O documento discute critérios para escolha de testes de imunodiagnóstico, destacando a importância da especificidade e sensibilidade para fornecer resultados confiáveis. A escolha deve levar em conta o custo, amostra disponível, antígeno-alvo e espécie animal. Métodos como imunodifusão e hemoaglutinação fornecem resultados qualitativos, porém possuem baixa sensibilidade e especificidade.

1. CRITÉRIOS PARA ESCOLHA DE TESTES DE IMUNODIAGNÓSTICO: NA BANCADA E NO LABORATÓRIO CLÍNICO RICARDO WAGNER DIAS PORTELA, DVM PhD LABORATÓRIO DE IMUNOLOGIA E BIOLOGIA MOLECULAR INSTITUTO DE CIÊNCIAS DA SAÚDE UFBA

2. COM TANTAS TÉCNICAS DIFERENTES, E COM MUITAS DELAS DESTINADAS A DIAGNOSTICAR AS MESMAS PATOLOGIAS, QUAIS ESCOLHER? EM QUE SE BASEAR NA HORA DE RECEITAR OU UTILIZAR NA ROTINA LABORATORIAL?

3. 1- INTRODUÇÃO 1.1- Principais características das Respostas Imunes Adquiridas: Especificidade Diversidade Memória Especialização Autolimitação Não reatividade ao próprio

4. 1- INTRODUÇÃO 1.1- Principais características das Respostas Imunes Adquiridas: Especificidade – conferida por duas moléculas principais: - TCR – presente na membrana de linfócitos; - Anticorpos – produzidos por linfócitos B, presentes na membrana de linfócitos B e na forma secretada, solubilizados em diversos fluidos corporais.

5. 1- INTRODUÇÃO 1.2- Principais isotipos de anticorpos IgM IgG IgA IgE IgD

6. 1- INTRODUÇÃO 1.2- Principais isotipos de anticorpos: IgM IgG – encontrado em maior concentração no soro, de obtenção mais fácil, sofre maturação de afinidade IgA IgE IgD

7. 1- INTRODUÇÃO 1.2- Principais isotipos de anticorpos : IgM IgG – MARCADOR DE CONTATO DO INDIVÍDUO COM O AGENTE INFECCIOSO IgA IgE IgD

8. Testes sorológicos Detecção de anticorpos específicos no soro, produzidos por um indivíduo após contato com agente infeccioso Anticorpo – marcador de infecção Somente produzido após contato com o Antígeno – RI Adaptativa

9. Estrutura dos Isotipos de Anticorpos: Os diferentes isotipos de Acs apresentam estruturas variadas

10. IgM - Neutralizam toxinas Fixam o complemento Receptor de antígenos na superfície dos Linf. B Marcador de fase aguda de doenças infecciosas

11. IgG - Quatro subclasses: IgG1, IgG2, IgG3 e IgG4 neutralizam toxinas (todos) fazem opsonização (IgG1 e IgG3) fixam complemento (IgG1, IgG2 e IgG3) são os únicos que podem atravessar a placenta (IgG2)

12. IgA - neutralizam toxinas bloqueiam a ligação de antígenos nas mucosas Apresentam-se na forma dimérica

13. IgE Levam a degranulação de mastócitos e basófilos. Participam da imunidade contra helmintos Participam das reações de Hipersensibilidades

14. Características dos Isotipos de Anticorpos:

15. Características dos Isotipos de Anticorpos:

16. Características dos Isotipos de Anticorpos:

17. Principais Características dos Ensaios de Imunodiagnóstico: Especificidade Sensibilidade Repetitividade Reprodutibilidade Limite de Detecção Linearidade

18. ESPECIFICIDADE + SENSIBILIDADE = CONFIABILIDADE - Especificidade : Característica que indica que o teste em questão identificará somente o antígeno ou o anticorpo desejado. Quanto MAIOR a especificidade, MENOR a ocorrência de resultados falsos-positivos, MENOR a ocorrência de reações cruzadas.

19. ESPECIFICIDADE + SENSIBILIDADE = CONFIABILIDADE - Especificidade : Importante principalmente quando aplicada a doenças infecciosas. Doenças de notificação obrigatória – confere a certeza sobre o status infeccioso do paciente ou, no caso animal, evitando sacrifícios desnecessários e prejuízos. Importante para um correto controle sanitário de rebanho, evitando a introdução de animais infectados e a disseminação da doença. OBRIGATÓRIA ALTA ESPECIFICIDADE EM TESTES CONFIRMATÓRIOS

20. ESPECIFICIDADE + SENSIBILIDADE = CONFIABILIDADE - Sensibilidade : Característica inerente ao método estreitamente relacionada com a quantidade mínima de antígeno ou anticorpo que poderá ser detectada -Quanto MAIOR a sensibilidade, MENOR a ocorrência de resultados falsos-negativos, MAIOR a possibilidade de detecção precoce de doenças. Métodos enzimáticos, radioativos, fluorescentes, quimioluminescentes.

21. ESPECIFICIDADE + SENSIBILIDADE = CONFIABILIDADE - Sensibilidade : Importante característica que se aplica principalmente a doenças infecciosas, marcadores tumorais e hormônios encontrados em baixa concentração. Um kit de alta sensibilidade permite a detecção precoce de patologias, levando a um tratamento mais efetivo e mais rápido, melhorando o prognóstico do paciente. ALTA SENSIBILIDADE OBRIGATÓRIA EM TESTES DE TRIAGEM

22. Curso do Processo Infeccioso: Parasitemia / Viremia / Bacteremia

23. Curso da Infecção: Concentração de Anticorpos e Número de Linfócitos T Efetores

24. ESPECIFICIDADE + SENSIBILIDADE = CONFIABILIDADE - Exemplos Práticos: Ensaio com boa especificidade e baixa sensibilidade Interpretação dos Resultados: Resultado + - Confiável Resultado - - A confirmar

25. ESPECIFICIDADE + SENSIBILIDADE = CONFIABILIDADE - Exemplos Práticos: Ensaio com alta sensibilidade e média especificidade Interpretação dos Resultados: Resultado + - A confirmar Resultado - - Confiável

26. CUSTO DO ENSAIO + SENSIBILIDADE / ESPECIFICIDADE = RELAÇÃO CUSTO / BENEFÍCIO

27. ADEQUAÇÃO DA AMOSTRA As amostras disponíveis são compatíveis com a metodologia a ser empregada/proposta AMOSTRA NÃO É SÓ SORO: Urina Fezes Líquido Céfalo-raquidiano Sêmen Lágrima Saliva O perfil dos componentes das amostras podem interferir nos testes, p. ex. as enzimas da saliva, as bactérias das fezes...

28. Um teste sorológico pode ser qualitativo, semi-quantitativo ou quantitativo: - qualitativo , se os seus resultados informam apenas se houve ou não reação / detecção ( positivo ou negativo ). Veja um laudo imaginário: Teste – detecção por ELISA de anticorpos IgM contra rubéola Resultado: positivo semi-quantitativo , se a amostra testada (soro) foi diluída – a maior diluição a apresentar reação é o seu título. Veja um laudo imaginário: Teste – detecção por imunofluorescência de anticorpos IgG contra o T. cruzi Resultado: positivo até a diluição de 1:320 quantitativo, se é capaz de informar a quantidade absoluta do material detectado. Veja um laudo imaginário: Teste – detecção por ELISA de anticorpos IgM contra o T. gondii Resultado: 63 UI/ml

29. Resultado de um teste ELISA Esta placa será lida por um fotocolorímetro, que informará os valores de den- sidade ótica. Todos aqueles que apresentarem resultados abaixo do “ cut-off” serão considerados negativos, enquanto que os que mos- trarem valores maiores, serão positivos. Trata-se portanto de um teste qualitativo Cont. negativo Cut-off Cont. positivo

30. Hemoaglutinação Passiva Teste semi-quantitativo Soros testes controle positivo controle negativo diluições seriadas dos soros testes de 1: 2 a .................. 1:1024 Na primeira fileira (de cima para baixo), a reação foi positiva até a diluição de 1:32 . Já na segunda fileira o resultado foi negativo em todas as diluições. O resultado do primeiro soro teste acima referido é: reagente até a diluição de 1:32 (ou título:1:32 ). O segundo soro teste é não reagente .

31. A maior ou menor sensibilidade e especificidade de um teste sorológico depende de qual é a sua finalidade. - Para diagnóstico - é necessário a utilização de testes mais específicos. Nestes casos, é importante que sejam evitados os testes falso-positivos. - Para triagem em Banco de Sangue (ou outras finalidades similares)– os testes são usados com fins preventivos, ou seja, a função é prevenir a contaminação do receptor. Aqui busca-se evitar os testes falso-negativos (a repetição de um teste com resultado falso-positivo custa pouco, entretanto, a disseminação da doença em conseqüência de um resultado falso-negativo, tem que ser impedida a todo custo).

32. O QUE LEVAR EM CONTA NA HORA DE ESCOLHER O MÉTODO DE DIAGNÓSTICO? -Sensibilidade; Especificidade (confiabilidade de resultados); Custo (PRIMORDIAL NA MED. VETERINÁRIA); Disponibilidade de material; Segurança; Aplicabilidade à amostra disponível, Ag/Ac a ser detectado e espécie animal a ser analisada; Tempo de realização do método.

33. Utilização de ensaios sorológicos: Definição da suspeita clínica Diferenciação de fases da doença Diagnóstico de doença congênita Triagem sorológica em banco de sangue Seleção de doadores e receptores de órgãos para transplante Prognóstico da doença Avaliação / monitoramento da terapêutica Diferenciação da imunidade naturalmente adquirida ou artificialmente induzida Estabelecimento da prevalência da doença Verificação de erradicação da doença Verificação de reintrodução de novos casos em áreas consolidadas

34. 2- PRINCIPAIS MÉTODOS LABORATORIAIS HISTÓRICO CARACTERÍSTICAS GERAIS DOS PRINCIPAIS MÉTODOS LABORATORIAIS QUE EMPREGAM ANTICORPOS VANTAGENS E DESVANTAGENS DOS MÉTODOS

35. 2- PRINCIPAIS MÉTODOS LABORATORIAIS 2.1- Imunodifusão : Interação Ag/Ac realizada em meio sólido (gél de ágar) Diversos tipos: Imunodifusão Radial Simples - Ag ou Ac imobilizado no gel – Migração do Ag ou Ac da solução teste no gel, até atingir região de concentração equivalente; - Imunodifusão Dupla e Outcherlony – Ambos Ag e Ac migram no gel, formação de banda na região de equivalência.

36. 2- PRINCIPAIS MÉTODOS LABORATORIAIS Método qualitativo empregado para doenças infecciosas e autoimunes – Baixa Sensibilidade, boa especificidade Usado antigamente para diagnóstico sorológico de Brucelose, e algumas doenças virais EM DESUSO

37. 2- PRINCIPAIS MÉTODOS LABORATORIAIS Método quantitativo empregado para dosagem de moléculas presentes em alta quantidade em amostras, por exemplo, dosagem de Imunoglobulinas Totais. Baixa Precisão, baixa sensibilidade

38. 2- PRINCIPAIS MÉTODOS LABORATORIAIS 2.2- Imunodifusão: Vantagens – Método de fácil execução, tempo curto de realização, baixo custo, não necessita de aparato sofisticado Desvantagens – Baixa sensibilidade, especificidade, difícil preservação do gel, não aplicável a alguns isotipos de imunoglobulinas. - Pouco utilizado atualmente como ferramenta de imunodiagnóstico. Empregado como controle em produção de policlonais.

39. 2- PRINCIPAIS MÉTODOS LABORATORIAIS 2.3- Hemoaglutinação – Utiliza hemácias sensibilizadas com Ags na membrana, que formam complexos de alto peso molecular quando incubadas com Acs específicos para os antígenos. - Permite maior diluição da solução teste que a Imunodifusão. Forma complexos mais pesados, que precipitam com maior velocidade e facilidade: Melhoria da detecção da interação entre Ag-Ac; Variações no método: Inibição da Aglutinação .

40. 2- PRINCIPAIS MÉTODOS LABORATORIAIS Método qualitativo e semi-quantitativo empregado para detecção de anticorpos específicos e moléculas abundantes em membranas de células. Utilizado ainda em Med. Veterinária, apesar de impreciso.

41. 2- PRINCIPAIS MÉTODOS LABORATORIAIS 2.3- Hemoaglutinação: Vantagens : Método simples, de fácil execução, baixo custo, rápido; Desvantagens: Baixa sensibilidade e média especificidade, devido a mau armazenamento das hemácias, pode-se obter resultados falso-negativos.

42. 2- PRINCIPAIS MÉTODOS LABORATORIAIS 2.4- Fixação do Complemento : Variação da técnica de Hemoaglutinação, onde utiliza-se a capacidade citolíca do Sistema de Complemento para amplificar a detecção da interação Ag/Ac. Variações da técnica: Inibição da Fixação do Complemento.

43. 2- PRINCIPAIS MÉTODOS LABORATORIAIS 2.4- Fixação do Complemento:

44. 2- PRINCIPAIS MÉTODOS LABORATORIAIS 2.4- Fixação do Complemento: Vantagens: Maior sensibilidade do que a Hemoaglutinação, rápida execução, baixo custo; Desvantagens: Devido a problemas na preservação do Complemento, e na sua estabilidade, problemas de falso negativos podem ocorrer.

45. 2- PRINCIPAIS MÉTODOS LABORATORIAIS 2.5- ELISA (Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay) – Técnica que utiliza Ag/Ac imobilizado em placa de polímero de carbono, e anticorpo conjugado a uma enzima, a qual, após agir sobre seu substrato em presença de substância cromógena, amplificará a detecção da interação Ag/Ac através da formação de cor; Variações da Técnica: ELISA Quimioluminescente, ELISA Fluorescente, ELISA Radioativo

46. Outros componentes do soro ELISA “SANDWICH” Antígeno a ser dosado Anticorpo primário Anticorpo conjugado TMB Enzima Peroxidase

47. ELISA DE COMPETIÇÃO Outros componentes do soro Antígeno a ser dosado Anticorpo primário Antígeno biotinilado TMB ST-AV- Peroxidase

48. ELISA DE CAPTURA Anticorpo anti-IgM IgM a ser detectada IgM inespecífica Antígeno biotinilado TMB ST-AV- Peroxidase

49. ELISA INDIRETA Antígeno purificado IgM a ser detectada IgM inespecífica Anticorpo conjugado TMB

50. 2- PRINCIPAIS MÉTODOS LABORATORIAIS 2.5- ELISA: Vantagens: Método altamente sensível e específico, com alto grau de confiabilidade como ensaio quantitativo, custo baixo a médio. Desvantagens: Devido a alta sensibilidade, pequenas variações de pipetagem e tempo de incubação podem ocasionar resultados alterados; em extratos de antígenos, não se pode precisar a qual antígeno houve a resposta; ELISA de competição muito susceptível a erros de manipulação.

51. 2- PRINCIPAIS MÉTODOS LABORATORIAIS 2.5- ELISA: Vantagens: Método altamente sensível e específico, com alto grau de confiabilidade como ensaio quantitativo, custo baixo a médio. Desvantagens: Devido a alta sensibilidade, pequenas variações de pipetagem e tempo de incubação podem ocasionar resultados alterados; em extratos de antígenos, não se pode precisar a qual antígeno houve a resposta; ELISA de competição muito susceptível a erros de manipulação.

52. 2- PRINCIPAIS MÉTODOS LABORATORIAIS 2.5- ELISA: Método Quantitativo de melhor relação custo/benefício em veterinária, para quantificação de hormônios (sexuais, tireoidianos, hipofisários, metabólicos...) Método de triagem para detecção de doenças infecciosas, alta sensibilidade, alta especificidade, mas podendo apresentar resultados falso-positivos, que devem ser confirmados por outros ensaios.

53. 2- PRINCIPAIS MÉTODOS LABORATORIAIS 2.6- Imunofluorescência / Imunohistoquímica : Utilizados para detecção e localização de antígenos em células e tecidos (IF Direta) e para detecção de anticorpos específicos em fluidos biológicos (IF Indireta) Métodos de alta especificidade e boa especificidade Utilização de anticorpos conjugados com substâncias fluorescentes (FITC, FAC)

54. 2- PRINCIPAIS MÉTODOS LABORATORIAIS 2.6- Imunofluorescência / Imunohistoquímica:

55. 2- PRINCIPAIS MÉTODOS LABORATORIAIS 2.6- Imunofluorescência / Imunohistoquímica: Vantagens: Alta especificidade e boa sensibilidade; possibilidade de detecção de proteínas intracelulares e de sua localização, bem como do tráfico intracelular. Desvantagens: “variação individual” na leitura de resultados de IFA; alto custo de microscópio de fluorescência; técnicas especiais de fixação e inclusão de tecidos para Imunohistoquímica nem sempre disponíveis.

56. 2- PRINCIPAIS MÉTODOS LABORATORIAIS 2.7- Western-Blot : Associação de técnica de Eletroforese em Gel de SDS-PAGE com técnicas imunológicas Permite a identificação do reconhecimento de antígenos com peso molecular definido Identificação de anticorpos que reconhecem determinado antígeno em solução contendo diversos antígenos

57. 2- PRINCIPAIS MÉTODOS LABORATORIAIS 2.7- Western-Blot:

58. 2- PRINCIPAIS MÉTODOS LABORATORIAIS 2.7- Western-Blot: Pode auxiliar na diferenciação de espécies de Leishmania que infectam o animal Diferenciação do animal infectado do vacinado (dependendo do tipo de vacina)

59. 2.7- Western-Blot: Vantagens: alta sensibilidade e especificidade; reconhecimento de antígenos individuais em um extrato; realização de perfil de reconhecimento de antígenos e determinação de proteínas imunodominantes; Desvantagens: Custo médio a alto; procedimento longo e propenso a erros em diversos pontos; dependendo do sistema de revelação, pode-se ter problemas de segurança. POUCO DISPONÍVEL AINDA PARA VETERINÁRIA 2- PRINCIPAIS MÉTODOS LABORATORIAIS

60. Métodos de Diagnóstico utilizando Avanços Biotecnológicos no Brasil Leishmaniose canina – PCR, RFLP. Babesia canis, Ehrlichia canis – RFLP, RAPD. Leishmaniose – Citometria de Fluxo, Ags específicos Animais de Produção – Busca de diagnóstico rápido e preciso, podendo ser realizado a campo.

61. SITUAÇÃO DA BIOTECNOLOGIA ANIMAL NO BRASIL: MERCADO BIOTECNOLÓGICO ANIMAL: Mercado brasileiro de vacinas: US$ 221 milhões (2006) Principalmente animais de produção, com participação de animais de companhia MERCADO EM FRANCA EXPANSÃO Não há dados disponíveis quanto ao diagnóstico veterinário

62. Colaboradores: Prof. Vasco Azevedo – ICB/UFMG Profa. Maria de Fátima Costa – ICS/UFBA Prof. Luis Pita – EMEV/UFBA Dr. Rodrigo Soares – CPqRR/FIOCRUZ-MG Dr. Lain Pontes-Carvalho – CPqGM/FIOCRUZ-BA Prof. Joaquin Patarroyo – DVT/UFV Doutorandos: Bruno Bastos Soraya Correa Mestrandos: Daniele Dantas Miriam Rebouças Gabrielle Rodrigues Ítala Fehlberg Inara Rodrigues Marcos Silva Andrea Magalhaes Osman Silva Jr. Patrícia Cisneiros Iniciação Científica: Ana Paula Portela Marilia Marques Jose Tadeu Raynal Ludmila Sena Aretha Alves Rejane Rodrigues Pesquisadores: Prof. Roberto Meyer Dra. Songeli Freire Profa. Lilia Moura Costa Profa. Vera Vale Prof. Ricardo Portela Dr. Edson Rodrigues Profa. Kyioko Abe-Sandes Profa. Ivana Nascimento www.labimuno.org.br