex adsorvidas com os monoclonais Exemplo: reação de aglutinação em latex Para a imunodosagem de hormônios, marcadores tumorais e de outras proteínas séricas, sempre se usa anticorpos monoclonais
- 22. Anticorpos Monoclonais -Utilidades Imunodiagnóstico/Sorologia
- 23. 4. Análise funcionalde moléculas da superfície celular e secretadas: na pesquisa imunológica, os anticorpos monoclonais que se ligam a moléculas da superfície celular e estimulam ou inibem funções celulares, são instrumentos inestimáveis para definir a função das moléculas de superfície, incluindo os receptores para antígenos . Anticorpos que neutralizam citocinas são usados para detectar a presença e os papéis funcionais destes compostos proteicos in vitro e in vivo .
- 24. 1. Identificação demarcadores fenotípicos únicos para os tipos celulares individuais. A base para a classificação moderna de linfócitos e fagócitos mononucleares é a ligação de anticorpos monoclonais população específicos . Estes têm sido usados para definir moléculas típicas de cada célula. CD3 TCR CD2 CD28 CD5 CD7 CD4 CD8 Th Tc MFR CD64 CD32 CD16 HLA-D CD35 CD11b LFA-1 Macrófago
- 25. Anticorpos Monoclonais -Utilidades Imunologia Celular
- 26. Subpopulações celulares podemser separadas usando MoAc acoplados a beads magnéticas
- 27. Miosina Actina Tubulina Anticorpos Monoclonais -Utilidades Biologia Celular
- 28. Filaments and Tubulesof the Cytoskeleton Microfilaments Microtubules Intermediate Filaments FilaTube (Fig 1-20, ESB 1998) MAbCytSkel Anti-actin Antibody with bound rhodamine fluorescent label Anti-tubulin antibody with bound fluorescein label Anti-vimentin? Antibody with bound blue fluorescent label
- 29. Anticorpos Monoclonais -Utilidades Imunoterapia
- 30. Tratamento de tumorescom MoAc
- 31. 3.Diagnóstico e terapiade tumores: anticorpos monoclonais específicos para tumores são usados para a detecção de tumores por técnicas de imagens e para a imunoterapia.
- 32. Imunotoxinas Anticorpos conjugados atoxinas waynesword.palomar.edu/ images/antibod2.gif (Ricina) Anticorpo tumor-es
- 33. Somente a célulatumoral é afetada pela toxina
- 34. Radioimunoterapia Célula Tumoral Anticorpos conjugadoscom radioisótopos
- 35.
- 36.
- 37.
- 38.
- 39. Anticorpos humanizados Anti-CD20 MAbs(Rituxan) for treatment of non-Hodgkin’s lymphoma
- 40. Fragmentos Fv inFv O tamanho e a especificidade dos fragmentos Fv podem Ajudar no reconhecimento de sítios crípticos
- 41. http://www.sh.lsuhsc.edu/ intragrad/micro/micro297/4 Xenocamundongo (camundongo com locide imunoglobulina humana)
- 42. A Biologia Moleculartem traçado o caminho para a produção de anticorpos monoclonais (mAc) de especificidade, afinidade e isotipos definidos. Isto permite aos imunologistas o desenvolvi- mento de anticorpos de determinada especificidade no camundongo, utilizando-se então os genes que expressam esta especificidade (genes que codificam VH e VL), para a construção de vetores de clona- gem e expressão, associando-os aos genes para os domínios constantes de anticorpos humanos. O mAc resultante (humanizado) é de muito baixa imunogenicidade para a nossa espécie, podendo ser utilizado em tratamentos específicos. FIM