1) O documento discute o diagnóstico molecular de vírus respiratórios, comparando diferentes métodos como cultura celular, testes rápidos, imunofluorescência e PCR. 2) É destacada a importância de detectar novos vírus como o metapneumovírus e bocavírus humano usando técnicas moleculares como PCR em tempo real. 3) A detecção frequente de coinfecções virais e a interação entre vírus e bactérias respiratórias são abordadas.

1. Diagnóstico molecular das viroses respiratórias Vlademir V. Cantarelli, PhD Weinmann Laboratório LTDA Centro Universitário Feevale 16/06/2009 - 17:30 - 18:30 sala Brochier

3. Diagnóstico viral É uma virose!

6. Diagnóstico viral Rapidez Facilidade Precisão Sensibilidade Testes Rápidos Imunofluorescência Testes Moleculares $ $ $

10. Imunofluorescência Anticorpo marcado Antígeno viral Lâmina com a amostra Y Y Y Excitação Emissão

11. Imunofluorescência hMPV IFV Resultados rápidos (horas) Não disponível para alguns vírus respiratórios Para hMPV: Não recomendado (sensibilidade ~ 68%*) *Comparado com método molecular

13. Cultura para detecção de VR *Especialmente importante para adenovirus N/D 49 – 58 Adenovirus* N/D 80 – 95 Parainfluenza 74 – 95 90 – 99 VRS 53 – 94 80 – 98 Influenza Testes rápidos Imunofluorescência Sensibilidade comparada com cultura celular (%)

14. Detecção de Vírus Respiratórios: Adenovírus hMPV Limitações dos testes: 1 2 3 1. Urina 2. LCR 3. Sangue

15. Diagnóstico Molecular - PCR

16. PCR Convencional Amplificação (PCR) 2 - 4 h Eletroforese 30 – 40 min Detecção (Brometo de etídio) Fotodocumentação Coleta Extração DNA/RNA (1 h)

18. PCR em Tempo Real Amplificação (PCR) 2 - 4 h Eletroforese 30 – 40 min Coleta Extração DNA/RNA (1 h) Amplificação e Detecção de amostras (40 min) PCR em Tempo Real

19. Infecção Respiratória: Detecção de Agentes Virais Clássicos PI1 PI3 PCR Tempo Real Multiplex RSV IA IB

20. Detecção de Rinovirus Genótipos distintos (>100)

22. Freqüência dos VR detectados por PCR-TR Pilger 2009 – Tese de Doutorado 455 amostras respiratórias Crianças < 2 anos Hospital Santo Antonio Sinais clínicos de ITR inferior (maio 2007 – junho 2008) 2 (0,4) PIV 2 7 (1,6) PIV 1 9 (2,0) ADV 26 (5,8) PIV 3 30 (6,7) Flu B 94 (20,9) Flu A 222 (49,3) RSV Número (%) Vírus

23. PCR Tempo Real X IF Pilger 2009 – Tese de Doutorado (VRS, FluA & B, PIV 1,2,3, ADV) (+ hBov, hMPV, RNV) 455 (100) - - 37 (8,1) 321 (70,6) 97 (21,3) PCR-TR p/ 7 VR (%): 455 (100) 8 (1,8) 47 (10,3) 144 (31,6) 210 (46,2) 46 (10,1) PCR-TR p/ 10 VR (%): 455 (100) Total - 4 - 3 5 (1,1) 2 242 (53,2) 1 208 (45,7) 0 IF p/ 7 VR (%): Número de Vírus

24. n = 267 IRA PCR: 43% IFD: 19% Cultura: 14% =

27. Infecção Respiratória: Novos vírus Metapneumovirus 2001

31. Detecção de Bocavirus humano PCR convencional:

32. Infecção Respiratória: Novos vírus Bocavirus 2005

33. 321 amostras respiratórias 36 (14,5%) positivas para hBoV Clinical Virology Symposium Daytona Beach – FL - 2008

34. Freqüência de outros VR em amostras respiratórias Pilger 2009 – Tese de Doutorado 455 amostras respiratórias Crianças < 2 anos Hospital Santo Antonio Sinais clínicos de ITR inferior (maio 2007 – junho 2008) 60 (13,2) hBOV 66 (14,5) hMPV 112 (24,9) RNV Número (%) Vírus

35. Distribuição dos VR em amostras respiratórias Pilger 2009 – Tese de Doutorado 59,3 270 Total RSV+hBoV+RNV RSV+Pertussis hMPV FluA+RNV RSV+hMPV RSV+hBoV RNV RSV+RNV FluA RSV Vírus 4,0 18 4 1,3 6 10 1,5 7 9 2,2 10 8 2,9 13 7 3,1 14 6 3,3 15 5 5,5 25 3 8,8 40 2 26,8 122 1 % Freqüência

38. Infecções múltiplas - Hipótese Virus 1 Virus 3 Virus 2 Tempo PCR (a) [ ] viral Liberação de citocinas Ativação de Linf. Th1/Th2 Modulação da imunidade Modificação de receptores infecções secundárias? PCR (c) PCR (b)

39. Coinfecção em viral amostras respiratórias Pilger 2009 – Tese de Doutorado 59,3 270 Total RSV+hBoV+RNV RSV+Pertussis hMPV FluA+RNV RSV+hMPV RSV+hBoV RNV RSV+RNV FluA RSV Vírus 4,0 18 4 1,3 6 10 1,5 7 9 2,2 10 8 2,9 13 7 3,1 14 6 3,3 15 5 5,5 25 3 8,8 40 2 26,8 122 1 % Freqüência

40. Patógenos Respiratórios Bacterianos B.pertussis B.parapertussis B.bronchiseptica Mycoplasma pneumoniae Bordetella spp

41. Presença de Bordetella pertussis em amostras respiratórias de crianças n = 78 Cantarelli, et al., 2002 IFD ( sem clínica conhecida )

43. Influenza A Neuraminidase (N) Hemaglutinina (H) Interação com a célula hospedeira:

44. Influenza A Neuraminidase Ácido siálico Galactose Pneumococo Haemophilus S. aureus

46. Interação VRS-Pneumococo VRS Aderência aumentada em células epiteliais Aumento das taxas de bacteremias em modelo murino Aderência direta entre VRS e pneumococo

47. Influenza A: Novos desafios

48. Virus Influenza A Recombinantes

50. Gripe Suína

51. Obrigado! Contatos: vcantarelli@weinmann.com.br O conteúdo desta palestra será disponibilizada no site: www.publicacoesweinmann.com.br