Aula prática de Anticorpos monoclonais

1. Anticorpos
monoclonais

2. Os anticorpos que surgem num animal em resposta a um
único antígeno complexo são heterogêneos. São
formados vários clones diferentes de células B que
diferenciam-se em plasmócitos, cada um deles
expressando e secretando, respectivamente, um tipo de anticorpo,
capaz de reagir com um diferente epítopo no antígeno complexo.
Estes anticorpos são denominados policlonais.
linfócitos/plasmócitos
...
anticorpos
antígeno

3. Os anticorpos que surgem a partir de um único clone de
células, como, por exemplo, num tumor de plasmócitos
(mieloma) são homogêneos, isto é, são iguais entre si.
São ditos anticorpos monoclonais.
Esse histograma mostra uma distribuição típica de afinidades
de anticorpos em um antissoro para um determinante
antigênico comparando-as com a afinidade única com que
um anticorpo monoclonal se liga ao seu determinante
antigênico.
Anticorpo monoclonal
Afinidade de anticorpo (K)
Fração de
anticorpo
total (%)
(escala log)
Plasmócitos derivados de
um único linfócito B pro-
duzem anticorpos monoclonais,
portanto idênticos entre si.

4. Anticorpos
Policlonal Monoclonal
Anticorpos que são coletados
do soro de animais inoculados
reconhece
múltiplos sítios antigênicos
do material inoculado
Um hibridoma individual de linfócito B é
clonado e cultivado em meio de cultivo
reconhece
um sítio antigênico
do material inoculado

5. &
Anticorpos monoclonais -1975
Prêmio Nobel - 1984
Georges Köhler
(1946-1995)
Cesar Milstein
(1927-2002)

6. Anticorpos monoclonais e policlonais

8. Pure single Ab
After immunization, the mouse spleen contains B cells producing specific antibodies.
Each B cell produces only one kind of antibody, which binds to its specific antigen.
Conventional antiserum is the mixture of all antibodies produced by B cells from spleen.
If a single B cell was picked up and cultured, then it will produce only one kind of antibody.
But B cell can not survive well in the culture.
Myeloma cell can be cultured in the test tube, but can not produce useful antibody.Each hybridoma line can produce pure single antibody, called monoclonal antibody.If B cell is fused with myeloma, the fused cell might be cultured and produce antibody.
1
2
3
4
m
m
m
m
1
2 3
4
1 2 3 4
Monoclonal
antibodies
Cell fusion
Spleen cells
+
Myeloma
x
Antiseum
Antigen
Immunization
A mixture of all Ab
1 23 4
BA LB/c
1 2 3 4
1 23 4
B cell

9. O método envolve fusão celular (ou hibridização de células
somáticas), entre um linfócito B normal produtor de anticorpo
e uma linhagem de mieloma , seguindo-se subsequentemente
a seleção de células fusionadas que secretem anticorpo da
especificidade desejada , derivada do linfócito B normal. Tais
linhagens celulares imortalizadas, produtoras de anticorpos
e derivados de fusões, são chamadas hibridomas. Os anticorpos
que elas produzem são anticorpos monoclonais
Células do baço isoladas de camundongo
imunizado com antígeno X.
Método de produção de anticorpo monoclonal
(tecnologia dos hibridomas)
Antígeno X
Os monoclo-
nais têm sido
produzidos prin-
cipalmente em
camundongos.
Veja a seguir

10. Mistura de células do baço incluindo algumas
produtoras de anticorpos anti -X
Linhagem tumoral de mieloma mutante,
imortalizada e não cresce em meio
seletivo (HAT). É incapaz de produzir
anticorpos.
Fusão in vitro
Mistura de células fusionadas e não fusionadas.
Seleção in vitro em meio de cultivo - HAT

11. Hybridoma

13. Pesquisa de anticorpo anti- X nos sobrenadantes para posterior expansão dos clones positivos
Hibridomas produzindo anti corpo anti- X (Ac monoclonal anti-X).
.
Somente células
fusionadas
híbridas
(hibridomas)
crescem.
Preparada a diluição no cultivo de modo que em cada poço fique só uma célula mãe /clone.

14. Diluição Limitante
•Um clone por poço
•Certeza de que um tipo de clone está proliferando
em um poço
•Teste de detecção
•Diluição limitante
•Teste de detecção
•Expansão – produção dos AcMo

16. O sucesso dessa técnica depende do desenvolvimento das
linhagens de mieloma que cresçam em meio normal de cultura
mas não cresçam em um meio seletivo (HAT - hipoxantina,
aminopterina e timidina), porque lhes faltam genes funcionais,
necessários para a síntese de DNA pela via de salvação (genes que
codificam as enzimas TK e HGPRT). Esses genes estão presentes
nas células normais, de modo que somente os híbridos e os
linfócitos B continuam a crescer no meio seletivo.

17. Após a fusão, a aminopterina presente no meio bloqueia a
síntese de DNA pela via de novo. As células podem então
utilizar a via de salvação, já que o meio é suplementado com
timidina e hipoxantina. Como as linhagens mutantes, não
expressam as enzimas necessárias para a referida via de
salvação, não vão conseguir sobreviver nesse meio. Como os
linfócitos normais possuem vida curta em cultura, somente
os clones híbridos sobreviverão e proliferarão secretando
anticorpos com a especificidade da célula mãe que cresceu
sozinha e foi selecionada no poço no início do procedimento.

18. Via de novo
Fosforribosil
pirofosfato
+
Uridilato
Nucleotídeos
Via de salvação
Timidina Hipoxantina
timidina cinase (TK)
hipoxantina
guanina
fosforribosil
transferase
(HGPRT)bloqueio com
aminopterina
Veja um resumo dos dois caminhos possíveis para
a síntese de nucleotídeos pela célula. Se a via de
novo estiver bloqueada (como abaixo), só resta a via
de salvação:

19. Vias de síntese de nucleotídeos

20. A hibridização de linfócitos é o melhor método
para produzir um anticorpo monoclonal
contra um
determinante antigênico conhecido. Este
anticorpo pode ser usado para
identificar antígenos desconhecidos presentes
numa mistura,
porque cada anticorpo é específico para
apenas um
determinante antigênico . Algumas das
aplicações mais
comuns dos anticorpos monoclonais incluem
as que se seguem.

21. 2. Imunodiagnóstico: o diagnóstico de muitas doenças
infecciosas e degenerativas, depende da detecção de antí-
genos e/ou anticorpos específicos na circulação ou nos
tecidos, usando anticorpos monoclonais em imunoensaios.
anticorpos
monoclonais
soro do paciente
contendo antígeno
com vários epitopos
idênticos
aglutinação
partículas de latex
adsorvidas com os
monoclonais
Exemplo: reação de aglutinação em latex
Para a imunodosagem de hormônios,
marcadores tumorais e de outras
proteínas séricas, sempre se usa
anticorpos monoclonais

22. Anticorpos Monoclonais - Utilidades
Imunodiagnóstico/Sorologia

23. 4. Análise funcional de moléculas da superfície celular e
secretadas: na pesquisa imunológica, os anticorpos
monoclonais que se ligam a moléculas da superfície celular
e estimulam ou inibem funções celulares, são instrumentos
inestimáveis para definir a função das moléculas de
superfície, incluindo os receptores para antígenos .
Anticorpos que neutralizam citocinas são usados para
detectar a presença e os papéis funcionais destes compostos
proteicos in vitro e in vivo .

24. 1. Identificação de marcadores fenotípicos únicos para os
tipos celulares individuais. A base para a classificação
moderna de linfócitos e fagócitos mononucleares é a ligação
de anticorpos monoclonais população específicos . Estes têm
sido usados para definir moléculas típicas de cada célula.
CD3
TCR
CD2
CD28
CD5
CD7
CD4
CD8
Th
Tc
MFR
CD64
CD32
CD16
HLA-D
CD35
CD11b
LFA-1
Macrófago

25. Anticorpos Monoclonais - Utilidades
Imunologia Celular

26. Subpopulações celulares podem ser separadas usando
MoAc acoplados a beads magnéticas

27. Miosina
Actina
Tubulina
Anticorpos Monoclonais - Utilidades
Biologia Celular

28. Filaments and Tubules of the Cytoskeleton
Microfilaments Microtubules Intermediate Filaments
FilaTube (Fig 1-20, ESB 1998) MAbCytSkel
Anti-actin Antibody
with bound rhodamine
fluorescent label
Anti-tubulin antibody with
bound fluorescein label Anti-vimentin? Antibody
with bound blue fluorescent
label

29. Anticorpos Monoclonais - Utilidades
Imunoterapia

30. Tratamento de tumores com MoAc

31. 3.Diagnóstico e terapia de tumores:
anticorpos monoclonais
específicos para tumores são usados
para a detecção de
tumores por técnicas de imagens e
para a imunoterapia.

32. Imunotoxinas
Anticorpos conjugados a toxinas
waynesword.palomar.edu/ images/antibod2.gif
(Ricina)
Anticorpo tumor-es

33. Somente a célula tumoral é afetada
pela toxina

34. Radioimunoterapia
Célula Tumoral
Anticorpos conjugados com
radioisótopos

35. Radioimunoterapia

36. www.stjosephs-marshfield.org/
Radioimunodiagnóstico

37. Anticorpos monoclonais quiméricos

38. Anticorpos monoclonais quiméricos

39. Anticorpos humanizados
Anti-CD20 MAbs (Rituxan) for treatment of non-Hodgkin’s lymphoma

40. Fragmentos Fv in Fv
O tamanho e a especificidade dos fragmentos Fv podem
Ajudar no reconhecimento de sítios crípticos

41. http://www.sh.lsuhsc.edu/
intragrad/micro/micro297/4
Xenocamundongo
(camundongo com loci de
imunoglobulina humana)

42. A Biologia Molecular tem traçado o caminho para a
produção de anticorpos monoclonais (mAc) de
especificidade, afinidade e isotipos definidos.
Isto permite aos imunologistas o desenvolvi-
mento de anticorpos de determinada especificidade no
camundongo, utilizando-se então os genes que expressam
esta especificidade (genes que codificam VH e VL),
para a construção de vetores de clona-
gem e expressão, associando-os aos genes para
os domínios constantes de anticorpos humanos.
O mAc resultante (humanizado) é de muito baixa
imunogenicidade para a nossa espécie, podendo ser
utilizado em tratamentos específicos.
FIM