Este documento descreve o método ELISA (Enzyme-linked immunosorbent assay), um método imunológico usado para quantificar antígenos e anticorpos. O ELISA Sanduíche é descrito em detalhes, no qual um anticorpo é usado para capturar o antígeno alvo e um segundo anticorpo conjugado a uma enzima é usado para detectá-lo, resultando em uma mudança de cor proporcional à quantidade de antígeno presente. Os equipamentos e procedimentos necessários para realizar o teste ELISA também são explicados.

1. Os métodos imunológicos desenvolvidos para quantificar a concentração de
antígenos e anticorpos, por apresentarem grande sensibilidade e especificidade,
tornaram-se técnicas padronizadas para pesquisa e aplicações clínicas. Entre
esses métodos, um dos mais usados é o ELISA (Enzyme-linked immuno sorbent
assay).
Nesse método, uma enzima, que reage com um substrato incolor para
produzir um produto colorido, é covalentemente ligada a um anticorpo específico
que reconhece um antígeno alvo. Se o antígeno estiver presente, o complexo
anticorpo-enzima irá ligar-se a ele e a enzima catalisará a reação. Então, a
presença de produto colorido indica a presença de antígeno. Trata-se de um
método eficiente pois permite detectar quantidades de proteína da ordem de
nanogramas (10-9
g).
No ELISA, deve-se selecionar um par de anticorpos, que podem ser
monoclonais ou policlonais. O uso de anticorpos monoclonais resulta em maior
especificidade.
Dentre os diversos tipos de ELISA, destaca-se o ELISA SANDUÍCHE.
Nesse método, o anticorpo de um antígeno particular é, inicialmente, adsorvido no
well. Depois, o antígeno (soro, urina ou outra solução contendo o antígeno) é
adicionado e se liga ao anticorpo. Finalmente, um segundo e diferente anticorpo
ligado à enzima é adicionado. Nesse caso, a intensidade da reação é proporcional
à quantidade de antígeno presente. Logo, permite mensurar até pequenas
quantidades de antígeno.
[After R. A. Goldsby, T. J. Kindt, B. A. Osborne, Kuby Immunology, 4th ed. (W. H.
Freeman and Company, 2000), p. 162.]

2. http://www.callisto.si.usherb.ca:8080/iml302/images/elisa3.jpg
Quanto ao método de revelação, pode ser direto ou indireto. No primeiro, a
enzima reveladora encontra-se ligada diretamente ao segundo anticorpo,
enquanto no indireto, a enzima apresenta-se ligada a um anti-anticorpo.
O ELISA constitui a base do teste para infecção por HIV. Nesse teste,
proteínas virais (os antígenos) adsorvem nos “poços” (wells) da placa de ELISA.
Em seguida, é adicionado soro do paciente contendo anticorpos que se ligam aos
antígenos. Finalmente, anticorpos ligados à enzima ligam-se aos anticorpos
humanos, propiciando a reação enzimática com mudança de cor.
EQUIPAMENTOS NECESSÁRIOS:
 PLACA DE ELISA
[After R. A. Goldsby, T. J. Kindt, B. A. Osborne, Kuby Immunology, 4th ed. (W. H.
Freeman and Company, 2000), p. 162.]

3.  PIPETAS AUTOMÁTICAS
 LEITOR DE ELISA
 LAVADOR AUTOMÁTICO DE PLACAS
http://www.jaelsa.com/imagenes/pipeta1.jpg
Leitor de tiras ELISA
http://www.rclcomercial.com.br/drake/i004.jpg
http://pandora.labgeminis.com:8909/images/
8x200_ul.jpg
http://www.labgeminis.com/publicidad/la_tecnica_elisa.htm
Leitor de placas ELISA
http://www.labgeminis.com/publicidad/la_tecnic
a_elisa.htm

4. CUIDADOS:
 Data de validade e estocagem dos REAGENTES
 Processamento e estocagem das AMOSTRAS
 Evitar contaminação e espuma no PREPARO DE
SOLUÇÕES
 CALIBRAÇÃO de pipetas e demais aparelhos
 LIMPEZA
PROCEDIMENTO PARA ELISA SANDUÍCHE:
 Coloca-se, na placa de ELISA, solução tampão contendo o
primeiro anticorpo com concentração conhecida e suficiente para
adsorver nos “poços” (“wells”) da placa. Em geral, a solução é
saturada.
 Lavam-se os “poços” com tampão de lavagem, de forma a retirar
o tampão, mas deixar o anticorpo aderido à placa.
 Adiciona-se solução contendo proteína de alto peso molecular,
como a BSA (Albumina de Soro Bovino), com o objetivo de
bloquear as áreas onde os anticorpos não aderiram na placa
(sítios inespecíficos).
http://www.iitri.org/ServImmunology.shtml
1O
ANTICORPO
2O
ANTICORPOANTÍGENO DA
AMOSTRA
ANTICORPO
LIGADO
MUDANÇA DE
COR
ADAPTADO DE: http://www.med4you.at/laborbefunde/techniken/enzyme/eliza.gif

5.  Realiza-se nova lavagem e a etapa de SENSIBILIZAÇÃO da
placa está cumprida.
 Incubação com as amostras (soluções teste com antígenos em
concentração desconhecida devem ser adicionadas à placa)
 Nova lavagem e o antígeno que reagiu com o anticorpo
previamente aderido à placa também permanecerá aderido. Por
outro lado, os antígenos não ligados serão removidos.
 Incubação com segundo anticorpo, seguida de lavagem.
 Incubação com terceiro anticorpo anti-espécie conjugado a uma
enzima, como a peroxidase. Segue-se outra lavagem.
 Adição de substrato para revelação. Trata-se de um substrato
incolor que, quando ativado pela porção enzimática do ligante,
produz um produto final corado. A mudança de cor pode ser lida
diretamente em aparelho apropriado. Em geral, bloqueia-se a
reação para evitar que o produto final fique muito escuro e
atrapalhe a leitura do teste. Além de bloquear a reação, é
possível adicionar um ácido que provoque mudança para uma
cor cuja absorbância é melhor detectada pelo leitor de ELISA.
OBSERVAÇÕES IMPORTANTES
 Em geral, faz-se uma CURVA PADRÃO, preenchendo 8
“poços” de uma fileira com concentrações crescentes e
http://www.positivehealth.com/permit/Articles/
Colon%20Health/abraham62.htm
http://www.netria.co.uk/images/elisa2.jpg

6. conhecidas de antígeno. A curva serve como padrão de
comparação para deduzir as quantidades de antígenos nas
soluções-testes. O gráfico é fornecido por um programa
próprio para a leitura de ELISA.
 Um outro controle feito é o TESTE BRANCO, que consiste
na adição somente do tampão com o objetivo de avaliar se
houve contaminação durante o experimento.
 O teste deve ser feito em DUPLICATA ou TRIPLICATA,
servindo de controle para os erros de manuseio. A média
dos resultados deve ser avaliada e se houver diferença
significativa, o experimento deve ser repetido.
 PROCESSAMENTO DA AMOSTRA: se a amostra for
sangue, deve-se centrifugar, colher o plasma ou soro, diluir
e analisar. Células em cultura devem ser trituradas, o
tampão deve ter pH adequado, substância detergente(para
http://www.shibayagi.co.jp/Prod-E/prod_akrie-211.htm
EXEMPLO DE CURVA PADRÃO

7. lisar a membrana) e inibidores de proteases. Depois,
centrifuga-se e colhe-se o sobrenadante para análise.