1) O documento discute o diagnóstico molecular de vírus respiratórios, comparando diferentes métodos como cultura celular, testes rápidos, imunofluorescência e PCR. 2) É destacada a importância de detectar novos vírus como o metapneumovírus e bocavírus humano usando técnicas moleculares como PCR em tempo real. 3) A detecção frequente de coinfecções virais e a interação entre vírus e bactérias respiratórias são abordadas.

1. Diagnóstico molecular das viroses respiratórias Vlademir V. Cantarelli, PhD Weinmann Laboratório LTDA Centro Universitário Feevale 16/06/2009 - 17:30 - 18:30 sala Brochier

2. Infecções do TR Principais causas de morbidade e mortalidade no mundo Segunda causa principal de morte entre crianças menores de 5 anos (OMS) problema importante em saúde pública

3. Diagnóstico viral É uma virose!

4. Genoma viral: DNA ou RNA Doenças com gravidades variadas; Quadros brandos, sem importância clínica; Quadros graves, com desfecho fatal; Vírus diferentes: Diferentes sintomas clínicos: idade, imunidade... Mesmo sintoma clínico: causado por vírus diferentes Infecções Virais do TR

5. Vírus Respiratórios Influenza A e B Parainfluenza 1,2,3 Vírus Respiratório Sincicial Adenovírus Coronavírus Rinovírus Metapneumovírus Bocavírus...

6. Diagnóstico viral Rapidez Facilidade Precisão Sensibilidade Testes Rápidos Imunofluorescência Testes Moleculares $ $ $

7. Detecção de Vírus Respiratórios Cultura: Padrão ouro Resultados: 7 – 14 dias Requer experiência para reconhecer o efeito citopático de cada vírus Manter vários tipos de células em cultivo Custo RSV

8. Testes Rápidos Sensibilidade (FluA): < 5 anos: 84% 6 – 20 anos: 56% 21 – 50 anos: 43% > 50 anos: 33% Baixa sensibilidade, dependente da idade do paciente. Resultados negativos devem ser confirmados por outro método!

9. Efeito do tipo de amostra na detecção rápida de vírus respiratórios Amostra: NF - aspirado a ....... 100 % vs IFD NF - lavado b .......... 100 % vs IFD/cultura NF - swab a ............. 63% vs IFD a JCM 38:429-30; 2000 b JCM 29:479-82; 1989 Sensibilidade (Directigen Flu A)

10. Imunofluorescência Anticorpo marcado Antígeno viral Lâmina com a amostra Y Y Y Excitação Emissão

11. Imunofluorescência hMPV IFV Resultados rápidos (horas) Não disponível para alguns vírus respiratórios Para hMPV: Não recomendado (sensibilidade ~ 68%*) *Comparado com método molecular

12. Imunofluorescência para vírus respiratórios Adenovirus 58 50 – 53 Influenza A 83 80 – 89 Influenza B 83 83 – 90 Parainfluenza 1-3 95 72 – 76 RSV 99 90 – 93 IFD/Chemicon IFI/Bartels a V írus: Sensibilidade (%) a vs cultura – IF e Cultura

13. Cultura para detecção de VR *Especialmente importante para adenovirus N/D 49 – 58 Adenovirus* N/D 80 – 95 Parainfluenza 74 – 95 90 – 99 VRS 53 – 94 80 – 98 Influenza Testes rápidos Imunofluorescência Sensibilidade comparada com cultura celular (%)

14. Detecção de Vírus Respiratórios: Adenovírus hMPV Limitações dos testes: 1 2 3 1. Urina 2. LCR 3. Sangue

15. Diagnóstico Molecular - PCR

16. PCR Convencional Amplificação (PCR) 2 - 4 h Eletroforese 30 – 40 min Detecção (Brometo de etídio) Fotodocumentação Coleta Extração DNA/RNA (1 h)

17. RT-PCR Usando o RNA viral: Necessário fazer transcrição reversa 30 min; 45C Transcriptase reversa: RNA  cDNA PCR

18. PCR em Tempo Real Amplificação (PCR) 2 - 4 h Eletroforese 30 – 40 min Coleta Extração DNA/RNA (1 h) Amplificação e Detecção de amostras (40 min) PCR em Tempo Real

19. Infecção Respiratória: Detecção de Agentes Virais Clássicos PI1 PI3 PCR Tempo Real Multiplex RSV IA IB

20. Detecção de Rinovirus Genótipos distintos (>100)

21. Importância Clínica dos RNV 43 crianças internadas em UTI com doença respiratória viral: 21 (49%) positivas para RNV (PCR) Associado com: Baixa idade (média 1,4 anos) Pneumonia Requerimento de ventilação mecânica hospitalização prolongada Infecção por RNV pode ser mais severa e importante que se pensava... Pediatr Infec Dis J. 4:337-9, 2009

22. Freqüência dos VR detectados por PCR-TR Pilger 2009 – Tese de Doutorado 455 amostras respiratórias Crianças < 2 anos Hospital Santo Antonio Sinais clínicos de ITR inferior (maio 2007 – junho 2008) 2 (0,4) PIV 2 7 (1,6) PIV 1 9 (2,0) ADV 26 (5,8) PIV 3 30 (6,7) Flu B 94 (20,9) Flu A 222 (49,3) RSV Número (%) Vírus

23. PCR Tempo Real X IF Pilger 2009 – Tese de Doutorado (VRS, FluA & B, PIV 1,2,3, ADV) (+ hBov, hMPV, RNV) 455 (100) - - 37 (8,1) 321 (70,6) 97 (21,3) PCR-TR p/ 7 VR (%): 455 (100) 8 (1,8) 47 (10,3) 144 (31,6) 210 (46,2) 46 (10,1) PCR-TR p/ 10 VR (%): 455 (100) Total - 4 - 3 5 (1,1) 2 242 (53,2) 1 208 (45,7) 0 IF p/ 7 VR (%): Número de Vírus

24. n = 267 IRA PCR: 43% IFD: 19% Cultura: 14% =

26. Novos vírus respiratórios - Metapneumovirus humano - Bocavirus humano Coronavirus H1N1 (gripe suína)...

27. Infecção Respiratória: Novos vírus Metapneumovirus 2001

28. Bocavirus humano - hBoV Primeira descrição do virus: 2005 Instituto Karolinska, Estocolmo, Suécia Projeto de triagem para novos vírus respiratórios Parvovírus “ Bo vine” - “ Ca nine”

29. Detecção de Bocavirus humano (hBoV) em diversos países Austrália Japão Canadá França USA Alemanha Coréia do Sul Jordânia África do Sul Suíça China Tailândia Itália Relatos escassos sobre a detecção de hBoV no Brasil ou América latina

30. Detecção de Bocavirus humano Vírus não-cultivável: Necessidade de desenvolver método de diagnóstico rápido e confiável Métodos Moleculares: PCR PCR “Real-Time” TaqMan

31. Detecção de Bocavirus humano PCR convencional:

32. Infecção Respiratória: Novos vírus Bocavirus 2005

33. 321 amostras respiratórias 36 (14,5%) positivas para hBoV Clinical Virology Symposium Daytona Beach – FL - 2008

34. Freqüência de outros VR em amostras respiratórias Pilger 2009 – Tese de Doutorado 455 amostras respiratórias Crianças < 2 anos Hospital Santo Antonio Sinais clínicos de ITR inferior (maio 2007 – junho 2008) 60 (13,2) hBOV 66 (14,5) hMPV 112 (24,9) RNV Número (%) Vírus

35. Distribuição dos VR em amostras respiratórias Pilger 2009 – Tese de Doutorado 59,3 270 Total RSV+hBoV+RNV RSV+Pertussis hMPV FluA+RNV RSV+hMPV RSV+hBoV RNV RSV+RNV FluA RSV Vírus 4,0 18 4 1,3 6 10 1,5 7 9 2,2 10 8 2,9 13 7 3,1 14 6 3,3 15 5 5,5 25 3 8,8 40 2 26,8 122 1 % Freqüência

36. Coinfecção em viral amostras respiratórias 455 amostras: 409 positivas para 1 ou + VR (89,9%) 199 positivas para >1 VR Coinfecção em 43,7% das amostras Infecção dupla em 144 (31,6%) triplas em 47 (10,3%) quatro VR em 8 amostras (1,8%) Qual o significado clínico das coinfecções? Pilger 2009 – Tese de Doutorado

38. Infecções múltiplas - Hipótese Virus 1 Virus 3 Virus 2 Tempo PCR (a) [ ] viral Liberação de citocinas Ativação de Linf. Th1/Th2 Modulação da imunidade Modificação de receptores infecções secundárias? PCR (c) PCR (b)

39. Coinfecção em viral amostras respiratórias Pilger 2009 – Tese de Doutorado 59,3 270 Total RSV+hBoV+RNV RSV+Pertussis hMPV FluA+RNV RSV+hMPV RSV+hBoV RNV RSV+RNV FluA RSV Vírus 4,0 18 4 1,3 6 10 1,5 7 9 2,2 10 8 2,9 13 7 3,1 14 6 3,3 15 5 5,5 25 3 8,8 40 2 26,8 122 1 % Freqüência

40. Patógenos Respiratórios Bacterianos B.pertussis B.parapertussis B.bronchiseptica Mycoplasma pneumoniae Bordetella spp

41. Presença de Bordetella pertussis em amostras respiratórias de crianças n = 78 Cantarelli, et al., 2002 IFD ( sem clínica conhecida )

42. Bordetella pertussis (BP) e VRS Estudo em hospital da França PCR-TR para VRS e BP em todas as crianças com bronquiolite ou ITRI 90 RSV positivas 14 (16%) coinfectadas com B. pertussis 73% das crianças não vacinadas para BP Coinfecção VRS-BP é comum em crianças não-vacinadas para pertussis Pediatr Infect Dis J. 26:316-8, 2007 Eur J Pediatr. 167:1017-9, 2008

43. Influenza A Neuraminidase (N) Hemaglutinina (H) Interação com a célula hospedeira:

44. Influenza A Neuraminidase Ácido siálico Galactose Pneumococo Haemophilus S. aureus

45. Infecção bacteriana após infecção por vírus respiratórios Aderência aumentada (2-10X) de todos os sorotipos de pneumococos testados após infecção por VRS (Pediatr Res. 55:972-8, 2004) Vírus respiratórios aumentam a adesão de patógenos bacterianos às células do epitélio respiratório: dependente do tipo de vírus e tipo de célula (J Virol. 80:1629-36, 2006)

46. Interação VRS-Pneumococo VRS Aderência aumentada em células epiteliais Aumento das taxas de bacteremias em modelo murino Aderência direta entre VRS e pneumococo

47. Influenza A: Novos desafios

48. Virus Influenza A Recombinantes

49. Biologia Molecular Grande potencial para o diagnóstico das viroses respiratórias Especialmente em casos de testes rápidos e/ou IF negativos Detecção de novos agentes virais Bocavírus, Flu suína (H1N1)... Melhor entendimento das viroses respiratórias (coinfecções) PCR quantitativo?

50. Gripe Suína

51. Obrigado! Contatos: vcantarelli@weinmann.com.br O conteúdo desta palestra será disponibilizada no site: www.publicacoesweinmann.com.br