Aula prática: Anticorpos Monoclonais

1. Anticorpos monoclonais Aula 4 Maio de 2003

2. Os anticorpos que surgem num animal em resposta a um único antígeno complexo são heterogêneos. São formados vários clones diferentes de células B que diferenciam-se em plasmócitos, cada um deles expressando e secretando, respectivamente, um tipo de anticorpo, capaz de reagir com um diferente epítopo no antígeno complexo. Estes anticorpos são denominados policlonais . linfócitos/plasmócitos ... anticorpos antígeno

3. Os anticorpos que surgem a partir de um único clone de células, como, por exemplo, num tumor de plasmócitos (mieloma) são homogêneos, isto é, são iguais entre si. São ditos anticorpos monoclonais. Esse histograma mostra uma distribuição típica de afinidades de anticorpos em um antissoro para um determinante antigênico comparando-as com a afinidade única com que um anticorpo monoclonal se liga ao seu determinante antigênico. Anticorpo monoclonal Plasmócitos derivados de um único linfócito B pro- duzem anticorpos monoclonais, portanto idênticos entre si. Afinidade de anticorpo (K) Fração de anticorpo total (%) (escala log)

4. O método envolve fusão celular (ou hibridização de células somáticas), entre um linfócito B normal produtor de anticorpo e uma linhagem de mieloma , seguindo-se subsequentemente a seleção de células fusionadas que secretem anticorpo da especificidade desejada , derivada do linfócito B normal. Tais linhagens celulares imortalizadas, produtoras de anticorpos e derivados de fusões, são chamadas hibridomas. Os anticorpos que elas produzem são anticorpos monoclonais Método de produção de anticorpo monoclonal (tecnologia dos hibridomas) Antígeno X Os monoclo- nais têm sido produzidos prin- cipalmente em camundongos. Veja a seguir Células do baço isoladas de camundongo imunizado com antígeno X.

5. Mistura de células do baço incluindo algumas produtoras de anticorpos anti -X Linhagem tumoral de mieloma mutante, imortalizada e não cresce em meio seletivo (HAT). É incapaz de produzir anticorpos. Fusão in vitro Mistura de células fusionadas e não fusionadas. Seleção in vitro em meio de cultivo - HAT

6. Pesquisa de anticorpo anti- X nos sobrenadantes para posterior expansão dos clones positivos. Hibridomas produzindo anti corpo anti- X (Ac monoclonal anti-X). . Somente células fusionadas híbridas (hibridomas) crescem. Preparada a diluição no cultivo de modo que em cada poço fique só uma célula mãe /clone.

7. O sucesso dessa técnica depende do desenvolvimento das linhagens de mieloma que cresçam em meio normal de cultura mas não cresçam em um meio seletivo (HAT - hipoxantina, aminopterina e timidina), porque lhes faltam genes funcionais, necessários para a síntese de DNA pela via de salvação (genes que codificam as enzimas TK e HGPRT). Esses genes estão presentes nas células normais, de modo que somente os híbridos e os linfócitos B continuam a crescer no meio seletivo. Após a fusão, a aminopterina presente no meio bloqueia a síntese de DNA pela via de novo. As células podem então utilizar a via de salvação, já que o meio é suplementado com timidina e hipoxantina. Como as linhagens mutantes, não expressam as enzimas necessárias para a referida via de salvação, não vão conseguir sobreviver nesse meio. Como os linfócitos normais possuem vida curta em cultura, somente os clones híbridos sobreviverão e proliferarão secretando anticorpos com a especificidade da célula mãe que cresceu sozinha e foi selecionada no poço no início do procedimento.

8. Via de novo Nucleotídeos Via de salvação Timidina Hipoxantina timidina cinase (TK) hipoxantina guanina fosforribosil transferase (HGPRT) Veja um resumo dos dois caminhos possíveis para a síntese de nucleotídeos pela célula. Se a via de novo estiver bloqueada (como abaixo), só resta a via de salvação : Fosforribosil pirofosfato + Uridilato bloqueio com aminopterina

9. A hibridização de linfócitos é o melhor método para produzir um anticorpo monoclonal contra um determinante antigênico conhecido. Este anticorpo pode ser usado para identificar antígenos desconhecidos presentes numa mistura, porque cada anticorpo é específico para apenas um determinante antigênico . Algumas das aplicações mais comuns dos anticorpos monoclonais incluem as que se seguem.

10. 1. Identificação de marcadores fenotípicos únicos para os tipos celulares individuais. A base para a classificação moderna de linfócitos e fagócitos mononucleares é a ligação de anticorpos monoclonais população específicos . Estes têm sido usados para definir moléculas típicas de cada célula. CD3 TCR CD2 CD28 CD5 CD7 CD4 CD8 Th Tc MFR CD64 CD32 CD16 HLA-D CD35 CD11b LFA-1 Macrófago

11. 2. Imunodiagnóstico: o diagnóstico de muitas doenças infecciosas e degenerativas, depende da detecção de antí- genos e/ou anticorpos específicos na circulação ou nos tecidos, usando anticorpos monoclonais em imunoensaios. anticorpos monoclonais aglutinação Exemplo: reação de aglutinação em latex Para a imunodosagem de hormônios, marcadores tumorais e de outras proteínas séricas, sempre se usa anticorpos monoclonais soro do paciente contendo antígeno com vários epitopos idênticos partículas de latex adsorvidas com os monoclonais

12. 3.Diagnóstico e terapia de tumores: anticorpos monoclonais específicos para tumores são usados para a detecção de tumores por técnicas de imagens e para a imunoterapia.

13. 4. Análise funcional de moléculas da superfície celular e secretadas: na pesquisa imunológica, os anticorpos monoclonais que se ligam a moléculas da superfície celular e estimulam ou inibem funções celulares, são instrumentos inestimáveis para definir a função das moléculas de superfície, incluindo os receptores para antígenos . Anticorpos que neutralizam citocinas são usados para detectar a presença e os papéis funcionais destes compostos proteicos in vitro e in vivo .

14. A Biologia Molecular tem traçado o caminho para a produção de anticorpos monoclonais (mAc) de especificidade, afinidade e isotipos definidos. Isto permite aos imunologistas o desenvolvi- mento de anticorpos de determinada especificidade no camundongo, utilizando-se então os genes que expressam esta especificidade (genes que codificam VH e VL), para a construção de vetores de clona- gem e expressão, associando-os aos genes para os domínios constantes de anticorpos humanos. O mAc resultante (humanizado) é de muito baixa imunogenicidade para a nossa espécie, podendo ser utilizado em tratamentos específicos. FIM