Elisa

1. UNIVERSIDADE FEDERAL DA BAHIA INSTITUTO DE CIÊNCIAS DA SAÚDE – ICSDEPARTAMENTO DE BIOINTERAÇÃODISCIPLINA: IMUNOLOGIA I – ICS 045 ELISA (enzyme-linkedimmunosorbentassay) http://www.elisa-development.com/ Trabalho realizado pela Acadêmica de Medicina Veterinária da UFBA Ludmilla Soares Sena sob orientação dos Professores Robert Schaer, Roberto Meyer, Claudia Brodskin e Ricardo Portela. Atualizado em Fevereiro de 2010.

2. CARACTERÍSTICAS BÁSICAS http://www.elisa-development.com/

3. CARACTERÍSTICAS BÁSICAS <ul><li>Teste utilizado para detectar a presença de antígenos (Ag) ou anticorpos (Ac) específicos em fluidos corporais ou sobrenadantes de cultura.

4. Une a especificidade de uma ligação Ag-Ac com a sensibilidade de uma reação enzimática, permitindo assim a detecção de quantidades mínimas de uma substância em particular e com grande confiabilidade.

5. Uma enzima, covalentemente ligada a um Ag ou Ac, reage com um substrato, dessa forma levando a oxidação de um cromógeno incolor, o qual então desenvolverá coloração dependente da concentração de Ag/Ac pesquisados.</li></li></ul><li>CARACTERÍSTICAS BÁSICAS <ul><li> Utiliza-se uma base sólida (placa de poliestireno com 96 poços dispostos em 12 fileiras verticais, cada uma com 8 poços) na qual Ag/Ac irão se ligar através de interações hidrofóbicas.

6. É um método tanto qualitativo quanto quantitativo.</li></li></ul><li>CARACTERÍSTICAS BÁSICAS <ul><li> Elementos necessários para a realização:

7. Ag purificado (caso deseje-se detectar ou quantificar Ac)

8. Ac purificado (caso deseje-se detectar ou quantificar Ag)

9. Controles (Positivo, Negativo, Ponto de Corte) – nos ensaios qualitativos

10. Padrões (soluções com concentração conhecida do analito a ser dosado) – nos ensaios quantitativos

11. Amostras a serem testadas

12. Placa de poliestireno

13. Tampão de lavagem: utilizado para remover o Ag ou Ac livres na placa, Ag ou Ac ligados com pouca avidez e outras moléculas interferentes

14. Conjugado: Ac ou Ag ligados covalentemente a uma enzima

15. Cromógeno: substância incolor que, ao ser oxidada pela reação enzimática, produz cor

16. Leitora de ELISA (espectrofotômetro): converte as diferentes intensidade de cor resultantes ao final do ensaio em valores numéricos (valores de densidade óptica - DO) </li></li></ul><li>CARACTERÍSTICAS BÁSICAS <ul><li> Elementos necessários para a realização:</li></ul>http://www.dellta.com.br/detalhes.php?prod_id=89 http://portuguese.alibaba.com/product-gs/elisa-plate-flat-bottom-271555304.html Placas de ELISA http://www.laborlifescience.com.br/equipamentos_elisa.html Leitoras de ELISA http://www.analiticaweb.com.br/images/produtos/p4ae04e96cbc7f/placa_elisa.jpg

17. CARACTERÍSTICAS BÁSICAS <ul><li> Vantagens

18. Teste com alta sensibilidade (habilidade de detectar quantidades mínimas do Ag ou Ac pesquisados (O ELISA detecta moléculas na ordem de nanogramas) – menor risco de falsos-negativos.

19. Teste com alta especificidade (característica que indica que o teste em questão identificará somente o Ag ou Ac desejado) – menor risco de falsos-positivos.

20. Permite que várias amostras sejam testadas ao mesmo tempo.

21. Realização relativamente rápida, simples e de custo baixo a médio em comparação com outras técnicas de imunodiagnóstico.</li></li></ul><li>CARACTERÍSTICAS BÁSICAS <ul><li>Desvantagens

22. Necessidade de mão de obraespecializada.

23. Algunsreagentespodemdegradar-se com facilidade, com exposição à luz do sol ou a elevadastemperaturas.

24. Por ser umatécnicaaltamentesensível e específica, é muitosusceptível a erros de pipetagem, variaçõesnos tempos de incubação e lavagens, e alteraçõesnosreagentes.</li></li></ul><li>PRINCIPAIS TIPOS http://www.elisa-development.com/

25. PRINCIPAIS TIPOS <ul><li> INDIRETO: detecta principalmente Ac

26. SANDUÍCHE: detecta principalmente Ag

27. COMPETIÇÃO: detecta Agcom baixo peso molecular (monovalentes)

28. CAPTURA: detecção de Acs (principalmente IgM, evitando a ação do fator reumatóide)</li></li></ul><li>ELISA INDIRETO 1) Inicialmente, o Ag é adicionado à placa e se adere à superfície dos poços Y Y Y Y Y Y Y Y Y 2) Em seguida, são realizadas lavagens para a retirada do Ag livre nos poços 3) A solução a ser pesquisada é adicionada. Caso contenha Acs específicos contra os Ags presentes na placa, estes se ligarão aos Ags Y Y Y 4) Uma nova série de lavagens é realizada para retirar os Acs que não se ligaram aos Ags Y Y Y Y 5) É então adicionado o conjugado, que se liga aos Acs Y 6) Uma nova lavagem retira o conjugado livre 7) O cromógeno e o substrato são adicionados, e se o cromógeno for oxidado pela ação da reação enzimática, haverá desenvolvimento de cor Antígeno Conjugado Y Anticorpo Cromógeno

29. ELISA INDIRETO <ul><li>Interpretação dos resultados:

30. A intensidade da cor é diretamente proporcional à concentração de Ac da amostra pesquisada.

31. Para determinar quais indivíduos são positivos ou negativos para a doença pesquisada, deve-se calcular um ponto de corte (“cut-off”) para aquele ensaio. Acima dos limites do cut-off, encontram-se os indivíduos positivos e abaixo os negativos.</li></ul>Contr. Negativo -> Cut-off-> Contr. Positivo-> http://www.labimuno.org.br/ensino.cfm?load=aulas <ul><li> O ELISA Indireto não determina se o indivíduo ESTÁ ou não doente naquele momento. Ele apenas afirma se aquele animal/paciente já teve ou não contato com o agente causador da enfermidade em algum momento de sua vida.</li></li></ul><li>ELISA INDIRETO <ul><li>Aplicações na medicina humana e veterinária:

32. Diagnóstico sorológico de doenças infecto-contagiosas, onde a detecção de AcIgG, IgA ou IgE seja significativa.

33. Exemplos na Medicina Humana: diagnóstico sorológico da Doença de Chagas e da SIDA/AIDS.

34. Exemplos na Medicina Veterinária: diagnóstico da LinfadeniteCaseosa e da Leishmaniose.

35. OBS: Não deve-se detectar IgM por esta técnica devido à ação do fator reumatóide. O fator reumatóide é um auto-anticorpo geralmente da classe IgM, específico para IgG. Este fator encontra-se elevado em algumas situações, particularmente nas doenças reumáticas. Tal anticorpo pode se ligar na IgG específica (contra o antígeno teste), presente no soro do paciente, gerando assim um resultado falso positivo caso se use um conjugado anti-IgM, como no ELISA indireto. Para mensuração de IgM, deve-se utilizar o ELISA de captura.</li></li></ul><li>AÇÃO DO FATOR REUMATÓIDE NO ELISA INDIRETO PARA IgM Y Y Y Y Y Y 1) O Ag específico é adicionado á placa, e em seguida, são realizadas lavagens para a retirada do excesso não ligado 2) Adiciona-se a amostra do paciente, que contém o Ac IgM pesquisado e o Fator Reumatóide. O Fator Reumatóide pode estar ligado a Acs IgG específicos para o Ag presente na placa, formando imunocomplexos que se ligam a este Ag 3) Adiciona-se o conjugado anti-IgM 4) Adiciona-se o cromógeno e o substrato, desenvolvendo-se cor. Devido ao Fator Reumatóide unido à IgG específica, tem-se um resultado superestimado da quantidade de IgM pesquisada, podendo levar até a resultados falsos-positivos Y Y Y Y Y Y Antígeno Conjugado anti-IgM AcIgG . . . . . . . . . Y Y Y Y Y Y Y Y Y Y Y Y Y Y Y Y Y Y Y Y Y Y Y Y Y Y Y Y Y Y Y Y Y Y Y Y Y Y Y Y Y Y Y Y Y AcIgMespecí- fico pesquisado Cromógeno Fator Reumatóide

36. ELISA SANDUÍCHE Y Y Y Y Y Y Y Y Y 1) Um Ac conhecido é adicionado à placa e se liga à sua superfície 2) Lavagens são feitas para retirar os Ac livres 3) Adiciona-se a solução com o Ag a ser pesquisado e este, caso presente, se liga aos Ac nos poços Y Y Y Y Y 4) Realiza-se lavagens para retirar o Ag não capturado Y Y 5) Adiciona-se conjugado específico para o Ag procurado Y 6) Novas lavagens retiram o conjugado livre 7) O cromógeno e o substrato são adicionados, e se o cromógeno for oxidado pela ação da reação enzimática, haverá desenvolvimento de cor Antígeno Conjugado Y Anticorpo Cromógeno

37. ELISA DIRETO OU SANDUÍCHE <ul><li>Interpretação dos resultados:

38. A intensidade da cor é diretamente proporcional à concentração de Ag da amostra pesquisada.

39. Para este teste se tornar quantitativo, é necessária a construção de uma curva com os valores de densidade ótica obtidos a partir da reação de padrões com concentrações conhecidas do antígeno a ser dosado. A curva serve como padrão de comparação para deduzir as quantidades de antígenos nas soluções-teste. </li></ul>Curva Padrão (exemplo) Absorvância (450/620) Concentração de IgE http://www.shibayagi.co.jp/Prod-E/prod_akrie-211.htm

40. ELISA DIRETO OU SANDUÍCHE <ul><li>Aplicações na medicina humana e veterinária:

41. Muito usado para a dosagem de hormônios, marcadores tumorais e outras proteínas séricas, bem como para a detecção de antígenos virais e de outros patógenos nas fezes, na urina e em secreções. Pode detectar 10-12 a 10-14g.

42. Exemplos na Medicina Humana: Teste de Gravidez (teste de detecção da gonadotropina coriônica humana (HCG) no soro).

43. Exemplos na Medicina Veterinária: Triagem na indústria de alimentos (pesquisa de patógenose contaminantes nos alimentos).</li></li></ul><li>ELISA POR COMPETIÇÃO 1) Adição do Ac específico aos poços da placa 2) Lavagem para retirar os Ac livres 3) Adição da solução com o Ag a ser pesquisado e de uma outra solução contendo Ag marcado (conjugado) no mesmo poço. Os Ags competem entre si pelo sítio de ligação do Ac e aquele que estiver em maior concentração, se ligará a mais Ac Y Y Y Y Y Y 4) Lavagem para retirar os Ag não capturados Y 5) Adiciona-se o cromógeno e o substrato. Caso o conjugado tenha se ligado aos Ac da placa, ocorrerá reação enzimática e o cromógeno será oxidado, havendo desenvolvimento de cor Antígeno Conjugado Y Anticorpo Cromógeno

44. ELISA POR COMPETIÇÃO <ul><li>Interpretação dos resultados:

45. A intensidade da cor é INVERSAMENTE proporcional à concentração de ag da amostra pesquisada, ou seja, quanto maior a quantidade de Ag-teste, menor a possibilidade de ligação do Ag marcado e assim, menor a intensidade de cor emitida.</li></li></ul><li>ELISA POR COMPETIÇÃO <ul><li>Aplicações na Medicina Humana e Veterinária:

46. Dosagem de hormônios, marcadores tumorais e outras proteínas séricas. Diagnóstico sorológico de algumas doenças.

47. Exemplo na Medicina Humana: dosagem de T3, T4, testosterona, estradiol, progesterona.

48. Exemplo na Medicina Veterinária: detecção sorológica de Herpesvírus Bovino tipo I.</li></li></ul><li>ELISA DE CAPTURA 1) Adição de Ac IgG monoclonal contra IgM aos poços da placa 2) Lavagem para retirar os Ac livres 3) Adição da solução com Ac IgM específico a ser pesquisado Y Y 4) Lavagem para retirar o Ac não capturado Y Y Y 5) Adiciona-se Ag específico marcado com uma enzima (conjugado) para o Ac pesquisado Y Y Y 6) Lavagem 7) Adição de cromógeno e de substrato. Se o cromógeno for oxidado pela ação da reação enzimática, haverá desenvolvimento de cor Antígeno Anticorpo IgM . . . . . . . . Y Y Y Y Y Y Y Y Y Y Y Y Y Y Y Y Y Y Y Y Y Y Y Y Y Y Y Y Y Y Y Y Y Y Y Y Y Y Y Y Y Anticorpo IgG Cromógeno Conjugado

49. ELISA DE CAPTURA <ul><li> Interpretação dos resultados

50. Intensidade da cor diretamente proporcional à concentração de Acs.

51. Por ser um ELISA muito utilizado para a detecção de IgM, é capaz de identificar infecções na fase aguda.</li></li></ul><li>ELISA DE CAPTURA <ul><li> Aplicações na Medicina Humana e Veterinária

52. Principalmente usado para a detecção de anticorpos da classe IgM contra os mais diversos antígenos (virais, bacterianos, de protozoários) em todas as doenças em que seja importante identificar o seu recente aparecimento. Apesar de ser mais utilizado para a detecção de IgM, o ELISA de Captura também pode ser utilizado para a dosagem de outros Acs.

53. Exemplos na Medicina Humana: diagnóstico de rubéola, toxoplasmose, herpesvírus e citomegalia, em suas fases agudas, da gestante (complexo TORCH).

54. Exemplo na Medicina Veterinária: diagnóstico da Diarréia Bovina Viral (DVB).</li></li></ul><li>REFERÊNCIAS <ul><li>http://www.msd-brazil.com/msd43/m_manual/mm_sec22_243.htm

55. http://images.google.com.br/imgres?imgurl=http://www.microvet.arizona.edu/courses/mic419/ToolBox/elisa3.jpg&imgrefurl=http://www.microvet.arizona.edu/courses/mic419/ToolBox/elisa.html&usg=__S6BHPl-P0h7OPfk0xg8UxKPQY6o=&h=686&w=682&sz=56&hl=pt-BR&start=1&um=1&tbnid=gr7dJIdxrJF1eM:&tbnh=139&tbnw=138&prev=/images%3Fq%3DElisa%26hl%3Dpt-BR%26sa%3DX%26um%3D1

56. http://www.verus.net/index.php?option=com_content&task=view&id=79&Itemid=1&lang=pt_br

57. http://www.actavetscand.com/content/49/1/7

58. http://www.shibayagi.co.jp/Prod-E/prod_akrie-211.htm</li>

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Esté a ler uma amostra.

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