Artigo bioterra v15_n2_09

REVISTA DE BIOLOGIA E CIÊNCIAS DA TERRA ISSN 1519-5228
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Volume 15 - Número 2 - 2º Semestre 2015
PADRONIZAÇÃO DA TIPAGEM SANGUÍNEA PARA ANTI- H LECITINA E ANÁLISE
DO LIMITE DE DETECÇÃO DA TÉCNICA DE TIPAGEM ABO
Maria de Jesus Rodrigues de Castro1; Jocileide dos Reis Moraes1; Rubens Alex de Oliveira Menezes2;
Luiz Carlos Nascimento da Silva3; Flávio Henrique Ferreira Barbosa4; Pablo Abdon da Costa Frances5
RESUMO
Testes laboratoriais de identificação do fenótipo dos grupos sanguíneos do sistema ABO, em manchas
secas de sangue, fornecem evidências em casos forenses com grande auxilio na elucidação desses
casos. O objetivo deste estudo é analisar o limite de detecção da técnica de tipagem ABO e implantar
uma padronização do uso do soro anti-H-lecitina para esclarecer tipagens do grupo O e subgrupo de
A, além de identificar possíveis fenótipos de Bombay. A técnica empregada inicialmente foi
Absorção-eluição em 144 amostras de sangue, coletadas e previamente fenotipadas para os grupos O,
A e B, em iguais proporções, em duas Unidades Básicas de Saúde de Macapá. Os testes foram feitos
em diferentes diluições, para confrontar esses resultados analisou-se mais 36 amostras de sangue, dos
grupos A e B, usando técnica modificada, apresentando resultados de maior sensibilidade. Os testes
realizados com o anti-H lecitina evidenciaram a importância do seu uso nas manchas do grupo O,
confirmando o fenótipo em questão.
Palavras-chave: Aglutinações, diluições, grupo sanguíneo, manchas de sangue.
STANDARDIZATION OF BLOOD TYPING FOR ANTI H LECITHIN AND ANALYSIS
OF THE LIMIT OF DETECTION ABO TECHNIQUE TYPING
ABSTRACT
Laboratory tests to identify the phenotype of the ABO blood group system in dried blood spots,
provide evidence in forensic cases with great aid in the elucidation of these cases. The aim of this
study is to analyze the detection limit of the technique of ABO and implement a standardization of
the use of anti-H serum-lecithin to clarify the group's typing and subgroup of A, and identify possible
phenotypes of Bombay. The technique was initially Absorption-elution in 144 blood samples
collected and previously phenotyped for groups O, A and B, in equal proportions, two Basic Health
Units of Macapa. The tests were conducted at different dilutions, to compare these results was
analyzed over 36 blood samples from groups A and B, using modified technique, with higher
sensitivity results. Tests conducted with lecithin anti-H showed the importance of its use in the group's
spots, confirming the phenotype in question.
Keywords: Aggregations, dilutions, blood group, blood stains.

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INTRODUÇÃO
A tipagem sanguínea em manchas de
sangue seco fornece evidências em casos de
homicídios, estupros, acidentes e tem se
mostrado de grande auxilio na elucidação desses
crimes, conjuntamente com outras provas e
testemunha. O sistema de grupos sanguíneos
ABO, consiste em três pares de alelos: A, B e O
(BAIN, 2003; DACIE; LEWIS, 1998).
Os genes A e B controlam a síntese de
enzimas específicas responsáveis pela adição de
um único resíduo de carboidrato (N- acetil-galactosamina
no grupo A e D- galactosamina no
grupo B) em uma glicoproteína básica antigênica
ou em um glicolipídio com terminal em açúcar
de L-fucose no eritrócito, conhecida como
substância H (HOFFBRAND, 2008;
FERGUSON-SMITH et al., 1976).
O gene O é amorfo e não transforma a
substância H, segundo Hoffbrand (2008),
antígenos A, B e H estão presentes na maioria das
células do organismo, incluindo linfócitos,
plaquetas, endotélio capilar venular e arterial,
células do baço, medula óssea, mucosa gástrica,
além de secreções e outros fluidos como saliva,
urina e leite (VERRASTRO, 1996;
HILLMANN, 1998).
A determinação do fenótipo ABO,
baseia-se na aglutinação de eritrócitos, através de
agregados visíveis como resultado da interação
de anticorpos específicos do tipo aglutinogênios,
naturalmente encontradas no soro através do uso
de reagentes específicos imuno-hematológicos,
que irão identificar os açúcares específicos dos
glóbulos vermelhos, pela presença ou ausência
das substâncias: A, B, e H no soro e/ou saliva e
utilizando a técnica de Absorção-eluição
(YAMAMOTO, 2000; LEE; REID, 2000).
Diferentes níveis de expressão de
antígenos A ou B nos eritrócitos podem ser
encontrados, sendo chamados de subgrupos de A
ou B, conforme a intensidade de aglutinação dos
eritrócitos com os reagentes anti-A, anti- B, anti-
A1 e anti-H. A reatividade do reagente anti-H
com as hemácias dos reagentes dos diferentes
grupos sanguíneos ABO tende a ser: O>A2>
B>A2B> A1> A1B. Os dois subgrupos de A, A1
e A2, são diferenciados sorologicamente com o
uso da reagente lecitina anti-A1, (LORENZI,
1992; VENGELEN-TYLER, 1999).
O fenótipo A2 comum em caucasianos é
detectado por meio da capacidade de aglutinarem
com soro anti A e de não aglutinarem com soro
lecitina anti A1, ao contrário do fenótipo A1,
cujas hemácias são aglutinadas na presença desse
reagente. Os dois alelos são comuns, porém com
frequência extremamente diferente nas
populações estudadas.
Atualmente os procedimentos técnicos
laboratoriais para a diferenciação dos grupos
sanguíneos disponíveis no laboratório forense da
Polícia Técnica Cientifica do Amapá- POLITEC-AP,
baseia-se na técnica de absorção-eluição em
mancha de sangue seco no tubo de ensaio
(TOCCHETTO; ESPINDOLA-2005).
Esta técnica muito trabalhosa, com
resultados subjetivos principalmente para os
subgrupos A (A1 e A2), e como um resultado
pericial não pode ser duvidoso, surgiu a
necessidade de introduzir, durante os
experimentos, uma técnica que proporcione
maior segurança que a atual, que é a técnica de
Absorção-eluição modificada por Rolim e
Sawaya (1997), que é reconhecida
mundialmente, mais sensível que a utilizada pela
POLITEC, possibilitando assim resultados mais
confiáveis.
O resultado obtido com a técnica
padronizada pelo laboratório forense permite a
detecção até a 3% para os grupos A e B, com a
modificação da técnica, usando Albumina bovina
a 6%, houve aumento da sensibilidade,
permitindo a visualização de aglutinação até a
1% para os referidos grupos.
Quanto ao uso do anti-H lecitina, houve
positividade, nos fenótipos O, A, B,
comprovando sua escala de reatividade. O
presente trabalho objetiva estudar a padronização
da tipagem para o soro anti-H lecitina, bem como
o limite de detecção da técnica de tipagem ABO:
Absorção-eluição para uso no laboratório forense
da POLITEC/AP.
MATERIAL E MÉTODOS
O material utilizado neste trabalho para
padronização das manchas teste e controle foram
obtidas nas Unidades Básicas de Saúde Congós e
Lélio Silva do município de Macapá, e duas
amostras vítima e arma branca provenientes do
Laboratório da POLITEC-AP. As amostras

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Testes e Controle foram fenotipadas por
Tipagem Direta de Soro precipitação em tubo de
ensaio, no mesmo dia da coleta para os grupos
sanguíneos: A, B e O.
As amostras foram mantidas em tubos de
ensaio e posteriormente, processadas diluições a:
5%, 3%, 2%, 1%, ½%, e na diluição a 3%
titulamos até 1/100 para cada grupo, em seguida
preparadas suas respectivas manchas e
acondicionadas em placas de plástico, cobertas
com papel alumínio perfurado, por 24 horas,
secando a temperatura ambiente. Quando secas,
acondicionadas em envelopes de papel
devidamente identificados e guardadas a
temperatura ambiente antes de ser submetidos
aos ensaios.
- Método de Fenotipagem Direta ou Globular
em Tubo de Ensaio
De acordo com Beth Vincent (1992), para
determinação do sistema ABO através da prova
direta utilizam-se dois tubos de ensaio
identificados como anti-A e anti-B,
acrescentando seus respectivos anti-soros,
centrifugando e analisando macroscopicamente
os resultados, comparando as aglutinações
obtidas com os tubos controles anti-A e anti-B
preparados simultaneamente aos testes. Como
demonstra a figura 01.
Figura 01 - Presença de Aglutinação
Fonte: Instrumento de Coleta de Dados
- Absorção-eluição em tubo de ensaio
Nas primeiras cento e quarenta e quatro
amostras foi utilizada a técnica descrita por
Tochetto e Espíndola (2005) nas 36 amostras
subsequentes empregou-se a técnica modificada
de Rolim e Sawaya, (1997).
Das manchas controle, testes e branco
previamente preparadas em papel filtro retira-se
uma porção padronizada em 6 ml x 6 ml e inicia-se
a montagem da bateria. Coloca-se um pedaço
da mancha de cada diluição em dois tubos
diferentes um referente ao anti-A e outro ao anti-
B.
Adiciona-se 100 μl de solução salina
(NaCl) a 0,9% a temperatura ambiente e duas
gotas de soroclone anti-A e anti-B (Anticorpos
Monoclonais Humanos – SEM-NPBI),
respectivamente nos tubos A e B. Deixando na
geladeira em overnight a 4° C.
No dia seguinte procede-se a lavagem
com solução salina gelada a 4° C, seguida de
agitação por dois minutos, consecutivamente por
seis vezes. Após a última lavagem, retira-se
totalmente a solução salina gelada e adiciona-se
aos tubos 100 μl de solução salina a temperatura
ambiente. Incubando a 56ºC por quinze minutos
(YAMAMOTO; MCNEILL; HAKOMORI, 1992).
Retiram-se as manchas dos tubos e deixa
o eluato chegar à temperatura ambiente.
Adicionam-se 100 μl de suspensão de células
(hemácias) a 3% em salina A e B, sendo hemácia
A no tubo que foi colocado anti-A e hemácia B
no outro tubo.
Acrescenta-se 50 μl de Albumina Bovina
a 6% (albumina bovina 22%) em todos os tubos
coloca-se para agitar por dez minutos
acompanhados de centrifugação por um minuto a
3000 rpm (BAIN, 1997).
Analisando macroscopicamente os
resultados das amostras questionadas,
comparando as aglutinações obtidas com os
tubos controles anti-A e anti-B realizados
concomitantemente aos testes, conforme
visualizado na figura 02.
Figura 02 - Aglutinações nos tubos nos controles e
amostras testes
Fonte: Instrumento de Coleta de Dados

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- A técnica para a Padronização do soro anti-
H.
Segundo Rolim e Sawaya, (1997) inicia-se
a montagem da bateria colocando um pedaço
da mancha de cada diluição testada em um tubo
referente ao anti-H, dois tubos controles anti-A e
anti-B e um Branco.
Adiciona-se 100 μl de solução salina
(NaCl) a 0,9% a temperatura ambiente e três
gotas de soro anti-H lecitina não diluído
(Anticorpos Monoclonais Humanos – SEM-NPBI),
em todos os tubos. Seguindo os passos da
técnica anterior substituindo a temperatura de
incubação de 56 º C para 60ºC (LORENZI et al.,
2003; TOCHETTO; ESPÍNDOLA, 2005).
Colocar uma gota de suspensão de células
“O” a 3% e 50 μl de Albumina Bovina a 6% em
todos os tubos. Em seguida agita-se por dez
minutos seguidos de centrifugação por um
minuto a 3000 rpm.
Analisando macroscopicamente os
resultados das amostras questionadas,
comparando as aglutinações obtidas com os
tubos controles anti-A e anti-B realizados
simultaneamente aos testes. Ocorre aglutinação
de acordo com escala de reatividade deste anti-soro
(AULER-BITTENCOURT; NEGRINI-NETO,
1996).
RESULTADOS
As 144 amostras processadas através do
Método de Absorção-eluição foram alcançadas
uma fraca aglutinação tanto nas amostras
controle quanto nas diluições testadas: A até 3%,
e B até 2%. Método de Fenotipagem Direta
segundo Beth Vincent (1992), obteve-se
aglutinação no grupo A e B até diluição 3% na
titulação 1/10.
Nas 42 amostras testadas pelo Método
Absorção-eluição segundo Rolim e Sawaya
(1997), foi visualizada uma sensibilidade maior,
permitindo caracterizar a fenotipagem até 1%
conforme demonstrado tabela 1.

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Tabela 1 – Quadro comparativo das Metodologias de Absorção-eluição
SEM
AMOSTRAS
(diluições, testes e controles)
ALBUMINA
BOVINA
AGLUTINAÇÃO
COM
ALBUMINA
BOVINA
AGLUTINAÇÃO
A 5% 08 ++ 06 ++++
A 3% 08 + 06 +++
A 2% 08 - 06 ++
A 1% 08 - 04 +
A ½ % 08 - - -
A 3% 1/10 08 - - -
A 3% 1/100 06 - - -
B 5% 06 +++ 02 ++++
B 3% 06 ++ 02 ++++
B 2% 06 + 04 +++
B 1% 06 - 04 ++
B ½ % 06 - - -
B 3% 1/10 06 - - -
B 3% 1/100 06 - - -
Amostra Forense I (arma
02 - 04 -
branca)
Amostra Forense II (vítima) 02 - 04 -
Controle A
anti-A
+ +++
Controle B
Anti-A
- -
Controle A
Anti-B
- -
Controle B
Anti-B
++ ++++
Fonte: Instrumento de Coleta de dados
(-) ausência de aglutinação (+)/(++) aglutinação fraca (+++)/(++++) aglutinação forte
Das oito amostras testadas com o anti-H
lecitina houve novamente uma maior reatividade
com a adição da albumina bovina comprovando
a maior sensibilidade da Metodologia modificada
conforme tabela 2.
Tabela 2 – Quadro quantitativo de resultados das amostras para Testes Anti-H
AMOSTRAS
(diluições, testes,
controles)
SEM
ALBUMINA
BOVINA
AGLUTINAÇÃO
COM
ALBUMINA
BOVINA
AGLUTINAÇÃO
O 10% 01 + 01 ++
O 5% - - 01 ++
O 3% 01 - - -
O 2% 01 - - -
O 1% 01 - - -
Amostra Forense I (arma
01 - - -
branca)
Amostra Forense II (vítima) 01 - - -
Controle A anti-H 01 + 01 ++
Controle B anti-H 01 + 01 +
Branco 01 - 01 -
(-) ausência de aglutinação (+)/(++) aglutinação fraca

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Devido às variações de aglutinação 5 % a
1 % para o grupo A evidenciou-se empiricamente
que apenas quatro voluntários (II) apresentaram
como resultados uma fraca reatividade,
compatível com subgrupo A2 de acordo com
tabela 3.
Tabela 3 – Quadro comparativo de resultados dos
subrupos de A
AMOSTRAS/DILUIÇÕES A
5%
A
3%
A
2%
A
1%
Voluntário I Grupo A +++ ++ + -
Voluntário II Grupo A ++ + - -
Voluntário III Grupo A ++++ +++ ++ +
Voluntário IV Grupo A +++ ++ + -
Controle I ++++ +++ ++ +
Controle II + - - -
Branco - - - -
DISCUSSÃO
Frente aos resultados alcançados nos
ensaios iniciais tornou-se necessária a otimização
da Metodologia, introduzindo a técnica descrita
por Rolim e Sawaya, (1997) a qual foi adaptada
e padronizada para nossos estudos, tendo em
vista, ter demonstrado ser mais eficaz e sensível
na determinação dos fenótipos desse sistema
(ALCANTARA, 1982).
A variação no grupo A, ocorre em função
dos subgrupos que reagem distintamente como
demonstrados na tabela 3, confirmando os
achados de Vengelen-Tyler, (1999)
evidenciando sua reatividade decrescente
A1B>A1>A2B>B>A2>O, onde os dois principais
subgrupos de A, A1 e A2
são diferenciados
sorologicamente com o uso do reagente lecitina
anti-A1 e apresentam reação diferenciada frente a
lecitina anti-H conforme tabela 4.
Tabela 4 – Quadro descritivo dos subgrupos de A frente às
lecitinas
SUBGRUPOS
LECITINA
LECITINA
DE A
ANTI-A1
ANTI-H
SG A1 +++ - ou +
SG A
+ ++
intermediário
SG A2 - ou + +++
(-) ausência de aglutinação (+)/(++) aglutinação fraca
(+++) aglutinação forte
Nos ensaios para padronização do soro
anti-H lecitina a reação do antígeno-H foi
possível nas amostras do Grupo O a 10%, na
técnica descrita por Tochetto e Espíndola (2005).
Com o uso da metodologia modificada obteve-se
uma reatividade maior, inclusive nos controles
comprovando achados de Girello e Kuhn (2000)
onde sua proporção está na ordem decrescente de
O>B>A>AB.
A pesquisa do antígeno H nas amostras
testadas destaca a importância nos casos em que
o sangue presente na mancha pertence ao grupo
O. A presença do mesmo afirma o fenótipo em
questão descartando a possibilidade de tal
resultado ser inferido devido as ausências de
antígenos, este fato é relevante no caso em que se
questiona a exiguidade de material (OLSSON;
CHESTER al., 2001). Excepcionalmente devido
à dificuldade em conseguir uma quantidade
maior de soro anti-H Lecitina não foi possível à
realização de um quantitativo mais expressivo
das amostras.
Nas amostras forenses analisadas não
houve aglutinação, possivelmente por tratar-se
de amostras coletadas em período superior a três
meses, o que inviabiliza a reação antígeno-anticorpo
ou a influência de alguns fatores como
pH do meio, temperatura, classe do antígeno,
presença de fungos e bactéria que podem
interferir na reação antígeno-anticorpo.
CONCLUSÃO
Os avanços da biologia molecular
aplicados a ciências forenses, não descartou a
importância da determinação do grupo sanguíneo
do sistema ABO, que ainda é largamente usado
nessa área. A possível discrepância entre o grupo
sanguíneo entre vítima e provável suspeito,
demonstra a necessidade desta técnica, por que
pode inocentar um indivíduo envolvido em um
crime.
A técnica de absorção-diluição em tubo
de ensaio, tem como vantagem ser de baixo custo
e boa sensibilidade sendo ainda largamente
usada, já que outras técnicas de maior
sensibilidade e custo elevado como a automação
(gel centrifugação) ainda não está disponível na
POLITEC- AP.
A técnica de Absorção-eluição
modificada por Rolim e Sawaya (1997) mostrou-se
mais sensível, permitindo chegar ao limite de
detecção da técnica de tipagem sanguínea ABO,

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1% para o Grupo B, 3% subgrupo A2 e 1%
subgrupo A1, essa variação de aglutinação para
os subgrupos provoca numerosas discussões.
Atualmente pesquisas sugerem está
ligada, ao número de sítios receptores e a sua
distribuição na superfície da hemácia. O fenótipo
A1 possui 1.000.000 de sítios/hemácia e o
fenótipo A2, 200.000 sítios/hemácias.
Com a técnica modificada citada cima, as
reações obtidas com o Anti-H lecitina,
apresentou aglutinação positiva para o grupo O,
nas diluições 10% e 5% e no controle A,
possivelmente subgrupo A2, devido a
aglutinação presente. Como realizamos poucos
testes para este anti-soro existe a necessidade de
novos estudos para se disponibilizar na rotina
forense em Macapá.
AGRADECIMENTOS
A equipe dos laboratórios das Unidades
Básicas de Saúde: Congos e Lélio Silva, pelo
apoio e incentivo na realização dos
experimentos. À Rose, que contribuiu
significativamente na coleta de dados deste
trabalho.
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______________________________________
1-Farmacêutica-bioquímica do Governo do
Estado do Amapá (GEA) - Macapá (AP), Brasil.
2-Graduação em Enfermagem pela
Universidade Federal do Amapá e Mestrado
pelo Programa de Pós Graduação em Ciências
da Saúde da Universidade Federal do Amapá,
UNIFAP. Funcionário do Governo do Estado do
Amapá lotado no Laboratório Central de Saúde
Pública do Amapá - LACEN-AP, Macapá,
Amapá, Brasil.
3-Tecnologia em Radiologia pela Faculdade
Santa Emília de Rodat. Especialista em Proteção
Radiologica pela Faculdade Santa Emília de
Rodat, tecnólogo em Radioloiga - secretaria de
estado da Saúde-AP e coordenador do curso de
tecnologia em radiologia da Faculdade de
Tecnologia do Amapá - Meta.
4-Professor Adjunto A - Nível 1 (Dedicação
Exclusiva) da Universidade Federal de Sergipe -
UFS, vinculado ao Departamento de Morfologia
na Área de Conhecimento: Microbiologia e
Imunologia.
5-Graduação em Ciências Biológicas
modalidade Licenciatura e Bacharelado pela
Universidade Federal do Pará. Mestrado em
Genética e Biologia Molecular pela
Universidade Federal do Pará. Doutorado em
Genética e Biologia Molecular pela
Universidade Federal do Pará. Perito Criminal -
Polícia Técnico- Científica.
Correspondência: Rubens Alex de Oliveira
Menezes – Avenida João Guerra, nº1566, Bairro
dos Congós. CEP: 68904360. Macapá – AP,
Brasil. E-mail: ra-menezes@hotmail.com

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