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Anticorpos monoclonais e
policlonais
[1]
Adriana Lima 85047
Barbara Tagé 85084
Anticorpos policlonais
• Anticorpos policlonais (como diz o nome) possuem vários
clones, ou seja, se originam de diferentes linfócitos B, o que
significa que reagem com vários epítopos do antígeno (por
exemplo, várias partes de uma proteína).
Figura 1. : Anticorpos policlonais [2]
Anticorpos monoclonais
• Anticorpo específico pra um antígeno e produzido por um
hibridoma de células B (linhagem celular resultante da fusão
de uma única célula B normal com uma linha imortalizada de
tumor de células B).
Figura 2. : Anticorpos monoclonais [2]
Anticorpos policlonais
Figura 3 : Obtenção de anticorpos policlonais [3]
Anticorpos monoclonais
Figura 4:Obtenção de anticorpos policlonais [4]
Histórico
• 1ª evidência do uso de anticorpos: imunoglobulinas
utilizadas para neutralizar toxina diftérica.
Figura 5: Emil Adolf von Behring. Prize nobel: 1/1 [5]
Prêmio Nobel de Medicina e Fisiologia em 1901
Histórico
• 1ª Técnica de utilização de hibridomas para produção
de anticorpos monoclonais
Figura 6: Cientistas laureados pelo desenvolvimento da técnica do hibridoma [6]
Prêmio Nobel de Medicina 1984
Concepção geral da técnica
• Obtenção de anticorpos monoclonais
Figura 7: Técnica de obtenção de anticorpos monoclonais [7]
Concepção geral da técnica
• Obtenção de anticorpos monoclonais
Figura 8: Técnica de obtenção de anticorpos monoclonais [7]
Concepção geral da técnica
• Obtenção de anticorpos monoclonais
Figura 9: Técnica de obtenção de anticorpos monoclonais [7]
Expectativas de:
• Tratamento para muitas doenças
• Cura do câncer
Então...
• Os problemas foram resolvidos?!
Não foi o que aconteceu...
Existia uma limitação!
O que é um anticorpo?
O anticorpo
Figura 10: Imunoglobulina de Superfície [8]
Processo de humanização
Figura 11: Processo de humanização [9]
• Definição
Anticorpo monoclonal total
• Resposta HAMA: Anticorpo humano anti-murino, do inglês
human anti-mouse antibody.
Figura 12: Nomenclatura de anticorpos [10]
Anticorpo monoclonal quimérico
• Resposta HACA: Anticorpo humano anti-quimérico (Human
anti-chimeric antibody).
• Região variável humana é trocada pela do murino.
Figura 12: Nomenclatura de anticorpos [10]
Anticorpo monoclonal humanizado
• Resposta HAHA: Anticorpo humano anti-humano( do inglês
Human anti-human antibody).
• Regiões hipervariáveis murinas são cortadas da Ig Humana
Figura 12: Nomenclatura de anticorpos [10]
Humano Total
Figura 12: Nomenclatura de anticorpos [10]
• Sem resposta imune contra o anticorpo.
• Sem proteínas dos murinos.
A técnica hoje:
• Primeiramente, o animal a ser selecionado
deve ser livre de patógenos e geneticamente
selecionado. Geralmente, utiliza-se animais
singênicos.
• Para a produção em escala comercial, animais
como camundongos, coelhos e aves,
normalmente galinhas, são utilizados. No
entanto, os camundongos são os mais
utilizados.
A técnica hoje:
• Produção de anticorpos monoclonais
• Seleção dos hibridomas
• Clonagem dos hibridomas
• Teste de seleção de anticorpos
Produção de anticorpos monoclonais
• Imuniza-se o animal com epítopo desejado.
• Retira-se os linfócitos B, principalmente do
baço.
• Funde-se os linfócitos B obtidos com células
do mieloma (hibridoma) com auxílio de um
surfactante PEG (Polietileno glicol).
Produção de anticorpos monoclonais
Figura 13: Esquema de produção de anticorpos monoclonais [11]
A técnica hoje:
• Produção de anticorpos monoclonais
• Seleção dos hibridomas
• Clonagem dos hibridomas
• Teste de seleção de anticorpos
Seleção dos hibridomas
• Células do mieloma tem enzimas deficientes:
1. Hipoxantina guanina fosforibosil transferase
(HGPRT)
2. Timidina quinase.
• A carência dessas enzimas leva a célula à morte
em meio HAT.
• Meio HAT: contém hipoxantina, timidina e
aminopterina. Seleciona as células fusionadas.
Seleção dos hibridomas
• Células fusionadas são capazes de sobreviver a
esse meio por suprirem a sua carência
enzimática pela fusão com os linfócitos B.
• Os linfócitos B não fusionados morrem após
um certo período visto que as células do
mioloma são “imortalizadas”.
A técnica hoje:
• Produção de anticorpos monoclonais
• Seleção dos hibridomas
• Clonagem dos hibridomas
• Teste de seleção de anticorpos
Clonagem dos hibridomas
• Com a identificação da cultura celular
fusionada as células são diluídas de forma que
tenha apenas uma célula por poço.
• Cada célula isolada irá proliferar-se formando
colônias individuais.
Figura 14: Anticorpos monoclonais crescendo isoladamente [12]
Clonagem dos hibridomas
• Após duas semanas já há anticorpos
secretados suficientes .
• As amostras são transferidas para placas de 24
poços.
Figura 15 : Placa de ELISA [13]
A técnica hoje:
• Produção de anticorpos monoclonais
• Seleção dos hibridomas
• Clonagem dos hibridomas
• Teste de seleção de anticorpos
Teste de seleção de anticorpos
• Técnicas que definem colônias que secretam
anticorpos de alta especificidade.
• Testes de seleção devem ser realizados com o
antígeno em sua forma original, na qual o
anticorpo foi desenvolvido.
Teste de seleção de anticorpos
• ELISA é o mais utilizado
Figura 16: Imagem ilustrativa de um poço de ELISA [14]
Métodos indiretos e diretos
Figura 17: Imagem ilustrativa e comparativa da técnica ELISA [15]
Pontos positivos e negativos
• Positivos:
o Muitas amostras analisadas rapidamente
o Não requer muitos equipamentos
o Reagentes e marcadores de fácil acesso
• Negativos: reações cruzadas.
o Direto: <1% falsos negativos, baixa
sensibilidade
o Indireto: 50% falsos negativos
Quais as aplicações dos anticorpos
monoclonais?
• Tratamento da Asma
• Tratamento para linfoma
Asma
• IgE – importante mediador de reações alérgicas
• Omalizumabe: 1º e único aprovado pela Food
and Drug Administration desde 2003
(Cook,M.S.;Bochner,B.S.2010)
• anti-IgE (-umabe) previne interação entre IgE e
receptores FcεRII (Low affinity receptor) e FcεRI
(High affinity receptor) nas células dendríticas e
inibe outros receptores de IgE em basófilos.
Mecanismo
Figura 18: Mecanismo de atuação do anti-IgE [16]
Teste de eficácia
• 419 pacientes com asma grave receberam
Omalizumab ou placebo aleatoriamente por
28 semanas.
• Redução de exacerbações clinicamente
significantes em 26% em relação ao grupo que
recebeu placebo. [17,18]
Quais as aplicações dos anticorpos
monoclonais?
• Tratamento da Asma
• Tratamento para linfoma
Linfoma
• Linfoma não Hodgkin (mais agressivo).
• Tratamento interrompe a proliferação das
células neoplásicas.
Mecanismo
• No tumor a via do NF-κB está ativa inibindo
apoptose.
• Bortezomibe inibe a via do NF-κB permitindo
que ocorra a apoptose inibindo a
proliferação.[19]
Referências Bibliográficas
• [1] Disponível em < http://www.tebu-
bio.com/userfiles/image/Corporate/Antibody%20Taskforce/ANTICORPS%20simple.png >. Acessado em :
12.mar.2015.
• [3] Disponível em: < http://www.ptglab.com/blog/wp-content/uploads/2010/08/41.jpg >. Acessado em:
12.mar.2015.
• [4] Disponível em: < http://upload.wikimedia.org/wikibooks/en/a/a1/Biochem-polyclonal.jpg >. Acessado
em: 12.mar.2015.
• [5] Disponível em: < http://www.nobelprize.org/nobel_prizes/medicine/laureates/1901/ >. Acessado em:
10.mar.2015.
• [6] Disponível em: < http://www.nobelprize.org/nobel_prizes/medicine/laureates/1984/ >. Acessado em:
12.mar.2015.
• [7] ABBAS, A. K.; LICHTMAN, A. H.; PILAI, S. Imunologia celular e molecular. Rio de Janeiro: Elsevier, 7ª
edição, 2012.
• [8] ACTOR,J.K. Imunologia básica. Rio de Janeiro : Elsevier.2007.
Referências Bibliográficas
• [9] Anticorpos monoclonais no tratamento da asma, Revista Brasileira de Alergia e Imunopatologia; São
Paulo, ASBAI, 03.09.2012;25.10.2012
• [10] MURPHY, K. ; TRAVERS, P. & WALPORT, M. Imunobiologia de Janeway. 7ª Edição. Editora ArtMed, 2014.
• [11] LINDBLAD, E. B. Aluminium Adjuvantes. In: STEWARTTULL, D. E. S. (ed). The theory and pratical
application of adjuvantes. Hohn Wiley & Sons, 1995. p. 21-25.
• [12] Disponível em:< http://img3.wikia.nocookie.net/__cb20130414003422/aia1317/pt-
br/images/a/ac/Figura5_9.JPG >. Acessado em: 14.mar.2015.
• [13] Disponível em:< http://i01.i.aliimg.com/photo/v24/514740447/24_wells_PS_culture_plate.jpg >.
Acessado em: 14.mar.2015
• [14] Disponível em:< http://i.ytimg.com/vi/6Ue1Hd3dyaQ/maxresdefault.jpg >. Acessado em: 14.mar.2015.
• [15] Disponível:<
http://www.chemgapedia.de/vsengine/media/vsc/en/ch/25/orgentec/graphics/elisa_en_swf_altref.jpg >.
Acessado em:13.mar.2015.
• [16] COOK,M.S.;BOCHNER,B.S. Update on Biological Therapeutics for Asthma. World Allergy Organization
Journal 2010, 3:188-194
Referências Bibliográficas
• [17]Cook, M. L. , Bochner, B. S. Update on Biological Therapeutics for Asthma. World Allergy Organization
Journal 2010, 3:188-194 .
• [18] Humbert M, Beasley R, Ayres J, Slavin R, Hébert J, et al.: Benefits of omalizumab as add-on therapy in
patients with severe persistent asthma who are inadequately controlled despite best available therapy
(GINA 2002 step 4 treatment): INNOVATE. Allergy 2005, 60:309-316.
• [19] Disponível em:< http://www.tmobr.com.br/artigos/artigo_novidade_imprimir.html >. Acessado em:
14.mar.2015.

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Anticorpos monoclonais e policlonais pdf

  • 1. Anticorpos monoclonais e policlonais [1] Adriana Lima 85047 Barbara Tagé 85084
  • 2. Anticorpos policlonais • Anticorpos policlonais (como diz o nome) possuem vários clones, ou seja, se originam de diferentes linfócitos B, o que significa que reagem com vários epítopos do antígeno (por exemplo, várias partes de uma proteína). Figura 1. : Anticorpos policlonais [2]
  • 3. Anticorpos monoclonais • Anticorpo específico pra um antígeno e produzido por um hibridoma de células B (linhagem celular resultante da fusão de uma única célula B normal com uma linha imortalizada de tumor de células B). Figura 2. : Anticorpos monoclonais [2]
  • 4. Anticorpos policlonais Figura 3 : Obtenção de anticorpos policlonais [3]
  • 5. Anticorpos monoclonais Figura 4:Obtenção de anticorpos policlonais [4]
  • 6. Histórico • 1ª evidência do uso de anticorpos: imunoglobulinas utilizadas para neutralizar toxina diftérica. Figura 5: Emil Adolf von Behring. Prize nobel: 1/1 [5] Prêmio Nobel de Medicina e Fisiologia em 1901
  • 7. Histórico • 1ª Técnica de utilização de hibridomas para produção de anticorpos monoclonais Figura 6: Cientistas laureados pelo desenvolvimento da técnica do hibridoma [6] Prêmio Nobel de Medicina 1984
  • 8. Concepção geral da técnica • Obtenção de anticorpos monoclonais Figura 7: Técnica de obtenção de anticorpos monoclonais [7]
  • 9. Concepção geral da técnica • Obtenção de anticorpos monoclonais Figura 8: Técnica de obtenção de anticorpos monoclonais [7]
  • 10. Concepção geral da técnica • Obtenção de anticorpos monoclonais Figura 9: Técnica de obtenção de anticorpos monoclonais [7]
  • 11. Expectativas de: • Tratamento para muitas doenças • Cura do câncer Então... • Os problemas foram resolvidos?! Não foi o que aconteceu...
  • 13. O que é um anticorpo?
  • 14. O anticorpo Figura 10: Imunoglobulina de Superfície [8]
  • 15. Processo de humanização Figura 11: Processo de humanização [9] • Definição
  • 16. Anticorpo monoclonal total • Resposta HAMA: Anticorpo humano anti-murino, do inglês human anti-mouse antibody. Figura 12: Nomenclatura de anticorpos [10]
  • 17. Anticorpo monoclonal quimérico • Resposta HACA: Anticorpo humano anti-quimérico (Human anti-chimeric antibody). • Região variável humana é trocada pela do murino. Figura 12: Nomenclatura de anticorpos [10]
  • 18. Anticorpo monoclonal humanizado • Resposta HAHA: Anticorpo humano anti-humano( do inglês Human anti-human antibody). • Regiões hipervariáveis murinas são cortadas da Ig Humana Figura 12: Nomenclatura de anticorpos [10]
  • 19. Humano Total Figura 12: Nomenclatura de anticorpos [10] • Sem resposta imune contra o anticorpo. • Sem proteínas dos murinos.
  • 20. A técnica hoje: • Primeiramente, o animal a ser selecionado deve ser livre de patógenos e geneticamente selecionado. Geralmente, utiliza-se animais singênicos. • Para a produção em escala comercial, animais como camundongos, coelhos e aves, normalmente galinhas, são utilizados. No entanto, os camundongos são os mais utilizados.
  • 21. A técnica hoje: • Produção de anticorpos monoclonais • Seleção dos hibridomas • Clonagem dos hibridomas • Teste de seleção de anticorpos
  • 22. Produção de anticorpos monoclonais • Imuniza-se o animal com epítopo desejado. • Retira-se os linfócitos B, principalmente do baço. • Funde-se os linfócitos B obtidos com células do mieloma (hibridoma) com auxílio de um surfactante PEG (Polietileno glicol).
  • 23. Produção de anticorpos monoclonais Figura 13: Esquema de produção de anticorpos monoclonais [11]
  • 24. A técnica hoje: • Produção de anticorpos monoclonais • Seleção dos hibridomas • Clonagem dos hibridomas • Teste de seleção de anticorpos
  • 25. Seleção dos hibridomas • Células do mieloma tem enzimas deficientes: 1. Hipoxantina guanina fosforibosil transferase (HGPRT) 2. Timidina quinase. • A carência dessas enzimas leva a célula à morte em meio HAT. • Meio HAT: contém hipoxantina, timidina e aminopterina. Seleciona as células fusionadas.
  • 26. Seleção dos hibridomas • Células fusionadas são capazes de sobreviver a esse meio por suprirem a sua carência enzimática pela fusão com os linfócitos B. • Os linfócitos B não fusionados morrem após um certo período visto que as células do mioloma são “imortalizadas”.
  • 27. A técnica hoje: • Produção de anticorpos monoclonais • Seleção dos hibridomas • Clonagem dos hibridomas • Teste de seleção de anticorpos
  • 28. Clonagem dos hibridomas • Com a identificação da cultura celular fusionada as células são diluídas de forma que tenha apenas uma célula por poço. • Cada célula isolada irá proliferar-se formando colônias individuais. Figura 14: Anticorpos monoclonais crescendo isoladamente [12]
  • 29. Clonagem dos hibridomas • Após duas semanas já há anticorpos secretados suficientes . • As amostras são transferidas para placas de 24 poços. Figura 15 : Placa de ELISA [13]
  • 30. A técnica hoje: • Produção de anticorpos monoclonais • Seleção dos hibridomas • Clonagem dos hibridomas • Teste de seleção de anticorpos
  • 31. Teste de seleção de anticorpos • Técnicas que definem colônias que secretam anticorpos de alta especificidade. • Testes de seleção devem ser realizados com o antígeno em sua forma original, na qual o anticorpo foi desenvolvido.
  • 32. Teste de seleção de anticorpos • ELISA é o mais utilizado Figura 16: Imagem ilustrativa de um poço de ELISA [14]
  • 33. Métodos indiretos e diretos Figura 17: Imagem ilustrativa e comparativa da técnica ELISA [15]
  • 34. Pontos positivos e negativos • Positivos: o Muitas amostras analisadas rapidamente o Não requer muitos equipamentos o Reagentes e marcadores de fácil acesso • Negativos: reações cruzadas. o Direto: <1% falsos negativos, baixa sensibilidade o Indireto: 50% falsos negativos
  • 35. Quais as aplicações dos anticorpos monoclonais? • Tratamento da Asma • Tratamento para linfoma
  • 36. Asma • IgE – importante mediador de reações alérgicas • Omalizumabe: 1º e único aprovado pela Food and Drug Administration desde 2003 (Cook,M.S.;Bochner,B.S.2010) • anti-IgE (-umabe) previne interação entre IgE e receptores FcεRII (Low affinity receptor) e FcεRI (High affinity receptor) nas células dendríticas e inibe outros receptores de IgE em basófilos.
  • 37. Mecanismo Figura 18: Mecanismo de atuação do anti-IgE [16]
  • 38. Teste de eficácia • 419 pacientes com asma grave receberam Omalizumab ou placebo aleatoriamente por 28 semanas. • Redução de exacerbações clinicamente significantes em 26% em relação ao grupo que recebeu placebo. [17,18]
  • 39. Quais as aplicações dos anticorpos monoclonais? • Tratamento da Asma • Tratamento para linfoma
  • 40. Linfoma • Linfoma não Hodgkin (mais agressivo). • Tratamento interrompe a proliferação das células neoplásicas.
  • 41. Mecanismo • No tumor a via do NF-κB está ativa inibindo apoptose. • Bortezomibe inibe a via do NF-κB permitindo que ocorra a apoptose inibindo a proliferação.[19]
  • 42. Referências Bibliográficas • [1] Disponível em < http://www.tebu- bio.com/userfiles/image/Corporate/Antibody%20Taskforce/ANTICORPS%20simple.png >. Acessado em : 12.mar.2015. • [3] Disponível em: < http://www.ptglab.com/blog/wp-content/uploads/2010/08/41.jpg >. Acessado em: 12.mar.2015. • [4] Disponível em: < http://upload.wikimedia.org/wikibooks/en/a/a1/Biochem-polyclonal.jpg >. Acessado em: 12.mar.2015. • [5] Disponível em: < http://www.nobelprize.org/nobel_prizes/medicine/laureates/1901/ >. Acessado em: 10.mar.2015. • [6] Disponível em: < http://www.nobelprize.org/nobel_prizes/medicine/laureates/1984/ >. Acessado em: 12.mar.2015. • [7] ABBAS, A. K.; LICHTMAN, A. H.; PILAI, S. Imunologia celular e molecular. Rio de Janeiro: Elsevier, 7ª edição, 2012. • [8] ACTOR,J.K. Imunologia básica. Rio de Janeiro : Elsevier.2007.
  • 43. Referências Bibliográficas • [9] Anticorpos monoclonais no tratamento da asma, Revista Brasileira de Alergia e Imunopatologia; São Paulo, ASBAI, 03.09.2012;25.10.2012 • [10] MURPHY, K. ; TRAVERS, P. & WALPORT, M. Imunobiologia de Janeway. 7ª Edição. Editora ArtMed, 2014. • [11] LINDBLAD, E. B. Aluminium Adjuvantes. In: STEWARTTULL, D. E. S. (ed). The theory and pratical application of adjuvantes. Hohn Wiley & Sons, 1995. p. 21-25. • [12] Disponível em:< http://img3.wikia.nocookie.net/__cb20130414003422/aia1317/pt- br/images/a/ac/Figura5_9.JPG >. Acessado em: 14.mar.2015. • [13] Disponível em:< http://i01.i.aliimg.com/photo/v24/514740447/24_wells_PS_culture_plate.jpg >. Acessado em: 14.mar.2015 • [14] Disponível em:< http://i.ytimg.com/vi/6Ue1Hd3dyaQ/maxresdefault.jpg >. Acessado em: 14.mar.2015. • [15] Disponível:< http://www.chemgapedia.de/vsengine/media/vsc/en/ch/25/orgentec/graphics/elisa_en_swf_altref.jpg >. Acessado em:13.mar.2015. • [16] COOK,M.S.;BOCHNER,B.S. Update on Biological Therapeutics for Asthma. World Allergy Organization Journal 2010, 3:188-194
  • 44. Referências Bibliográficas • [17]Cook, M. L. , Bochner, B. S. Update on Biological Therapeutics for Asthma. World Allergy Organization Journal 2010, 3:188-194 . • [18] Humbert M, Beasley R, Ayres J, Slavin R, Hébert J, et al.: Benefits of omalizumab as add-on therapy in patients with severe persistent asthma who are inadequately controlled despite best available therapy (GINA 2002 step 4 treatment): INNOVATE. Allergy 2005, 60:309-316. • [19] Disponível em:< http://www.tmobr.com.br/artigos/artigo_novidade_imprimir.html >. Acessado em: 14.mar.2015.