Radioimunoensaio

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Aula sobre adioimunoensaio da disciplina Imunologia I

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Radioimunoensaio

  1. 1. UNIVERSIDADE FEDERAL DA BAHIA INSTITUTO DE CIÊNCIAS DA SAÚDE – ICSDEPARTAMENTO DE BIOINTERAÇÃODISCIPLINA: IMUNOLOGIA I – ICS 045<br /> RADIOIMUNOENSAIOS (RIA)<br />Trabalho realizado pela Médica Veterinária MSc Maria Tereza Barreto Guedes sob orientação dos Professores Robert Schaer, Roberto Meyer, Claudia Brodskin e Ricardo Portela. Atualizado em Fevereiro de 2010.<br />
  2. 2. CARACTERÍSTICAS GERAIS<br />
  3. 3. CARACTERÍSTICAS GERAIS<br />1959 Berson e Yalow – primeiro RIA para quantificação de insulina.<br />O RIA foi a primeira técnica imunológica padronizada capaz de detectar e quantificar substâncias da ordem de nano a picogramas. <br />Torna-se então possível determinar qualquer tipo de molécula biológica, desde que haja um receptor específico e que a molécula biológica possa ser marcada.<br />
  4. 4. CARACTERÍSTICAS GERAIS<br /><ul><li>DEFINIÇÃO
  5. 5. O termo radioimunoensaio(RIA) é mais empregado em ensaios com antígenos marcados.
  6. 6. O termo imunorradiométrico (IRMA) é utilizado em ensaios com anticorpos marcados.</li></li></ul><li>CARACTERÍSTICAS GERAIS<br />Apresenta alta sensibilidade que é conferida pela detecção radioativa.<br />O RIA também apresenta elevada especificidade.<br />Graças à sua especificidade, os ensaios podem acontecer diretamente no líquido biológico.<br />Por causa da sua sensibilidade, o volume de amostra pode ser menor. <br />
  7. 7. CARACTERÍSTICAS GERAIS<br /><ul><li> Desvantagens
  8. 8. Instabilidade dos radioisótopos.
  9. 9. Risco operacional.
  10. 10. Necessidades de medidas especiais.
  11. 11. Elevado custo de biossegurança</li></ul>e problemas com o descarte de material.<br /><ul><li> Vantagens
  12. 12. Método muito sensível, </li></ul>específico e de alta afinidade.<br /><ul><li> Baixo custo.
  13. 13. Requer pouca amostra.
  14. 14. Rápido.</li></li></ul><li>APLICAÇÕES <br /><ul><li>Alta sensibilidade -> permite dosagem de substâncias não encontradas em concentrações suficientes para serem percebidas por outras técnicas.
  15. 15. polipeptídios, catecolaminas, esteróides, antibióticos, hormônios tireoidianos, proteínas, vitaminas, drogas e outras.
  16. 16. vírus da hepatite B.
  17. 17. marcador tumoral.</li></li></ul><li>PRINCÍPIOS<br />
  18. 18. PRINCÍPIO GERAL<br /> Reação de competição por um receptor comum entre uma substância a ser determinada e a mesma substância marcada radioisotopicamente.<br />Componentes<br /><ul><li>Anticorpo radioativo
  19. 19. Antígeno radioativo
  20. 20. Amostra a ser testada
  21. 21. Leitor radiométrico</li></ul> Leitor radiométrico<br />
  22. 22. CARACTERÍSTICAS DOS MARCADORES<br /><ul><li>125 I
  23. 23. É o radioisótopo mais comumente empregado.
  24. 24. Meia vida de 57,5 dias.
  25. 25. Liga-se facilmente aos resíduos de tirosina das proteínas.
  26. 26. Produz radiação Υ.
  27. 27. Estabilidade menor que 3H.
  28. 28. Dosagem de hormônios protéicos.
  29. 29. Trítio (3H)
  30. 30. Produz radiação β .
  31. 31. Dosagem de esteróides.
  32. 32. Carbono 14</li></li></ul><li>TIPOS DE RIA PARA QUANTIFICAÇÃO DE Ag<br />
  33. 33. TIPOS DE RIA<br /><ul><li>De competição com Ag marcado.
  34. 34. De competição com Ac marcado.
  35. 35. Sanduíche ou captura de Ag.
  36. 36. Para detecção de IgE:
  37. 37. PaperRadioimmunosorbentTest (PRIST).
  38. 38. RadioallergosorbentTest (RAST).</li></li></ul><li>DE COMPETIÇÃO COM Ag MARCADO<br />Inicialmente, uma quantidade conhecida de anticorpos específicos é colocada na fase sólida.<br />Em seguida, adiciona-se o antígeno marcado com 125 I. <br />Uma amostra de soro de um paciente suspeito é então acrescentada.<br />O antígeno, se presente no soro, compete com o antígeno radioativo pelos sítios de ligação nos anticorpos. <br />A quantificação é feita em aparelho específico para a leitura de radioatividade. A concentração das moléculas antigênicas presentes na amostra é inversamente proporcional à leitura de radioatividade. <br />Y<br />Y<br />Y<br />Antígeno marcado<br />Antígeno do soro<br /> YAnticorpo específico<br />
  39. 39. DE COMPETIÇÃO COM Ac MARCADO<br />Inicialmente, antígenos são fixados na fase sólida.<br />A seguir, acrescenta-se a amostra do paciente.<br />Y<br />Os anticorpos específicos e marcados com o radioisótopo são acrescentados.<br />Se a amostra for positiva, haverá a formação do complexo Ag/Ac com o Ag do soro.<br />Y<br />Quanto maior a quantidade de antígeno na amostra, maior será a ligação destes aos anticorpos, formando imunocomplexos, que serão retirados por lavagem e assim reduzindo a leitura da radioatividade.<br />Y<br />Antígeno marcado<br />Antígeno do soro<br /> YAnticorpo marcado<br />
  40. 40. SANDUÍCHE OU CAPTURA DE Ag<br />Teste realizado em duas etapas:<br />Primeira etapa:<br /> 1) Fixação de Acs não marcados na fase sólida.<br /> 2) Adição da amostra (que contém Ag específicos contra o Ac fixado e outros componentes não específicos).<br /> 3) Os Ac capturam os Ag específicos da amostra.<br /> 4) Deverá ocorrer uma primeira lavagem para eliminação de componentes não específicos.<br />Segunda etapa:<br /> 1) Acrescenta-se um segundo anticorpo específico e marcado, que formará o “sanduíche”.<br />Y<br />Y<br />Y<br />Y<br /> 2) A formação do imunocomplexo será revelada por este segundo anticorpo. <br /> Antígeno do soro YAc marcado<br /> YAc não marcado Componentes não<br /> específicos <br />
  41. 41. TIPOS DE RIA PARA DETECÇÃO DE IgE<br />
  42. 42. PAPER RADIOIMMUNOSORBENT TEST (PRIST)<br />Anticorpos anti-IgE e não marcados são fixados na fase sólida.<br />Acrescenta-se o soro a ser pesquisado para a presença de IgE. Em caso positivo, haverá a união do anticorpo IgE + anticorpo anti-IgE.<br />Y<br />Y<br />Y<br />Y<br />Y<br />Y<br />Após lavagem para retirada do excesso de Ac não ligado, acrescenta-se anticorpos anti-IgE marcados com isótopo para que haja a revelação da amostra.<br />Y<br />Y<br />Y<br />Após lavagem, procede-se com a leitura. A determinação da concentração de IgE total presente na amostra ocorrerá através de cálculo que relacionará os valores obtidos com uma determinada curva padrão.<br /> YAgIgE da amostra <br /> Y Acanti-IgE marcado<br /> YAcanti-IgE não marcado<br />
  43. 43. RADIOALLERGOSORBENT TEST (RAST)<br />O alérgeno específico para o Ac IgE pesquisado é previamente fixado ao fundo do tubo na fase sólida.<br />Acrescenta-se soro do paciente. Havendo presença de IgE específica ao alérgeno em questão, haverá a formação do complexo Ag/Ac.<br />Acrescenta-se o anticorpo anti-IgE marcado, e este se liga ao Ac IgE pesquisado.<br />Y<br />Y<br />Y<br />Y<br />A reação então será revelada através do segundo anticorpo.<br />Alérgeno<br /> Y IgE do soro do paciente<br /> YAcanti-IgE marcado<br />

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