O documento aborda a infecção por Chlamydia trachomatis, sua alta prevalência entre jovens e mulheres, e os desafios no diagnóstico laboratorial. Salienta a gravidade das consequências da infecção, incluindo infertilidade e complicações graves na gravidez, além de discutir a eficácia de diferentes métodos de teste e a importância da triagem. Enfatiza a necessidade de estratégias de saúde pública para prevenir a infecção e suas sequelas.

1. Chlamydia trachomatis O DESAFIO DO DIAGNÓSTICO LABORATORIAL Claudete Farina Seadi

2. DST mais freqüente dentre as causadas por bactérias Infecções assintomáticas: 50% dos homens 70 % das mulheres Maior impacto da infecção em mulheres Introdu çã o

3. Mulheres : corrimento, disúria, aumento da freqüência urinária, dor pélvica, sangramento após relações sexuais impacto no sistema reprodutivo feminino : 25% infecções não tratadas causam DIP 20% casos das DIP causam infertilidade 18% dor pélvica persistente 9% gravidez ectópica facilitadora da carcinogênese cervical na gravidez: parto prematuro, baixo peso, morte neonatal Introdu çã o *MMWR 2002, 51(RR15)

4. RN : afetados em ~65 % quando a mãe é positiva (conjuntivite ~40% e pneumonia ~25%) Homens: 1% das uretrites não tratadas causam síndrome de Reiter (uretrite, conjuntivite, artrite recorrente). Tracoma 150 milhões de pessoas / 6 milhões cegas (OMS) http://portal.saude.gov.br/portal/saude/profissional/visualizar_texto. Introdu çã o

5. Características da C.trachomatis Bactéria gram negativa, imóvel e incapaz de sintetizar ATP Vida intracelular obrigatória Antigenicamente complexa: LPS - lipopolissacarídeo (antígeno comum ao gênero) MOMP - proteína principal da membrana externa (antígeno específico para espécies) Formas intracelulares (corpúsculos de inclusão): EB : Corpúsculos elementares RB : Corpúsculos reticulares

7. Características da C.trachomatis Sorovariedades / comportamento sorológico complexo B, B-relacionado, C (A, C, G, H, I, J), C-relacionado (K) Sorovariedades ou sorotipos/ apresentações clínicas A, B, Ba C estão associados ao tracoma endêmico L1, L2, L3 ao LGV D,E,F,G,H,I,J,K relacionados à infecções genitais e RN

8. * 50 milhões de novos casos de infecção/ano EUA:3 milhões casos/custo anual de > 2 bilhões de dólares ** 2 a 7% estudantes 4 a 12% clínicas de planejamento familiar 6 a 20% clínicas de DST Epidemiologia *OMS , 2005 **NEJM, vol. 349:2424-2430,2003

9. Epidemiologia Brasil: estudos isolados 1- 3.303 gestantes (23,8 anos ± 6,9): 9,4 %. 2-Jovens mulheres: rede básica de Goiânia(2001) ~ 19% Jovens assintomáticos: recrutas de Goiânia(2003) ~ 5% Rev. Bras. Ginecol. Obstet. vol.30 no.12 Rio de Janeiro, 2008 Rev.Bras.Reumatol.vol.54/n5 São Paulo.2005

10. Epidemiologia 3-Tracoma / dados preliminares (2003): 81.306 escolares / 4.236 casos positivos Prevalências: alguns municípios acima de 20% prevalência nacional de ~ 5% http://portal.saude.gov.br/portal/saude/profissional/visualizar_texto

11. Epidemiologia Weinmann Laboratório Levantamento de dados de out / 2007 a out. /2008: Biologia Molecular Total (n): 4128 Negativos: 3942 (95,4%) Positivos: 186 (4,6%)

12. Epidemiologia Sorologia IgM: n 13181 não reagentes : 13114 (99,5%) reagentes : 67 (0,5%) IgG: n 18924 não reagentes : 10073 (53,3%) reagentes : 8851 (46,7%) IgA: n 1399 não reagentes : 1096 (78,4%) reagentes : 303 (21,6%)

13. Epidemiologia Prevalência depende: dos testes de triagem utilizados da população estudada ** VPP depende da prevalência ** Especificidade: 99% Sensibilidade: 85% Prevalência: 10% Prevalência: 2% VPP = 90,4 % VPP= 63,4 % **MMWR 2002, 51(RR15)

14. NEJM, vol. 349:2424-2430,2003 Estudos & Evidências Fatores de risco para mulheres: idade < 25 anos ( anatomia peculiar da cérvix ) mais de 1 parceiro sexual envolvimento recente com 1 novo parceiro outras DST Prevenção diminui seqüelas reprodutivas e DIP Epidemiologia

15. &quot; Conhecimentos, Atitudes e Práticas na População Brasileira “ jovens de 15 - 24 anos declararam: sexualmente ativos - 70% iniciação sexual com menos de 15 anos - 36% mais de 10 parcerias sexuais - 16% mais de 5 parcerias sexuais no último ano- 7% PN-DST/Aids, 2004 Magnitude do problema

16. Magnitude do problema 12% de mulheres entre 15-54 anos: nunca fizeram exame ginecológico 4% dos homens com corrimento uretral: não trataram uso de preservativos: maior adesão entre os homens mas:  a regularidade de uso - parceira fixa Conclusão: vulnerabilidade da população às DST PN-DST/Aids, 2004

17. Magnitude do problema Indicadores comportamentais de jovens Quanto à utilização de preservativos: 73% não utilizou na última relação sexual 51% não utiliza com qualquer tipo de parceiro 51% relata mais de 10 parceiros sexuais http://www.aids.gov.br/main.asp

18. Magnitude do problema Indicadores comportamentais de jovens 35% se declarou usuário de drogas injetáveis Quanto a problemas relacionados às DST: 34 % procurou o serviço de saúde 31% não procurou ajuda 8,5% um amigo 4,5% balconista de farmácia http://www.aids.gov.br/main.asp

19. Magnitude do problema Como explicar seqüelas em pessoas nunca tratadas e assintomáticas? Tratar pessoas positivas ? Ou tratar todos preventivamente? Tratar parceiro se contato precedeu o diagnóstico em até 60 dias. Medidas terapêuticas freqüentemente não são aplicadas. Human Reproduction , Vol. 17, No. 6, 1431-1432, 2002

20. Magnitude do problema Infecção primária assintomática ou com sintomas leves : não tratada, não detectada, não reportada. Questões não resolvidas : persistência da clamídia reativação demonstrada experimentalmente. Human Reproduction , Vol. 17, No. 6, 1431-1432, 2002

21. Quando realizar testes de triagem ? Considerar a prevalência da infecção Em pessoas assintomáticas -teste de alta sensibilidade minimizam riscos de seqüelas e traumas da infecção por resultados FN -possibilidade de FP /conseqüências psico-sociais e/ou legais

22. Quando realizar testes de triagem? Custo X benefício: Mulheres(< 25 anos) em pop./prevalência moderada, baixa  Prevalência 24% / triagem a cada 6 meses Gestantes em população de baixa prevalência?* População assintomática (exceto grupos de alto risco) Teste de cura NEJM, vol. 349:2424-2430,2003 *Ann.Intern.Med 2007:147:128

23. Idade inferior ou igual à 25 anos, sexualmente ativas Acima de 25 anos, sexualmente ativas / fatores de risco* Vítimas de abuso sexual Reteste 3 a 4 meses após tratamento (reinfecções) *fatores de risco: irregularidade no uso preservativos troca de parceiro nos últimos 90 dias CDC & Testes de Triagem MMWR 2006, 55(RR1)

24. O que se espera de um teste de triagem? Alta sensibilidade (baixo risco de falsos negativos) Especificidade (isento de falsos positivos) Reprodutibilidade de resultados Simples na realização Facilidade na coleta Estável em relação à armazenagem e transporte Custo / benefício favorável* *Obstet Gynecol 1998, 92:292-8

25. Principais métodos diagnóstico TÉCNICAS DISPONÍVEIS TIPO Cultivo Celular Direto ____________________________________________________________ Pesquisa Ag Imunofluorescência direta ( IFD ) Direto Pesquisa Ag /Ac Enzimaimunoensaio ( EIE ) Direto/Indireto Pesquisa Ac Imunofluorescência indireta ( WIF,MIF ) Indireto _________________________________________________________ Biologia Hibridização com sondas de DNA Direto Molecular Amplificação de DNA / RNA -NAAT* Direto ( PCR , LCR, SDA, TMA) *( nucleic acids amplification tests )

26. Sensibilidade dos métodos de detecção direta Número de EB log ( Clin Microbiol Rev 199, 10:160-184)

27. Cultura Celular Método “ gold standard ” 48 - 72 horas de crescimento bacteriano Visualização microscópica de inclusões citoplasmáticas por IFD VANTAGENS: Preservação do microrganismo (antibiograma e genotipagem) Alta especificidade DESVANTAGENS: Infra-estrutura de laboratório - custo Exige cuidados para manter viabilidade da amostra * J. Clin Microbiol 2001, 8: 2928-2932

28. PCR A adoção de um método de detecção por BM envolve Verificação da presença de inibidores na reação (FN) Manutenção de controle de qualidade Verificação da possibilidade de contaminação cruzada (FP) VANTAGEM: Permite processar grande número de amostras Diversos materiais biológicos DESVANTAGEM: Custo

29. PCR Tipos de materiais para análise Swab uretral e endocervical Urina - seguir orientação do fabricante para coleta e volume: -Menor sensibilidade dos testes em urina de assintomáticos. Não realizar análises em materiais biológicos para os quais o teste não foi aprovado.

30. PCR Sensibilidade: ~ 97.1% - FN devido à inibição da amostra: detectados pelo CI - possível labilidade de inibidores (reteste) Especificidade: ~ 98,1% - FP raros (> faixa equívocos)* - descontaminação pela a adição de UNG *MMWR 2002, 51(RR15)

31. Imunofluorescência direta Microscopia de IFD: Ag são visualizados mediante Ac monoclonais unidos à marcadores fluorescentes. Vantagens: avaliação da qualidade e adequação da amostra. Desvantagens: experiência do microscopista. inadequado para processar grande número de amostras Anticorpo monoclonal (LPS) Célula infectada Anticorpo monoclonal (MOMP)

32. Pesquisa de anticorpos O novo papel da sorologia da Chlamydia trachomatis ? Estudos: muitos em populações de clínicas: viés poucos em homens incidência: são poucos e mal relacionados Qual a verdadeira incidência na população? Sexually Transmitted Infections 2008;84:79-80

33. Pesquisa de anticorpos Não substitui detecção direta Recomendada em: -estudos epidemiológicos -infecções sistêmicas: pneumonia em RN, LGV, DIP Ac. IgG título maior ou igual a 1:256, se realizado por IFI Ac. IgM importante no diagnóstico: LGV e pneumonia RN Ac. IgA associado à artrite reativa Não recomendada: -diagnóstico de infecções urogenitais - alguns indivíduos não produzem Ac em infecções urogenitais Black,97(Clin Microbiol Review)

34. Pesquisa de anticorpos Considerações : -uma única amostra reagente indica infecção pregressa -duas amostras em intervalos de pelo menos 15 dias e aumento de título de 4 vezes para caracterizar infecção aguda -altos percentuais de reações cruzadas: outras clamídias

35. Pesquisa de anticorpos Estudo: R elação Ac./ dano tubário / laparoscopia ou HSG * - na investigação de infertilidade: mais provável Ac + do que Ag + - a C. trachomatis (Ct) é responsável por 50% das DIP agudas - significativo aumento de dano tubário em mulheres com tit >1:128 Pacientes com tit. >1:128 - indicada a laparoscopia *Thomas, 2000 (HumanReproduction)

36. Imunofluorescência indireta MIF (microimunofluorescência) gold standard WIF (whole cell inclusion immunofluorescence) c el. McCoy infectadas L2 Mesmo princípio técnico: diferem nos antígenos facilidade de visualização preço Black, 97 (Clin.microbiol.Review)

39. Controle de Qualidade - titulação do conjugado (ajustar a quantidade fluorocromo à potência da lâmpada) - concentração do conjugado permite equiparar sistemas ópticos diferentes - soro de refêrencia que acompanha o Kit - adequação do titulo do conjugado: uso de controles de reatividade mínima - padronização sistemática da leitura Imunofluorescência indireta

40. Imunofluorescência indireta Antígenos MIF : - subespécies da Ct agrupadas ( pools ) por afinidades - recombinantes ( DOT ): teste simultâneo para as 3 espécies Estudo comparativo MIF X Imunoblot X EIE * : - 45 pacientes com infecção urogenital e PCR POS - 31doadores de sangue - Especificidade 89% e Sensibilidade 44% - 73% dos doadores de sangue Ac IgG anti- Cp - Imunoblot ou ELISA (com apropriado Ag): mais úteis WIF Ag espécie específico * Bas 98 (J.Clin.Microbiol)

41. VANTAGENS : -Tempo de execução, custo, reprodutibilidade, precisão, n o . de amostras Antígenos: LPS ( gênero) peptideos derivados do MOMP (espécie-especifico) pgp3 (peptideo recombinante, especie especifico) peptídios sintéticos hsp60 hsp70 OMP2 Enzimaimunoensaio

42. Estudo comparativo de 15 EIEs os 2 melhores resultados: IgG e/ou IgA EIE Ag pgp3 sens. 59% especif. 90% IgG e/ou IgA EIE Ag pep-MOMP e pgp3 sens. 76% especif. 85 % Rheumatology 2002;41:1017-1020 Enzimaimunoensaio

43. Enzimaimunoensaio

44. Enzimaimunoensaio

45. Estudo hsp60 (heat shock protein) * 1- Ac anti-hsp60 associada a risco 2 a 3x maior de desenvolver DIP ** 2- Ac anti- Ct úteis na investigação de dano tubário em mulheres - inférteis dano tubário foi associado a altos níveis de Ac anti-hsp60 - alta sensibilidade se contrapõem a baixa especificidade obtida com Ag hsp60 * J.Infect. Dis. 175 (5):1153-1158,1997. **Tiitinen, 2006 (Human Reproduction ) Enzimaimunoensaio

46. Enzimaimunoensaio Estudo comparação: MIF (tit. > 1:16) X EIE Ag peptídicos Grupo de 149 mulheres (20 a 30 anos) / PCR: 43 positivos Soroprevalência média IgG 39% / IgA 6 % Soroprevalência 2 a 3 vezes maior: IgG reagente / PCR positivo = 72% das amostras IgG não reagente / PCR negativo= 28% das amostras EIE tem desempenho comparável ao MIF J Clin Microbiol. 2002 February; 40(2): 584–587

47. Enzimaimunoensaio EIE Ct - antígeno Pgp3 X 3 EIE comerciais MOMP 356 indivíduos com teste direto POS no mês precedente 722 crianças (2 a 13 anos) Sensibilidade 57.9% EIE/ Pgp3 foi significativamente maior (14% acima dos demais EIE) Maior sensib. para amostras femininas que maculinas 73.8 X 44.2% Especificidade de 96% a 99% diferença não significativa não evidenciadas reações cruzadas com Ac Cp Clinical and Vaccine Immunology, June 2009, p. 835-843, Vol. 16, No. 6

48. Conclusões Considerar: Limitações dos métodos (sensib. x especif.) Investimento do laboratório em controle de qualidade O alto custo psico-social e financeiro no tratamento das seqüelas pela infecção por Ct determinam a necessidade de adoção de medidas de saúde pública com a finalidade de prevenção. Investimento em diagnóstico precoce é uma contribuição do laboratório no auxílio do tratamento adequado das infecções por Ct .

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