PCR Quantitativa - Lucas Secchim Ribeiro (PGMicro UFMG 2016-1)

Programa de Pós-Graduação em Microbiologia
Biologia Molecular de Micro-organismos (MIC842)
ICB/UFMG
PCR quantitativa
Teoria e Aplicações
Lucas Secchim Ribeiro
Laboratório de Interação Microrganismo-Hospedeiro

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2016 © Lucas Secchim Ribeiro

SumárioSumário
• PCR
 Histórico
 Teoria
 Aplicações
• Desenho de primers
• qPCR
 Metodologias
 Cálculos
 Aplicações
 PCR Digital


DogmaDogma central da Biologia Molecularcentral da Biologia Molecular
Dogma central da Biologia Molecular
• Francis Crick / 1956


PCRPCR


PCRPCR
PCRPCR


PCRPCR
PCR - Polymerase Chain Reaction
Pipetar
Chorar
Repetir


PCRPCR
Funções da PCR
• Distinguir uma sequência-alvo específica de uma
grande quantidade de background;
• Amplificação de cópias de uma sequência
específica a partir de pequenas quantidades do
DNA modelo.


PCRPCR convencionalconvencional
Aplicações da PCR “convencional”
• Diagnóstico
• Avaliação de mutações
• Detecção de patógenos (bactérias, fungos, vírus, protozoários)
• Tipagem para transplantes - MHC
• Testes forenses
• Paternidade
• Investigações criminais
• Sequenciamento e clonagem
• Epidemiologia molecular e bioinformática
• Análise de OGM
• ...


PCR “convencional”
Reagentes básicos
PCRPCR
Iniciadores
senso/antissenso
(primers forward/reverse)
Cátions
(Na+
/K+
e Mg2+
)
DNA polimerase
com DNA modelo
Deoxinucleotídeos
(dATP, dCTP, dGTP, dTTP)


Importância do tampão e íon potássio na PCR
• pH 8,3  pH 7,2 a 72º C
• Tris/ Tris-Cl
• Função enzimática da DNA polimerase
• K+
• Reduz a repulsão entre DNA/DNA e DNA/primer
através da neutralização de cargas negativas.
↑ [K+
] para fragmentos pequenos
↓ [K+
] para fragmentos grandes


Importância dos dNTPs e íon magnésio na PCR
• Deoxinucleotídeos trifosfato (dNTPs)
• Associados ao DNA na forma de dNMPs
• Sequestradores de Mg2+
• Mg2+
• Cofator da DNA polimerase
• Especificidade e eficiência da enzima
• Estabiliza ligação de dNTP/dNMP e primers à fita
de DNA (↑ Tm)
• Rendimento x Concentração crítica e empírica
↑ [Mg2+
]  ↑eficiência ↓especificidade


Função e relevância dos primers
• Polinucleotídeos sintéticos de fita simples, de
sequência complementar e flanqueadora à fita
molde, com a extremidade 3´-OH livre


DNA polimerase termorresistente
• Antigamente: adição de enzima a cada novo ciclo
• Taq DNA Polimerase
• Dependente de cátions bivalentes (Mg2+
> Mn2+
>>>Ca2+
)
• Inibição por agentes quelantes (EDTA, citrato)
Thermus aquaticusParque Nacional de Yellowstone / EUA


DNA molde
• Qualidade
• Cuidado com resíduos de processos de extração
• SDS (dodecil sulfato de sódio)
• Fenol
• Corantes (subprodutos de PCR)
• Heparina/EDTA/Citrato
• Polissacarídeos vegetais/carragenina
• Poliestireno/polipropileno expostos à radiação UV
• Quantidade
• Excesso de DNA é prejudicial
• Aumento de reação inespecífica


Parâmetros de termociclagem
• Temperatura de anelamento
↑ Tanelamento  ↑estringência
↓produtos inespecíficos
↓ Tanelamento  ↑rendimento
↑ produtos inespecíficos
• Tempo de extensão
• DNA Polimerase: 35 – 100 nt por segundo a 72º C
• Ideal: entre 30 segundos e 1 minuto
• Excesso  Atividade de exonuclase 5´-3´


Aditivos
• Separação de fitas com alto conteúdo G:C
• Estruturas secundárias fortes
• Betaína (1 M)
• DMSO (1-10%)
• Formamida (1-10%)
• Agentes estabilizantes da DNA polimerase
• Redução da adesão de reagentes ao tubo
• BSA (0,1 mg/mL)
• Gelatina (0,1 – 1,0%)
• Detergentes não-iônicos (<0,5%)


Inibidores
• Derivados das próprias amostras ou do método
de extração/purificação do ácido nucléico;
• Fenol/álcoois
• EDTA
• Debris celular
• Detergentes


Fonte: Koch WH, 2004. Nature Reviews Drug Discovery 3, 749-761 (Sep 2004)


Visualização dos resultados
• Separação por peso molecular: eletroforese
• Corantes/marcação fluorescente


Visualização dos resultados
• Sequenciamento capilar
• Dideoxinucleotídeos


Antes da PCR...
• Clonagem!


Antes dos termocicladores...
• Banho-maria!


Desenho deDesenho de primersprimers
Desenho deDesenho de
primersprimers


Características de bons primers
• Tamanho adequado
• 15 a 25 pares de bases
• Tamanho x Temperatura de dissociação
• Temperatura adequada de dissociação (Tm)
• Conteúdo G:C
• Diferença entre primers < 5º C
• Concentração de cátions em solução


• Tamanho do fragmento a ser gerado
• Tempo de extensão da polimerase
• Especificidade
 Primers específicos x degenerados


Características de maus primers
• Inter-complementariedade
• Formação de dímeros (primer dimer)
• Atenção à extremidade 3´


Características de maus primers
• Auto-complementariedade
• Formação de auto-dímeros e hairpins
• ΔG (energia livre) > -9,0 kcal/mol


• Adequação para qPCR
• Tamanho do amplicon
• Junção exon-exon e contaminação com gDNA


Ferramentas online de suporte
• Primer-BLAST
www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast/
• Primer3
bioinfo.ut.ee/primer3-0.4.0/primer3
• IDT Oligo Analyzer 3.1
www.idtdna.com/calc/analyzer
• UCSC PCR in silico
genome.ucsc.edu/cgi-bin/hgPcr?command=start
• RT Primer DB (específico para qPCR)
• medgen.ugent.be/rtprimerdb

Problema
detectado
Workflow para desenho de primers
Verificar
• Temp. de anelamento
• Temp. de dissociação
• Estruturas secundárias
• Complementaridade
• EspecificidadeNãoSim
PCR para
confirmação de
funcionamento
PCR para
confirmação de
funcionamento
GenBank/NCBI
Encontrar sequência da
região desejada
Encontrar sequência da
região desejada
PrimerBLAST
Primer3, etc
Desenhar primersDesenhar primers
Registrar e arquivar
resultados obtidos
Registrar e arquivar
resultados obtidos
Reação
adequada
OK?OK?
CHECAR PRIMERS!CHECAR PRIMERS!


PCRPCR quantitativaquantitativa
PCRPCR
quantitativaquantitativa


PCR quantitativa
• Nomenclatura
• qRT-PCR
• qPCR
• Real-time PCR
• Análise de End-point


Ensaios químicos disponíveis
• SYBR Green I
• Ensaio para 5´-nuclease (TaqMan)
• Molecular Beacons
• LightCycler
• LUX
Detecção de
fluorescência!
↑ sensibilidade


SYBR Green I
• Corante específico para DNA de fita dupla
• Flourescência aumenta ao longo da reação
• Não tem ação inibitória
• Detecta produtos inespecíficos
SYBR Green I
Brometo de etídio

Ensaio para 5´-nuclase – Sondas TaqMan
• Atividade 5´-nucleásica da Taq DNA Polimerase
• Altamente específica, sem produtos espúrios
• Duas marcações simultâneas são possíveis
• Tecnologia baseada em FRET
• Flourescence Resonance Energy Transfer


FRET - Transferência de energia por ressonância
fluorescente
• Fenômeno quântico entre duas moléculas muito
próximas (10 – 100 Å), com bloqueio da emissão
de luz
• Fluoróforo x Quencher (bloqueador)
• Sobreposição do λ de absorção e emissão


PCRPCR quantitativaquantitativaPCRPCR quantitativaquantitativa


• Discriminação alélica


Conceitos importantes
• Fases exponencial, logarítmica e plateau
• Threshold
• Baseline
• Cycle threshold (CT)
Ciclos
Flourescência
(ouprodutosdePCR)
Plateau
Linear
Exponencial
Threshold


Ciclos
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
Amostra A 3 6 12 24 48 96 192 384 768 1536 3072
Amostra B 15 30 60 120 240 480 960 1920 3840 7680 15360
↑ CT ↓ Qtde. inicial↑ CT ↓ Qtde. inicial
~7,05 ~9,38
Quantidade
inicial
CT
Amostra A 3 9,38
Amostra B 15 7,05


• Quantidade inicial de amostra
• Relação CT x Quantidade inicial


• Eficiência
2n
= cópias em n ciclos Eficiência teórica= 100%


• Eficiência
Qtde.
inicial de
DNA
1 10 100 1000 10000 100000 1000000 10000000 100000000
CT 40 35 30 25 20 15 10 5 1


Log 10
da qtde.
inicial
0 1 2 3 4 5 6 7 8
CT 40 35 30 25 20 15 10 5 1
• Eficiência


E = 10(-1/slope)
-1
• Eficiência
Eficiência 100% = 2n
a cada ciclo = log 2 x
Para um aumento de 10x = log 2 10 = 3,32
Slope
(inclinação)


• Curva-padrão e blank sample
• Gene de referência/constitutivo/normalizador
• Gene de interesse
Controle Infectado
GAPDH IFN-γ Relação GAPDH IFN-γ Relação
Amostra 1 20 20 1 5 40 8,0
Amostra 2 30 40 1,33 5 20 4,0
Amostra 3 60 80 1,33 10 50 5,0
Amostra 4 50 60 1,2 15 80 5,33
Amostra 5 40 50 1,25 10 60 6,0
Média + EPM 1,22 + 0,06 Média + EPM 5,66 + 0,67


• Curva de dissociação (Curva de melting)
• Indica a temperatura em que 50% dos primers
estão anelados;
• Ligação específica do corante à fita dupla


• Diretamente relacionada ao conteúdo G:C
• Pode apontar amplificação inespecífica e dímeros de
primers


• Importante para distinção de amplicons/primers
em protocolos multiplex


Fatores que afetam a eficiência da qPCR
• DNA degradado
• Produtos inespecíficos
• Condições de termociclagem
• Prática laboratorial inadequada
• Reagentes contaminados
• Primers mal desenhados
• Diluições mal feitas
• Falta de calibração e manutenção
• Pipetagem errada!


Funções da PCR quantitativa
• Quantificação absoluta
• Curvas-padrão
• Quantidade conhecida de “cópias por volume”
• Semelhante a um ELISA
• Exemplos: carga viral, 16S bacteriano
• Avaliação relativa
• Ausência de curva-padrão
• Gene de referência para normalização
• Apresentada em aumento/redução em relação a um
controle experimental
• Exemplo: expressão gênica


CÁLCULOS E
ANÁLISES
CÁLCULOS E
ANÁLISES
Verificar dispersão entre replicatas
biológicas e técnicas
Verificar dispersão entre replicatas
biológicas e técnicas
Checar controles positivos
(curva-padrão) e negativos (blank)
Checar controles positivos
(curva-padrão) e negativos (blank)
Conferir curvas de dissociação (Tm)Conferir curvas de dissociação (Tm)
Verificar ajuste do thresholdVerificar ajuste do threshold
Análise de resultados
Avaliar as curvas de amplificaçãoAvaliar as curvas de amplificação


Cálculos em qPCR – Quantificação absoluta
• Regressão linear simples
• Método PfafflMétodo Pfaffl  Curva de cópias (plasmídeos)Curva de cópias (plasmídeos)


Cálculos em qPCR – Quantificação relativa
• Relação matemática entre a expressão dos genes
de referência e os de interesse;
• Amostras controle (não tratadas) e estimuladas
• Método LivakMétodo Livak  22--ΔΔΔΔCTCT


Cálculos em qPCR – Quantificação relativa
• Avaliada a conformidade de todos os outros
parâmetros, a única informação útil será o CT
• Exemplo:
Controle Infectado
GAPDH IFN-γ GAPDH IFN-γ
Amostra 1 15,1 32,5 14,9 29,4
Amostra 2 15,4 33,1 15,5 29,1
Amostra 3 16,0 32,8 15,1 28,8
Amostra 4 18,1 31,5 15,8 29,9
Amostra 5 15,7 32,0 15,5 28,9


GAPDH IFN-γ
Amostra 1 15,1 32,5 17,4 1,08 0,47
Amostra 2 15,4 33,1 17,7 1,38 0,38
Amostra 3 16 32,8 16,8 0,48 0,72
Amostra 4 18,1 31,5 13,4 -2,92 7,57
Amostra 5 15,7 32 16,3 -0,02 1,01
GAPDH IFN-γ
Amostra 1 14,9 29,4 14,5 - -1,82 3,53
Amostra 2 15,5 29,1 13,6 - -2,72 6,59
Amostra 3 15,1 28,8 13,7 - -2,62 6,15
Amostra 4 15,8 29,9 14,1 - -2,22 4,66
Amostra 5 15,5 28,9 13,4 - -2,92 7,57
Controle
Infectado
ΔCT ΔΔCT 2
-ΔΔCT
ΔCT
Média ΔCT
16,32
Média ΔCT ΔΔCT 2
-ΔΔCT
0


DicasDicas
Extração e manuseio de ácidos nucléicos
• RNA = extremamente lábil!
• Extração e armazenamento correto
• Dosagem e normalização das amostras
• A260/280 e A260/230 > 1,8
• Contaminação com DNA genômico
Confecção de cDNA
• Normalizar a mesma quantidade (p.e. 1 µg) de
RNA para todas as amostras;
• Todo o procedimento deve ser realizado no gelo;
• Evitar ciclos de congelamento/descongelamento.


Escolha do gene de referência
• É necessário ter opções!
• Ex.: 18S, GAPDH, RPL4, HPRT para camundongo
• Diferentes estímulos/tecidos/tratamentos podem
ter a expressão do gene constitutivo alterada;
•Preparar um pool com amostras-controle
• 6 diluições em triplicata
• Diferença entre o CT mínimo e máximo < 1,0
•Algoritmos gratuitos na internet!
• Ref Finder: Cotton EST Database
• NormFinder: macro para Excel
DicasDicas


Antes da qPCR...
• Northern Blotting (RNA)
• Southern Blotting (DNA)


PCRPCR
digitaldigital
PCRPCR digitaldigital


PCR digital (dPCR)
Baseada na compartimentalização da amostra
• Gotículas (droplets) em emulsão = microfluidos
• Chips com nanopoços
Individualização das moléculas!
Distribuição de Poisson
Aplicações
• Quantificação absoluta sem curva-padrão
• Expressão gênica
• Detecção de alelos raros e/ou mutações
• Discriminação de baixas diferenças para CNV

Sample DNA
Target


Fonte: Baker M, 2012. Nature Methods 9, 541 (Jun 2012)


http://www.gene-quantification.de/
DicasDicas


DicasDicas


PCRPCR
O que é importante saber?
• Teoria e suas diferenças entre as técnicas
• Vantagens e desvantagens de cada uma
• Como aplicar a PCR ao seu projeto
• Aplicações gerais e específicas
• Boas práticas laboratoriais


Lucas Secchim Ribeiro
Dpto. Microbiologia
Laboratório de Interação Microrganismo-Hospedeiro
Sala C4 191 – Ramal 2735
secchimribeiro@gmail.com
Aula disponível pelo endereço
http://bit.do/qPCR-UFMG2016


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Notas do Editor