Imunodiagnóstico

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Imunodiagnóstico

  1. 1. MÉTODOS LABORATORIAIS UTILIZANDO ANTICORPOS
  2. 2. 1- INTRODUÇÃO POR QUE UTILIZAR ANTICORPOS? QUAIS AS CARACTERÍSTICAS BÁSICAS E FUNDAMENTOS DOS ENSAIOS QUE UTILIZAM ANTICORPOS?
  3. 3. 1- INTRODUÇÃO <ul><li>1.1- Principais características das Respostas Imunes Adquiridas: </li></ul><ul><li>Especificidade </li></ul><ul><li>Diversidade </li></ul><ul><li>Memória </li></ul><ul><li>Especialização </li></ul><ul><li>Autolimitação </li></ul><ul><li>Não reatividade ao próprio </li></ul>
  4. 4. 1- INTRODUÇÃO <ul><li>1.1- Principais características das Respostas Imunes Adquiridas: </li></ul><ul><li>Especificidade – conferida por duas moléculas principais: </li></ul><ul><li>- TCR – presente na membrana de linfócitos; </li></ul><ul><li>- Anticorpos – produzidos por linfócitos B, presentes na membrana de linfócitos B e na forma secretada, solubilizados em diversos fluidos corporais. </li></ul>
  5. 5. 1- INTRODUÇÃO <ul><li>1.2- Principais isotipos de anticorpos </li></ul><ul><li>IgM </li></ul><ul><li>IgG </li></ul><ul><li>IgA </li></ul><ul><li>IgE </li></ul><ul><li>IgD </li></ul>
  6. 6. 1- INTRODUÇÃO <ul><li>1.2- Principais isotipos de anticorpos: </li></ul><ul><li>IgM </li></ul><ul><li>IgG – encontrado em maior concentração no soro, de obtenção mais fácil, sofre maturação de afinidade </li></ul><ul><li>IgA </li></ul><ul><li>IgE </li></ul><ul><li>IgD </li></ul>
  7. 7. 1- INTRODUÇÃO <ul><li>1.3- Principais características dos Ensaios que utilizam Anticorpos: </li></ul><ul><li>- Especificidade : Característica que indica que o teste em questão identificará somente o antígeno ou o anticorpo desejado. </li></ul><ul><li>Quanto MAIOR a especificidade, MENOR a ocorrência de resultados falsos-positivos, MENOR a ocorrência de reações cruzadas. </li></ul><ul><li>Dependente do tipo de anticorpo e antígeno empregado no teste, e do sistema de detecção da interação Ag-Ac. </li></ul>
  8. 8. 1- INTRODUÇÃO <ul><li>1.3- Principais características dos Ensaios que utilizam Anticorpos: </li></ul><ul><li>- Sensibilidade: Característica inerente ao método estreitamente relacionada com a quantidade mínima de antígeno ou anticorpo que poderá ser detectada </li></ul><ul><li>Estreitamente ligada ao sistema de amplificação e detecção da interação Ag-Ac. </li></ul><ul><li>Métodos enzimáticos, radioativos, fluorescentes, quimioluminescentes. </li></ul>
  9. 9. 1- INTRODUÇÃO <ul><li>1.4- Fatores a serem analisados na escolha do método: </li></ul><ul><li>Sensibilidade; </li></ul><ul><li>Especificidade (confiabilidade de resultados); </li></ul><ul><li>Custo; </li></ul><ul><li>Disponibilidade de material; </li></ul><ul><li>Segurança; </li></ul><ul><li>Aplicabilidade à amostra disponível, Ag/Ac a ser detectado e espécie animal a ser analisada; </li></ul><ul><li>Tempo de realização do método. </li></ul>
  10. 10. 1- INTRODUÇÃO <ul><li>1.5 – Aplicações dos métodos: </li></ul><ul><li>- Identificação e/ou quantificação de moléculas específicas em fluidos biológicos; </li></ul><ul><li>Purificação de proteínas; </li></ul><ul><li>Diagnóstico de doenças auto-imunes, infecciosas e hipersensibilidades; </li></ul><ul><li>Identificação de genes e seus produtos; </li></ul><ul><li>Localização de moléculas específicas em células e tecidos. </li></ul>
  11. 11. 2- PRINCIPAIS MÉTODOS LABORATORIAIS HISTÓRICO CARACTERÍSTICAS GERAIS DOS PRINCIPAIS MÉTODOS LABORATORIAIS QUE EMPREGAM ANTICORPOS VANTAGENS E DESVANTAGENS DOS MÉTODOS de
  12. 12. 2- PRINCIPAIS MÉTODOS LABORATORIAIS <ul><li>2.1 - Imunoaglutinação/Imunoprecipitação : Primeiros testes a serem desenvolvidos: </li></ul><ul><li>Realizados em meio líquido; </li></ul><ul><li>Exigem alta quantidade de Ac/Ag para sua realização – Baixa Especificidade; </li></ul><ul><li>Não possuem metodologias eficazes para a detecção da interação Ag/Ac – Baixa Sensibilidade. </li></ul>
  13. 13. 2- PRINCIPAIS MÉTODOS LABORATORIAIS <ul><li>2.2- Imunodifusão : Interação Ag/Ac realizada em meio sólido (gél de ágar). </li></ul><ul><li>Diversos tipos: </li></ul><ul><li>Imunodifusão Radial Simples - Ag ou Ac imobilizado no gel – Migração do Ag ou Ac da solução teste no gel, até atingir região de concentração equivalente; </li></ul><ul><li>- Imunodifusão Dupla e Outcherlony – Ambos Ag e Ac migram no gel, formação de banda na região de equivalência. </li></ul>
  14. 14. 2- PRINCIPAIS MÉTODOS LABORATORIAIS <ul><li>2.2- Imunodifusão : Memória </li></ul><ul><li>Não reatividade ao próprio </li></ul>
  15. 15. 2- PRINCIPAIS MÉTODOS LABORATORIAIS <ul><li>2.2- Imunodifusão : </li></ul><ul><ul><li>Vantagens – Método de fácil execução, tempo curto de realização, baixo custo, não necessita de aparato sofisticado </li></ul></ul><ul><ul><li>Desvantagens – Baixa sensibilidade, especificidade, difícil preservação do gel, não aplicável a alguns isotipos de imunoglobulinas. </li></ul></ul><ul><ul><li>- Pouco utilizado atualmente como ferramenta de imunodiagnóstico. Empregado como controle em produção de policlonais. </li></ul></ul><ul><li>Não reatividade ao próprio </li></ul>
  16. 16. 2- PRINCIPAIS MÉTODOS LABORATORIAIS <ul><li>2.3- Hemoaglutinação – Utiliza hemácias sensibilizadas com Ags na membrana, que formam complexos de alto peso molecular quando incubadas com Acs específicos para os antígenos. </li></ul><ul><li>- Permite maior diluição da solução teste que a Imunodifusão. Forma complexos mais pesados, que precipitam com maior velocidade e facilidade: Melhoria da detecção da interação entre Ag-Ac; </li></ul><ul><li>Variações no método: Inibição da Hemoaglutinação. </li></ul><ul><li>Não reatividade ao próprio </li></ul>
  17. 17. 2- PRINCIPAIS MÉTODOS LABORATORIAIS <ul><li>2.3- Hemoaglutinação: </li></ul><ul><li>Memória </li></ul><ul><li>Não reatividade ao próprio </li></ul>
  18. 18. 2- PRINCIPAIS MÉTODOS LABORATORIAIS <ul><li>2.3- Hemoaglutinação: </li></ul><ul><li>Vantagens: Método simples, de fácil execução, baixo custo, rápido; </li></ul><ul><li>Desvantagens: Baixa sensibilidade e especificidade, devido a mal armazenamento das hemácias, pode-se obter resultados falso-negativos. </li></ul><ul><li>Memória </li></ul><ul><li>Não reatividade ao próprio </li></ul>
  19. 19. 2- PRINCIPAIS MÉTODOS LABORATORIAIS <ul><li>2.4- Fixação do Complemento: Variação da técnica de Hemoaglutinação, onde utiliza-se a capacidade citolíca do Sistema de Complemento para amplificar a detecção da interação Ag/Ac. </li></ul><ul><li>Variações da técnica: Inibição da Fixação do Complemento. </li></ul>
  20. 20. 2- PRINCIPAIS MÉTODOS LABORATORIAIS 2.4- Fixação do Complemento:
  21. 21. 2- PRINCIPAIS MÉTODOS LABORATORIAIS <ul><li>2.4- Fixação do Complemento: </li></ul><ul><li>Vantagens: Maior sensibilidade do que a Hemoaglutinação, rápida execução, baixo custo; </li></ul><ul><li>Desvantagens: Devido a problemas na preservação do Complemento, e na sua estabilidade, problemas de falso negativos podem ocorrer. </li></ul>
  22. 22. 2- PRINCIPAIS MÉTODOS LABORATORIAIS <ul><li>2.5- ELISA (Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay) – Técnica que utiliza Ag/Ac imobilizado em placa de polímero de carbono, e anticorpo conjugado a uma enzima, a qual, após agir sobre seu substrato em presença de substância cromógena, amplificará a detecção da interação Ag/Ac através da formação de cor; </li></ul><ul><li>Variações da Técnica: ELISA Quimioluminescente, ELISA Fluorescente, ELISA Radioativo </li></ul>
  23. 23. 2- PRINCIPAIS MÉTODOS LABORATORIAIS 2.5- ELISA: Sanduíche Competição
  24. 24. 2- PRINCIPAIS MÉTODOS LABORATORIAIS 2.5.1- ELISA Indireto:
  25. 25. Outros componentes do soro ELISA “SANDWICH” Antígeno a ser dosado Anticorpo primário Anticorpo conjugado TMB Enzima Peroxidase
  26. 26. ELISA DE COMPETIÇÃO Outros componentes do soro Antígeno a ser dosado Anticorpo primário Antígeno biotinilado TMB ST-AV- Peroxidase
  27. 27. ELISA DE CAPTURA Anticorpo anti-IgM IgM a ser detectada IgM inespecífica Antígeno biotinilado TMB ST-AV- Peroxidase
  28. 28. ELISA INDIRETA Antígeno purificado IgM a ser detectada IgM inespecífica Anticorpo conjugado TMB
  29. 29. 2- PRINCIPAIS MÉTODOS LABORATORIAIS 2.5.2- Quantificação de Ag/Ac em ELISA:
  30. 30. 2- PRINCIPAIS MÉTODOS LABORATORIAIS <ul><li>2.5- ELISA: </li></ul><ul><li>Vantagens: Método altamente sensível e específico, com alto grau de confiabilidade como ensaio quantitativo, custo baixo a médio. </li></ul><ul><li>Desvantagens: Devido a alta sensibilidade, pequenas variações de pipetagem e tempo de incubação podem ocasionar resultados alterados; em extratos de antígenos, não se pode precisar a qual antígeno houve a resposta; ELISA de competição muito susceptível a erros de manipulação. </li></ul>
  31. 31. 2- PRINCIPAIS MÉTODOS LABORATORIAIS <ul><li>2.6- Imunofluorescência / Imunohistoquímica: Utilizados para detecção e localização de antígenos em células e tecidos e para detecção de anticorpos específicos em fluidos biológicos. </li></ul><ul><li>Métodos de alta especificidade e alta especificidade </li></ul><ul><li>Utilização de anticorpos conjugados com substâncias fluorescentes (FITC, FAC) na IFA, e de anticorpos conjugados com enzimas (Imunohistoquímica). </li></ul>
  32. 32. 2- PRINCIPAIS MÉTODOS LABORATORIAIS 2.6- Imunofluorescência / Imunohistoquímica:
  33. 33. 2- PRINCIPAIS MÉTODOS LABORATORIAIS <ul><li>2.6- Imunofluorescência / Imunohistoquímica: </li></ul><ul><li>Vantagens: Alta especificidade e sensibilidade; possibilidade de detecção de proteínas intracelulares e de sua localização, bem como do tráfico intracelular. </li></ul><ul><li>- Desvantagens: “variação individual” na leitura de resultados de IFA; alto custo de microscópio de fluorescência; técnicas especiais de fixação e inclusão de tecidos para Imunohistoquímica nem sempre disponíveis. </li></ul>
  34. 34. 2- PRINCIPAIS MÉTODOS LABORATORIAIS <ul><li>2.7- Western-Blot: Associação de técnica de Eletroforese em Gel de SDS-PAGE com técnicas imunológicas </li></ul><ul><li>Permite a identificação do reconhecimento de antígenos com peso molecular definido </li></ul><ul><li>Identificação de anticorpos que reconhecem determinado antígeno em solução contendo diversos antígenos </li></ul><ul><li>Permite a realização de cinética de expressão de proteínas celulares. </li></ul>
  35. 35. 2- PRINCIPAIS MÉTODOS LABORATORIAIS 2.7- Western-Blot:
  36. 36. 2- PRINCIPAIS MÉTODOS LABORATORIAIS 2.7- Western-Blot:
  37. 37. 2- PRINCIPAIS MÉTODOS LABORATORIAIS <ul><li>2.7- Western-Blot: </li></ul><ul><li>Vantagens: alta sensibilidade e especificidade; reconhecimento de antígenos individuais em um extrato; realização de perfil de reconhecimento de antígenos e determinação de proteínas imunodominantes; </li></ul><ul><li>Desvantagens: Custo médio a alto; procedimento longo e propenso a erros em diversos pontos; dependendo do sistema de revelação, pode-se ter problemas de segurança. </li></ul>
  38. 38. 3- BIBLIOGRAFIA RECOMENDADA <ul><li>Imunologia Celular e Molecular. Abbul K. Abbas & Andrew H. Lichtman. Quinta Edição, Elsevier Editora </li></ul><ul><li>Imunologia Médica. Abba I. Terr, Daniel P. Sittes & Tristam. Décima Edição. Guanabara Koogan Editora. </li></ul><ul><li>Imunologia Veterinária. Ian R. Tizard. Quinta Edição. Roca Editora. </li></ul><ul><li>Imunologia. David Male, Ivan Roitt & Jonathan Brostoff. Sexta Edição. Manole Editora. </li></ul><ul><li>Imunobiologia: O Sistema Imune na Saúde e na Doença. Charles Janeway, Paul Travers & Mark Walport & J. Donald Capra. Quinta Edição. Artmed Editora. </li></ul><ul><li>Immunodiagnostics, A Practical Approach. Ray Edwards. Oxford University Press. </li></ul><ul><li>Antibodies, A Laboratory Manual. Ed Harlow & David Lane. Cold Spring Harbor Laboratory Press. </li></ul>

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