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UNIVERSIDADE FEDERAL DA BAHIA
INSTITUTO DE CIÊNCIAS DA SAÚDE – ICS
ICSA17 Imunologia (Prática) - Citometria de fluxo
o DEFINIÇÃO:
• É uma técnica utilizada para contar, examinar e classificar partículas
microscópicas suspensas em meio líquido em fluxo.
• Permite a análise de vários parâmetros simultaneamente, sendo
conhecida também por citometria de fluxo multiparamétrica.
• Através de um aparelho de detecção óptico-eletrônico são possíveis
análises de características físicas e/ou químicas de uma simples
célula.
• O citômetro de fluxo é um aparelho utilizado para avaliação da
emissão de fluorescência das células (FACS – Fluorescence Activated
Cell Sorter).
o “Vendo células…”
• Em um microscópio óptico, podemos distinguir as células por suas
características morfológicas e de coloração
• A citometria de fluxo classifica a célula através de características
parecidas
• Mas através da citometria de fluxo, pode-se fazer análises
quantitativas e qualitativas muito mais acuradas.
o Histórico
• Antigamente, principalmente em laboratórios clínicos, as
populações de células sanguíneas eram avaliadas e contadas através
de microscopia.
• Na década de 50, foi criado um contador Coulter automatizado
baseado no tamanho das células
• Na década de 70, era necessário nos experimentos realizar a
contagem e classificação de células viáveis, e de subpopulações não
distinguíveis pela microscopia
o Histórico
• Na década de 60, a IBM desenvolve um scanner óptico de células
fixadas em lâmina;
• Técnicas ópticas e computacionais da época levaram ao
desenvolvimento de um scanner de células em um fluxo pequeno,
baseado na absorção de luz e seu desvio.
• Em 74, Herzenberg, de Stanford, desenvolveu o primeiro FACS.
Primeiro aparelho de citometria de fluxo
Atualmente...
ICSA17 Imunologia (Prática) - Citometria de fluxo
Publicações contendo “flow cytometry” como keyword no PubMed
• Os anticorpos monoclonais são os reagentes de escolha
devido à sua especificidade, reação cruzada mínima e
reprodutibilidade. O citômetro de fluxo mede as
propriedades de dispersão de luz pelas as células e a
emissão de luz de anticorpos monoclonais associados a
fluorocromos e ligados à superfície de uma célula.
• VANTAGENS
• Mede múltiplos parâmetros em células individuais;
• Grande número de células analisadas com rapidez;
• Disponibilidade de amplo perfil de anticorpos
específicos;
• Análise de antígenos de superfície, intracitoplasmáticos
e intranucleares;
o APLICAÇÕES
• Fenotipagem dos leucócitos
• Fenotipagem de células tumorais
- Diagnóstico e classificação das leucemias e dos
linfomas
• Análise de DNA
• Análise da função dos neutrófilos
• Contagem de reticulócitos
o APLICAÇÕES EM MEDICINA VETERINÁRIA
• Quantificação de subpopulações linfocitárias
• Quantificação das células CD34+ como indicação da
capacidade de reconstituição hematopoiética após o
transplante de células-tronco
• Avaliação de eritrócitos
• Avaliação de plaquetas
ICSA17 Imunologia (Prática) - Citometria de fluxo
• As células, uma vez em suspensão, são orientadas em um fluxo laminar e
interceptadas uma a uma por um feixe de luz (LASER).
• Um número de detectores são apontados ao local onde o fluxo passa
através do feixe de luz; um na linha do feixe de luz (Forward Scatter ou
FSC) e vários perpendiculares a este (Side Scatter ou SSC) além de um ou
mais detectores fluorescentes.
• Cada partícula suspensa passando através do feixe dispersa a luz de uma
forma, e os fluorocromos fluorescentes encontrados na partícula podem
ser excitados emitindo luz de menor frequência do que o da fonte de luz.
• Esta combinação de luz dispersa e fluorescente é melhorada
pelos dectetores, e analisando as flutuações de brilho de cada
detector (uma para cada pico de emissão fluorescente) é
possível explorar vários tipos de informação sobre a estrutura
física e química de cada partícula.
Detector de dispersão de
luz em ângulo de 90º
Complexidade celular
SSC (Side Scatter)
Detector de dispersão de
luz frontal
Tamanho celular
FSC (Forward Scatter)
Fonte de Luz Incidente: Laser
de Argon a 488 nm
ÂNGULO DE DISPERSÃO FRONTAL (FSC)
ÂNGULO DE DISPERSÃO LATERAL (SSC)
LASER
CÉLULA
ICSA17 Imunologia (Prática) - Citometria de fluxo
3)Dispersão lateral
de luz
1)Suspensão de células
Laser
3)Dispersão de luz
para a frente
4)Filtro
6) Análise
de dados
5)A luz refletida passa
através de filtros e é
detectada por tubos
fotomultiplicadores que
convertem o sinal luminoso
em sinal eletrônico
2) Anticorpos monoclonais associados a
fluorocromos e ligados à superfície de uma
célula
ICSA17 Imunologia (Prática) - Citometria de fluxo
Gráfico de análise de leucócitos (dispersão lateral e frontal)
Cada ponto significa uma célula identificada pelo citômetro.
Estão divididas pela dispersão frontal (forward) – tamanho da célula - horizontalmente
E também pela dispersão lateral (side) - granulação e complexidade – verticalmente
Os círculos indica células que pertencem a um grupo de tamanho e complexidade próximos
ICSA17 Imunologia (Prática) - Citometria de fluxo
ICSA17 Imunologia (Prática) - Citometria de fluxo
Fluoróforos
• Fluoresceína – um dos primeiros a serem
desenvolvidos (FITC) – emite fluorescência verde a
535nm
• Ficoeritrina (PE) – vermelha – de cianobactérias –
emite fluorescência a 575nm
• Green fluorescent protein (GFP) – de águas vivas -
fluorescência verde (535nm)
Fluoróforos
• PercP (peridin chlorophil protein) – de
dinoflagelados (Peridinium)
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Fluoróforos
Tipos de Laser
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EGFP
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Tipos de Resultado
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Parâmetros duplos podem ser representados em duas
dimensões por plots ou dot.
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Histograma
1 2 3 4 6 7 150 160 170 .. 190
Intensidade de Fluorescência Detectada
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101102103104
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células CD4+ e CD3-
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células CD4- e CD3+
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células CD4+ e CD3+
(linfócitos Th)
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Gating
L
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G
SCATTER FLUORESCÊNCIA IMAGEM
Funções de Organelas
• Mitocôndria - Rodamina 123
• Endossomos - Ceramidas
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• Retículo endoplasmático - DiOC6(3) Carbocianina
Análises Funcionais
• pH intracelular
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• Apoptose
• Reparo de danos
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Análise de DNA
Fluoróroforos
ligantes a pares de
bases
 DAPI
 Hoechst 33342
 Hoechst 33258
Flouróforos
intercalantes
 7-AAD
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Análise de DNA
• Intercalantes de bases – entre as bases de DNA ou
RNA
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• Intercalantes expressam diferentes espectros de
emissão dependendo da natureza do DNA ou RNA
– Acridina laranja – dupla fita (emissão a 530nm) e fita
simples a 640nm
Análise de DNA
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ICSA17 Imunologia (Prática) - Citometria de fluxo

  • 1. UNIVERSIDADE FEDERAL DA BAHIA INSTITUTO DE CIÊNCIAS DA SAÚDE – ICS
  • 3. o DEFINIÇÃO: • É uma técnica utilizada para contar, examinar e classificar partículas microscópicas suspensas em meio líquido em fluxo. • Permite a análise de vários parâmetros simultaneamente, sendo conhecida também por citometria de fluxo multiparamétrica. • Através de um aparelho de detecção óptico-eletrônico são possíveis análises de características físicas e/ou químicas de uma simples célula. • O citômetro de fluxo é um aparelho utilizado para avaliação da emissão de fluorescência das células (FACS – Fluorescence Activated Cell Sorter).
  • 4. o “Vendo células…” • Em um microscópio óptico, podemos distinguir as células por suas características morfológicas e de coloração • A citometria de fluxo classifica a célula através de características parecidas • Mas através da citometria de fluxo, pode-se fazer análises quantitativas e qualitativas muito mais acuradas.
  • 5. o Histórico • Antigamente, principalmente em laboratórios clínicos, as populações de células sanguíneas eram avaliadas e contadas através de microscopia. • Na década de 50, foi criado um contador Coulter automatizado baseado no tamanho das células • Na década de 70, era necessário nos experimentos realizar a contagem e classificação de células viáveis, e de subpopulações não distinguíveis pela microscopia
  • 6. o Histórico • Na década de 60, a IBM desenvolve um scanner óptico de células fixadas em lâmina; • Técnicas ópticas e computacionais da época levaram ao desenvolvimento de um scanner de células em um fluxo pequeno, baseado na absorção de luz e seu desvio. • Em 74, Herzenberg, de Stanford, desenvolveu o primeiro FACS.
  • 7. Primeiro aparelho de citometria de fluxo
  • 10. Publicações contendo “flow cytometry” como keyword no PubMed
  • 11. • Os anticorpos monoclonais são os reagentes de escolha devido à sua especificidade, reação cruzada mínima e reprodutibilidade. O citômetro de fluxo mede as propriedades de dispersão de luz pelas as células e a emissão de luz de anticorpos monoclonais associados a fluorocromos e ligados à superfície de uma célula.
  • 12. • VANTAGENS • Mede múltiplos parâmetros em células individuais; • Grande número de células analisadas com rapidez; • Disponibilidade de amplo perfil de anticorpos específicos; • Análise de antígenos de superfície, intracitoplasmáticos e intranucleares;
  • 13. o APLICAÇÕES • Fenotipagem dos leucócitos • Fenotipagem de células tumorais - Diagnóstico e classificação das leucemias e dos linfomas • Análise de DNA • Análise da função dos neutrófilos • Contagem de reticulócitos
  • 14. o APLICAÇÕES EM MEDICINA VETERINÁRIA • Quantificação de subpopulações linfocitárias • Quantificação das células CD34+ como indicação da capacidade de reconstituição hematopoiética após o transplante de células-tronco • Avaliação de eritrócitos • Avaliação de plaquetas
  • 16. • As células, uma vez em suspensão, são orientadas em um fluxo laminar e interceptadas uma a uma por um feixe de luz (LASER). • Um número de detectores são apontados ao local onde o fluxo passa através do feixe de luz; um na linha do feixe de luz (Forward Scatter ou FSC) e vários perpendiculares a este (Side Scatter ou SSC) além de um ou mais detectores fluorescentes. • Cada partícula suspensa passando através do feixe dispersa a luz de uma forma, e os fluorocromos fluorescentes encontrados na partícula podem ser excitados emitindo luz de menor frequência do que o da fonte de luz.
  • 17. • Esta combinação de luz dispersa e fluorescente é melhorada pelos dectetores, e analisando as flutuações de brilho de cada detector (uma para cada pico de emissão fluorescente) é possível explorar vários tipos de informação sobre a estrutura física e química de cada partícula.
  • 18. Detector de dispersão de luz em ângulo de 90º Complexidade celular SSC (Side Scatter) Detector de dispersão de luz frontal Tamanho celular FSC (Forward Scatter) Fonte de Luz Incidente: Laser de Argon a 488 nm
  • 19. ÂNGULO DE DISPERSÃO FRONTAL (FSC) ÂNGULO DE DISPERSÃO LATERAL (SSC) LASER CÉLULA
  • 21. 3)Dispersão lateral de luz 1)Suspensão de células Laser 3)Dispersão de luz para a frente 4)Filtro 6) Análise de dados 5)A luz refletida passa através de filtros e é detectada por tubos fotomultiplicadores que convertem o sinal luminoso em sinal eletrônico 2) Anticorpos monoclonais associados a fluorocromos e ligados à superfície de uma célula
  • 23. Gráfico de análise de leucócitos (dispersão lateral e frontal) Cada ponto significa uma célula identificada pelo citômetro. Estão divididas pela dispersão frontal (forward) – tamanho da célula - horizontalmente E também pela dispersão lateral (side) - granulação e complexidade – verticalmente Os círculos indica células que pertencem a um grupo de tamanho e complexidade próximos
  • 26. Fluoróforos • Fluoresceína – um dos primeiros a serem desenvolvidos (FITC) – emite fluorescência verde a 535nm • Ficoeritrina (PE) – vermelha – de cianobactérias – emite fluorescência a 575nm • Green fluorescent protein (GFP) – de águas vivas - fluorescência verde (535nm)
  • 27. Fluoróforos • PercP (peridin chlorophil protein) – de dinoflagelados (Peridinium) • PE-Cy5 – sintético – 600nm
  • 30. Tipos de Laser FL1 ~525nm FL2 ~575 nm FL3 ~620 nm FL4 ~675 nm FITC ECFP EGFP EYFP PE DsRED PE-Texas Red Propidium Iodem PE-Cy5 APC PerCP
  • 31. Linfócito TCD4 Anticorpos monoclonais marcados Linfócito TCD8 Citometria de fluxo Luz fluorescente Laser Contagem das células
  • 36. Tipos de Filtros Ópticos
  • 37. Tipos de Filtros Ópticos
  • 38. Conversão de sinais ópticos em pulso de voltagem
  • 39. Conversão de sinais ópticos em pulso de voltagem
  • 41. Conversão de sinais ópticos em pulso de voltagem
  • 42. Conversão de sinais ópticos em pulso de voltagem
  • 44. Tipos de Resultado Parâmetros duplos podem ser representados em duas dimensões por plots ou dot. Parâmetros únicos são representados por histogramas simples.
  • 45. Histograma 1 2 3 4 6 7 150 160 170 .. 190 Intensidade de Fluorescência Detectada Positivo Negativo Com fluorescênciaS/ fluorescContagens 1 4 6
  • 47. Histograma de dois parâmetros +/+ +/--/- -/+
  • 48. Histograma de dois parâmetros FITC FL PE FL Duplo negativo Único positivo FITC Único positive PE Duplo positivo PE e FITC
  • 49. Histograma de dois parâmetros Padrão de várias cores 10 1 10 2 10 3 10 4 CD3 --> 101102103104 CD4--> FL1-CD3 FL2-CD4 cor CD3-CD4- preto CD3+CD4- azul CD3-CD4+ ciano CD3+CD4+ verde
  • 50. Gráfico de análise de leucócitos (com fluorescência) Neste quadrante estão as células CD4+ e CD3- Neste quadrante estão as células CD4- e CD3- (células que não linfócitos) Neste quadrante estão as células CD4- e CD3+ (outros linfócitos que não Th) Neste quadrante estão as células CD4+ e CD3+ (linfócitos Th)
  • 53. Funções de Organelas • Mitocôndria - Rodamina 123 • Endossomos - Ceramidas • Golgi - BODIPY-Ceramida • Retículo endoplasmático - DiOC6(3) Carbocianina
  • 54. Análises Funcionais • pH intracelular • Cálcio intracelular • Glutationa intracelular • Burst oxidativo • Fagocitose
  • 55. Respostas a Estímulos • Morte Celular • Necrose • Apoptose • Reparo de danos • Reparo Incorreto
  • 56. Análise de DNA Fluoróroforos ligantes a pares de bases  DAPI  Hoechst 33342  Hoechst 33258 Flouróforos intercalantes  7-AAD  PI  Brometo de etídio  Acridina laranja  Pyronin Y
  • 57. Análise de DNA • Intercalantes de bases – entre as bases de DNA ou RNA – PI – sem seletividade de par de base – Brometo de etídio – sem seletividade de par de base – 7-AAD – preferência por GC • Intercalantes expressam diferentes espectros de emissão dependendo da natureza do DNA ou RNA – Acridina laranja – dupla fita (emissão a 530nm) e fita simples a 640nm
  • 58. Análise de DNA • Aplicações – Conteúdo de DNA – Subpopulações de células – Apoptose – Cinética de proliferação – Análises de ciclo celular
  • 59. Análise de DNA • Análise de apoptose Apoptotic cells G0,G1 S G2,M PI (DNA Content) Purdue University Cytometry
  • 60. Cell Sorting 488 nm laser +- Charged Plates Single cells sorted into test tubes FALS Sensor Fluorescence detector
  • 61. Cell Sorting SMALL BEAD LARGE BEAD Frequency Histogram SMALL BEAD LARGE BEAD Sample in Sheath Sheath in Laser beam Stream Charge +2KV -2KV Waste SORT RIGHTSORT LEFT SORT DECISIONS Piezoelectric crystal oscillator Last attached droplet LEFT RIGHT Sensors Sensor