O documento descreve várias técnicas especiais utilizadas em microscopia, incluindo a radioautografia para localizar substâncias radioativas, a centrifugação fracionada para separar organelas celulares e a imunocitoquímica para identificar antígenos em células. Além disso, apresenta diferentes tipos de microscopia como a de fase, polarização, fluorescência e eletrônica.

1. Técnicas Especiais:
1- Radioautografia:
A radioautografia é uma técnica em que é possível a localização de
substâncias radioativas nos tecidos, esta baseia-se no efeito das radiações
sobre as emulsões fotográficas. Nesta técnica cristais microscópicos de
brometo de prata, contidos na emulsão fotográfica, agem como
microdetectores da radioatividade; esses cristais atingidos pela radiação e
depois de revelados transformam-se em grãos de prata metálica (aparecendo
negros ao microscópio), caracterizando a presença de radioatividade nas
estruturas que com este estão em contato.
Uma radioautografia é obtida da seguinte maneira: um corte de órgão, com
o isótopo radioativo previamente injetado no animal, é posto em contato com
uma película de emulsão fotográfica. Logo após, um certo tempo, a película é
revelada e os pontos negros que nesta aparecerem vão corresponder aos locais
do órgão que contêm o isótopo. Como a quantidade de grãos de prata é
relativa à radioatividade presente, a radioautografia, permite que essa
radioatividade também possa ser medida.
Essa técnica também foi adaptada para o uso em microscópios eletrônicos,
onde a emulsão é colocada sobre os cortes finos de material embebido em
resinas sintéticas; mas devido ao seu grande poder de aumento os grãos de
prata em sua maioria não aparecem globosos, mas como filamentos
enovelados.
Esse método tem sido largamente utilizado para o estudo de importantes
fenômenos biológicos como pôr exemplos a síntese de proteínas e o
metabolismo de D.N.A .
Então pôr definição de radioautografia obtemos que: “o uso combinado de
moléculas radioativas e suspensões de brometo de prata em gelatina é a
base de sua técnica”.
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2. ILUSRAÇÕES:
2- Centrifugação fracionada:
Denomina-se centrifugação fracionada o processo físico que aplica a
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3. força centrífuga para separar organelas celulares, de acordo com o coeficiente
de sedimentação de cada uma. Este depende do tamanho, forma e densidade
da partícula e também da viscosidade e densidade do meio.
Fases da técnica:
• De início remove-se o órgão em estudo de um animal recém- sacrificado,
esse órgão deve ser picados em pedaços muito pequenos e colocados em
solução apropriada, como pôr exemplo sacarose e resinas plásticas solúveis
e inertes de diferentes composições podem ser utilizadas para constituírem
uns meios de viscosidades e densidades diversas.
• Logo em seguida, os fragmentos de órgão em suspensão são colocados em
um cilindro de vidro onde dento gira em grande velocidade um êmbolo
ligado a um motor elétrico, esse equipamento é denominado
homogeneizador. Os fragmentos dos tecidos são atritados acabam
liberando as organelas.
• Encerrado este processo deixa-se a suspensão em repouso pôr alguns
minutos para que as células que ficaram intactas e as fibras do tecido
conjuntivo possam se sedimentarem. Então inicia-se a centrifugação do
sobrenadante com rotações cada vez maiores, sendo assim as organelas
mais densas se sedimentam primeiro, e cada vez que o sobrenadante é
submetido a forças centrífugas cada vez maiores obtem-se a separação dos
diversos componentes celulares.
Um aperfeiçoamento deste tipo de centrifugação é a centrifugação
contragradiente. O gradiente consiste em uma solução cuja concentração é
máxima no fundo do tubo e mínima na superfície, apresentando um
aumento gradual da concentração de cima para baixo. Sobre o gradiente
homogeneizado celular e se faz a centrifugação. As partículas migram em
direção centrífuga e param onde ocorre um equilíbrio entre a ação da força
centrífuga e a tendência de flutuação da partícula. Essa técnica permite a
obtenção de frações mais puras.
OBS.: todas as etapas de ambas as técnicas são realizadas em baixas
temperaturas, para impedir que os sistemas enzimáticos funcionem o que
lesaria as organelas durante sua separação.
Ilustrações:
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4. 3- Imunocitoquímica:
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5. Essa técnica tem como base o seguinte fato: quando uma macromolécula
estranha (antígeno), é introduzida em um organismo, este reage produzindo
uma proteína denominada anticorpo; que pôr sua vez combina
especificamente com o antígeno. Nesta técnica podem ser utilizados
marcadores acoplados a anticorpos, sem que este perca a capacidade de se
combinar com o antígeno, para isso a técnica imunocitoquímica se divide em
dois tipos: direta e indireta.
São 3 os métodos mais usados para marcar os anticorpos:
• Conjunção com composto fluorescente: esta técnica é possível devido a
identificação do anticorpo e do antígeno a que ele se liga, pelo emprego
microscópio de fluorescência.
• Conjunção com uma enzima: neste caso o anticorpo é localizado pôr meio
de técnicas histoquímicas usualmente empregadas para enzimas. A mais
utilizada é a peroxidase que pode ser visualizada tanto no microscópio
óptico como o eletrônico.
• Conjunção com uma substância que não se deixa atravessar pela luz e que
dispersa elétrons: o mais utilizado é o ouro pois suas partículas podem ser
vistas tanto no microscópio óptico como no eletrônico.
Técnica direta:
Supondo-se de um determinado órgão de um certo animal possa se extrair
e purificar quimicamente uma proteína, que será chamada de X (antígeno),
deseja-se então saber em que célula ou estrutura do órgão que ela esta
localizada, pois esta foi retirada de um órgão inteiro. Injetando-se a proteína X
num coelho, este formara um anticorpo com propriedade de se combinar
somente com ela. logo após um determinado tempo, do sangue do coelho,
pode se extrair e purificar o anticorpo contra a proteína X. Este anticorpo pode
ser ligado a um composto fluorescente podendo assim ser identificado ao
microscópio.
Então mergulhando-se um corte do mesmo órgão do qual se obteve a
proteína X numa solução que contenha o anticorpo marcado, haverá uma
combinação dos dois e os componentes teciduais que contem a proteína X
serão visíveis.
Técnica indireta:
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6. Esta técnica é realizada pôr etapas:
• 1o etapa: faz-se a imersão do corte histológico em solução com anticorpo
não marcado, obtido do sangue de um animal no qual foi injetado um
antígeno que deseja-se determinar a localização, o anticorpo fixa-se ao
antígeno que não pode ser observado ao microscópio pois o anticorpo não
esta marcado.
• 2o etapa: emerge-se o preparado em uma solução com antianticorpo
(antigamaglobulina), este antianticorpo marcado fixa-se ao anticorpo que já
esta ligado ao antígeno revelando sua localização.
Os métodos de imunocitoquímica tem sido aperfeiçoados para que se obtenha
uma localização cada vez mais precisa das macromoléculas pesquisadas, um
desses métodos aperfeiçoados é o do ouro-proteína A que tem contribuído
muito para as pesquisas em biologia celular.
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7. Microscópio de Fase:
O estudo microscópio de tecidos vivos é muito difícil, sendo que seus
componentes na maioria são incolores e transparentes. Pôr isso que é utilizado
o microscópio de contraste de fase, pois este permite o estudo de muitos
detalhes celulares in vivo . a velocidade com que a luz atravessa um corpo e o
índice de refração deste dependem da quantidade de matéria presente
(densidade), então quanto maior a densidade menor será a velocidade da luz
no interior desse corpo e menor também o índice de refração.
Como as diversas estruturas celulares tem índices de refração diferente,
causam atrasos diferentes nas ondas luminosas que as atravessam, dando
origem a diferenças de fase entre as ondas luminosas emergentes que não
podem ser visíveis. No microscópio de fase existem dispositivos especiais que
transformam essas diferenças de fase em diferenças de amplitude pôr
conseqüência diferença na intensidade luminosa, a qual a retina é sensível.
Microscópio de Polarização:
A luz, ao atravessar um filtro polaróide, torna-se polarizada, ou seja, passa
a vibrar em uma única direção. Com o segundo filtro colocado no
microscópio, acima do primeiro e com seu eixo perpendicular, a luz não
atravessa o conjunto. O primeiro filtro é chamado de polarizador e é colocado
no condensador, já o segundo filtro é colocado entre a objetiva e a ocular e é
denominado analisador.
Quando entre os dois filtros existem estruturas contendo moléculas
orientadas (Ex.: celulose, colágeno ...), essas estruturas apareceram brilhantes
contra um fundo escuro, isto ocorre porque as moléculas orientadas são
anisotrópicas e modificam o eixo de luz recebida do polarizador.
Microscópio de Fluorescência:
Diz-se substâncias fluorescentes, quando algumas substâncias são
excitadas pôr determinados comprimentos de onda, onde estas absorvem
energia e emitem luz de maior comprimento de onda. Nos microscópios
utilizam luz com fonte ultravioleta, onde as substâncias fluorescente aparecem
como estruturas brilhantes contra um fundo escuro, após a lente objetiva são
colocados filtros que permitem a passagem da luz ultravioleta, mas eliminam a
passagem da radiação para proteger os olhos do observador.
Vários corantes que são fluorescente, e que tenham afinidade pôr certos
componentes celulares, são utilizados para sua identificação; como exemplo o
alaranjado-de-acridina, que se liga ao D.N.A e ao R.N.A .
Atualmente este tipo de microscopia tem sido muito utilizado para
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8. localizar sondas fluorescentes, que são substancias diversas capazes de reagir
com quantidades mínimas de determinadas moléculas intracelulares. A
localização da sonda, pôr sua fluorescência, indica a presença da molécula
celular procurada.
Microscópio Eletrônico:
Também chamado de transmissão, possui uma alta resolução e
apresentação de imagens com grande riqueza em detalhes. Os elétrons são
produzidos graças ao aquecimento no vácuo de um filamento, o catódio, que
não emite elétrons. Essas partículas são aceleradas devido a diferença de
potencial de 60 a 100 KV que existe entre o filamento e o anódio (placa
perfurada que forma um feixe de elétrons).
Esse feixe é transmitido pôr lentes eletromagnéticas, parecida com a luz
do microscópio óptico. O condensador focaliza o feixe de elétrons no plano do
objeto, e a objetiva forma uma imagem desse objeto, essa imagem ainda é
ampliada pôr lentes projetoras e a imagem final dás-se sobre uma tela
fluorescente ou um filme fotográfico.
Devido os elétrons serem facilmente desviados pelo objeto, são realizados
cortes muito finos de tecidos que são realizados em ultramicrótomos com
navalhas de vidro ou diamante.
Microscópio Eletrônico de varredura:
Também denominado de scanning electron microscope, nesse tipo de
microscópio é colocado entre a lente eletromagnética e o objeto uma bobina
de varredura que provoca um desvio do feixe de elétrons, de tal modo que o
mesmo vai incidir ponto pôr ponto sobre o objeto em uma seqüência
determinada. O objeto pôr sua vez não se deixa atravessar pelo feixe
eletrônico, devido a sua espessura e a evaporação de metal pesado sobre a sua
superfície.
De tal modo que o feixe de elétrons que incide sobre o objeto (feixe
primário) sofre reflexões originando elétrons secundários que são capturados
pôr detectores especiais que geram um sinal elétrico, transferindo para um
monitor de vídeo.
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9. Comparação Entre o Microscópio Óptico Com o
Microscópio Eletrônico
As principais diferenças entre o microscópio eletrônico com óptico é o poder
de resolução, o limite de resolução dos melhores microscópios ópticos é de
0,2µm, então o que determina a riqueza de detalhes fornecido pôr um sistema
óptico é o seu limite de resolução e não o seu poder de aumento. Já o
microscópio eletrônico possui um sistema de resolução muito maior que é de
0,0001µm mostrando uma riqueza de detalhes surpreendentemente maior que
a do microscópio óptico.
Bibliografias consultadas:
• Junqueira e Carneiro, Histologia Básica, 9o edição, editora Guanabara
Koogan.
• Junqueira e Carneiro, biologia molecular e celular.
Texto gentilmente cedido pelo próprio autor (maloureiro@sti.com.br)
www.sti.com.br
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