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IMUNO-HEMATOLOGIA BÁSICA
Thiago Vianna de Carvalho, MSc.
2019
Timeline da hemoterapia
Mundo
antigo
1000 AC
1665
Idade
Média
1628 1667
1678/79
Proibição da
prática
transfusional
na Europa
1818
1867
1901
1912Sec. III
Taurobolium
Papa Inocêncio
VIII
W. Harvey J. B. Denis K. Landsteiner
R. OttenbergR. Lower J. Lister
J. Blundell
Hiato
1945
R. Coombs
Imuno-hematologia
Imuno-hematologia é um ramo da hemoterapia que
estuda os antígenos presentes nos eritrócitos e seus
anticorpos correspondentes, assim como fenômenos
análogos relacionados com a patogênese e com as
manifestações clínicas provocadas por problemas do
sangue
Imuno-hematologia
As máximas da imuno-hematologia
1°- tudo se resume a interação antígeno x anticorpo
2°- se o alvo da pesquisa é o antígeno, usamos anticorpos
conhecidos e vice-versa
3°- se o teste diz que é “direto”, a pesquisa é na hemácia e se
o teste é “indireto” ou “reverso”, a pesquisa é no plasma/soro
Introdução
O que são antígenos eritrocitários?
São marcadores de superfície que possuem função definida
e podem deflagrar a resposta imune
Introdução
O que são anticorpos?
São proteínas cuja reação se dá somente com o antígeno contra o qual
foi produzido
Sistema ABO e algumas peculiaridades
Sistema ABO
Grupo A Grupo B Grupo AB Grupo O
Tipo das
hemácias
Anticorpos
presentes
Nenhum
Antígenos
presentes
Nenhum
Anti-B Anti-A
Sistema ABO
ITENS ANTÍGENOS ANTICORPOS
PRODUÇÃO Desde a 5ª semana de vida IU
À partir do 4º mês após o
nascimento
APRESENTAÇÃO Em RN, 1/3 dos sítios de A e B
IU: somente anticorpos maternos
Neonato: anticorpos maternos e
início da produção no 4º mês
EXPRESSÃO MÁXIMA 2-4 anos de vida N/A
OUTRAS
CONSIDERAÇÕES
Antígenos de histocompatibilidade
PAI: Atenção aos anticorpos
MATERNOS
Sistema ABO
• Considerações gerais
ABO
Glicosil
transferases
N-acetilgalactosaminil
transferase
Galactosiltransferase
Sem produção de
transferase
Cromossomo 9
Gene B
Gene H Substância H
Sistema ABO
• Considerações gerais
ABO
Glicosil
transferases
N-acetilgalactosaminil
transferase
Galactosiltransferase
Sem produção de
transferase
Cromossomo 9
Gene B
Gene H Substância HSubstância H
Sistema ABO
• Considerações gerais
ABO
Glicosil
transferases
N-acetilgalactosaminil
transferase
Galactosiltransferase
Sem produção de
transferase
Cromossomo 9
Gene B
Gene H Substância HSubstância H
Substância H
Sistema ABO
• Considerações gerais
ABO
Glicosil
transferases
N-acetilgalactosaminil
transferase
Galactosiltransferase
Sem produção de
transferase
Cromossomo 9
Gene B
Gene H Substância HSubstância H
Substância H
Substância H
Sistema ABO
• Considerações gerais
ABO
Glicosil
transferases
N-acetilgalactosaminil
transferase
Galactosiltransferase
Sem produção de
transferase
Cromossomo 9
Grupo A
GalNac + H
Grupo B
Gal + H
Gene B
Grupo O
Substância H
Gene H Substância H
Substância H
Substância H
Substância H
Sistema ABO
• Considerações gerais
ABO
Glicosil
transferases
N-acetilgalactosaminil
transferase
Galactosiltransferase
Sem produção de
transferase
Cromossomo 9
Grupo A
GalNac + H
Grupo B
Gal + H
Gene B
Grupo O
Substância H
Gene H Substância H
Substância H
Substância H
Substância H
Sistema ABO
• Técnica de classificação ABO geral
• Prova direta – consiste em por as hemácias a serem testadas frente a
antissoros comercias
• Prova reversa – consiste em por o plasma a ser testado frente a hemácias
comercias
Sistema ABO
Adaptado de Imuno-hematologia laboratorial, MS, Brasil - 2014
Sistema ABO – Subgrupo
• Os polimorfismos do sistema ABO são causados por mutações nas sequências
de nucleotídeos no DNA. O gene A1 é considerado o gene selvagem
• Subgrupos diferem pela quantidade antígenos nas hemácias
• Os subgrupos de A (A1, A2, A3, Ax, Aend, Am) e B (B3, Bx,Bm) resultam de
polimorfismos na estrutura do gene produtor da glicosiltransferase
• A1: 80% indivíduo
• A2: 19,9 %
• A3, Ax, Aend, Am,...: 0,1%
• Grupo A e subgrupos de A –acetilgalactosamina
• Grupo B e subgrupos de B – galactose
Sistema ABO – Subgrupo
• Sorologia:
• Fraca expressão antigênica na fenotipagem c/ reagentes anti-A, anti-B ou anti-
AB – reagentes policlonais principalmente
• Possibilidade de discrepância entre tipagem direta e reversa
• Lectinas servem como ferramenta para elucidação de subgrupos. As mais
comuns são as lectinas para os antígenos A1 e H
Sistema ABO – Subgrupo
• As lectinas são proteínas, de origem não-imunológica, com propriedades de se
ligar de forma reversível a carboidratos
• São produzidas à partir de extratos herbários
Lec. Anti-A1: Dolichos biflorus
Lec. Anti-H: Ulex europaeus
Já existem anticorpos monoclonais no mercado
Anti-H Mono-type Grifols – clone 10934C11
Reatividade de A1 e A2 com Lectinas
Por que a Lectina anti-A1 (Dolichos biflorus) identifica somente o antígeno A1 e não
o A2 se o açúcar imunodominante é o mesmo?
Reativos
Hemácias Teste
A1 A1B A2 A2B
Anti-A1 (Dolichos biflorus) 4+ 4+ Neg. Neg.
Anti-A1 (Humano) 4+ 2/3+ Neg. Neg.
Anti-H (Ulex europaeus) Neg. Neg. 3/4+ 2/3+
Anti-H (Humano) Neg. Neg. 2/3+ 1/2+
Reatividade de A1 e A2 com Lectinas
A1 A2
A lectina anti-A1 reage somente com
cadeias ramificadas do Ag A1
N-acetilgalactosamina
Relação dos grupos ABO/sítios antigênicos A, B e H
Concentração do Antígeno H:
O > A2 > B > A2B > A1 > A1B
Grupo Sanguíneo # de sítios do ag. A # de sítios do ag. B # de sítios do ag. H
O - - 1.590.000 a 1.740.000
A2 160.000 a 290.000 - 1.080.000 a 1.210.000
B - 610.000 a 830.000 540.000 a 760.000
A2B 120.000 a 200.000 450.000 a 550.000 300.000 a 500.000
A1 910.000 a 1.300.000 - 70.000 a 170.000
A1B 420.000 a 850.000 310.000 a 560.000 20.000 a 70.000
Com o que resolver a maioria dos problemas de ABO em ATs?
ABO
Direta
Reversa
Poliaglutinabilidade
Lavar Hm
Reagentes aquecidos
Antígenos fracos
Fixação e eluição
Incubação a 4°C
Tratamento com DTT
Mais reações
Menos reações
Aloanticorpo
Autoanticorpo
Incubação a 4°C
Subgrupos
Outras informações
Lectinas e outras hms
Sistema RH em 2019: Panorama atual
Sistema Rh (004 – ISBT)
• Cromossomo 1 – RHD e RHCE
• 417 aminoácidos
• Antígenos polimórficos: D, C, c, E, e
• Antígenos compostos: f
• Exclusivo de hemácias
• Enzima - resistentes
Anticorpos:
Geralmente imunes – IgG e não fixam “C”
RT e DHPN (moderada a grave)
Autoanticorpos
Efeitos de dose
TA, AGH e enzima
C/c
Ser103Pro
E/e
Pro226Ala
COOH
NH
2
Antígeno
Frequência %
Caucasianos Africanos
D 85 92
C 68 27
c 80 96
E 29 22
e 98 98
Sistema RH
• Considerações gerais
RH
Genes Rh
Antígeno D
Antígenos CcEe
Cromossomo 1
D normal
D fraco
D parcial
D negativo
SNPs
Sistema RH
ITENS ANTÍGENOS
PRODUÇÃO 6ª semana de vida IU
APRESENTAÇÃO Proteína com 417 aa, atravessando a membrana 12 vezes
FUNÇÃO Integridade da membrana e auxílio no transporte de amônia e CO2
ASSOCIAÇÃO COM
DOENÇAS
DHPN é a mais importante
EFEITO DAS PROTEASES Aumenta a expressão dos ags
EFEITO DE REAGENTES Resistentes ao tratamento
OUTRAS CONSIDERAÇÕES Exclusivo de hemácias
Sistema RH
ITENS ANTICORPOS
PRODUÇÃO Irregulares e imunes
APRESENTAÇÃO
IgG na maioria. Alguns IgM (IgA raro)
Dificilmente fixam complemento
TÉCNICA DE MELHOR
DETECÇÃO
Antiglobulina humana (AGH) e enzima (papaína, bromelina, etc.)
AUTOANTICORPOS Sim. Podem aparecer como aloanticorpos mimetizantes, especialmente em AHAI
REAÇÃO TRANSFUSIONAL
Rara já que é necessária compatibilização prévia. Varia de imediata a tardia e pode
ser de moderada a grave
DHPN Moderada a grave
Fenótipos Rh
• Fenótipo D positivo
• Presença do antígeno D
• Fenótipo D Negativo
• Ausência do antígeno D
• Mecanismos moleculares: Deleção do gene RHD e pseudo gene
• Fenótipos Variantes
• Presença do antígeno D em quantidade/qualidade diferentes
• Ex.: D fraco e D parcial
• Mecanismos moleculares: principalmente SNPs e genes híbridos
Expressão das proteínas Rh
Expressão das proteínas Rh
D fraco
• É uma variação quantitativa do antígeno RhD na superfície da hemácia, porém, os
poucos antígenos presentes possuem todos os epítopos (região reconhecida por
anticorpos) de forma normal
• Alterações nas regiões transmembranares e intracelulares na proteína
RhD normal: 10.000 a 50.000 epítopos
D fraco: de 66 a 5.000
Sítios Tipo
Tipo 2: discrepâncias
Tipo 5: geralmente tipado como
RhD negativo
2300
1900
1300
500
300
Tipo 4
Tipo 3
Tipo 1
Tipo 2
Tipo 5
Cut off sorológico
500 ags/Hm
D parcial
• É uma alteração caracterizada pela ausência de um ou mais epítopos de RhD e
substituídos por epítopos da proteína RhCE (CcEe) ou por SNPs
• Alterações encontram-se na região na extracelular, o que confere a alteração de um
sítio antigênico, levando a um perfil imunogênico diferente do D normal
RhD normal: 10.000 a 50.000 epítopos
D parcial: de 500 a 25.000
Imuno-hematologia laboratorial, MS, Brasil - 2014
Sistema RH
D negativo D positivo D fraco D parcial
ATENÇÃO SEM PROBLEMA ATENÇÃO
REDOBRADA
ATENÇÃO
REDOBRADA
Paciente:
Pode fazer anti-D
Doador:
Tx em RhD e RhD +
Paciente:
Não faz anti-D
Doador:
Tx só em RhD +
Paciente:
Não faz anti-D*
Doador:
Tx só em RhD +
Paciente:
Pode fazer anti-D
Doador:
Tx só em RhD +
Sistema RH
D fraco
D parcial
Difícil
diferenciação
sorológica
Pesquisa D
fraco
Reagentes de rotina atualmente não
distinguem o antígeno D fraco e D
parcial
Difícil manejo com o resultado obtido
Pode
aparecer
como:
D negativo
D positivo
Problema!
Atenção a resultados
inconsistentes
RhD
RhD
CTL Rh Positivo TAD positivo
Aloanticorpos
Autoanticorpos
Reações mais fracas D parcial
D negativo
Pesquisa de
D fraco
Positivo D fraco
AGH: Por que ela é tão revolucionária?
Antiglobulina humana (soro de Coombs)
Teste da Antiglobulina
Direta (TAD)
•Identificação de
anticorpos fixados à
superfície da hemácia
•Fixação in vivo
Pesquisa de Anticorpos
Irregulares
(PAI)
•Identificação de
anticorpos livres no
plasma
•Teste in vitro
AGH
Prova de Compatibilidade
•Compatibilização de
componentes eritrocitários
pré-txTeste in vitro
Antiglobulina humana (soro de Coombs)
• É um heteroanticorpo (anticorpos produzidos contra antígenos advindos de
indivíduos de espécies diferentes) que reconhece proteínas humanas
• Sua fração Fab se liga na fração Fc das imunoglobulinas
Teste da Antiglobulina Humana Direta (TAD)
• Aplicações diagnósticas do TAD:
• Investigação de Doença Hemolítica do Perinatal (DHPN)
• Investigação de Reação Hemolítica Transfusional (RHT)
• Testes de bloqueio
• Investigação de Anemia Hemolítica auto-imune (AHAI):
• Quente
• Fria
• Mista
• Por drogas
Teste da Antiglobulina Humana Direta (TAD)
AGH
Anti-IgG
Aglutinação
TAD positivo
IgG
Pesquisa de anticorpos irregulares - PAI
Aplicações diagnósticas da PAI:
Investigação de anticorpos irregulares em pacientes submetidos a
regime transfusional/gestantes RhD negativas
• Clinicamente significantes *
• Regime crônico de transfusão
• Politransfundidos
• Falciformes
• Talassêmicos
Pesquisa de anticorpos irregulares - PAI
• ISBT (International Society of Blood Transfusion)
• 36 sistemas de grupos sanguíneos descritos com mais de 300 alelos
• Mais conhecidos: sistema ABO (A, B e O) e sistema Rh (RhD)
• Outros sistemas de importância transfusional
• Rh (RH) – 4 antígenos + RhD
• Kell (KEL) – 6 antígenos
• Kidd (JK) – 2 antígenos
• Duffy (FY) – 2 antígenos
• MNSs (MNS) – 5 antígenos
• Diego (DI) – 4 antígenos
Anticorpos contra esses antígenos são
descobertos na PAI
Pesquisa de anticorpos irregulares - PAI
Consiste em colocar o soro ou plasma a ser pesquisado frente e hemácias
comerciais fenotipadas para os principais antígenos de sistemas de grupos
sanguíneos.
Hm I – CCDee Hm II - ccDEE
Pesquisa de anticorpos irregulares - PAI
Ponto positivo
 R1R1 e R2R2
 Fya Fyb Jka Jkb
 M S homozigose
Ponto negativo
 Dia positivo
Pesquisa de anticorpos irregulares - PAI
Ponto positivo
 R1R1 e R2R2
 Fya Fyb Jka Jkb
 M S homozigose
Ponto negativo
 Dia positivo
Pesquisa de anticorpos irregulares - PAI
ANTICORPOS CLINICAMENTE SIGNIFICANTES
Os anticorpos dos Sistemas ABO, RH, KELL, KIDD, DUFFY e contra os antígenos SsU devem ser
respeitados no caso de necessidade transfusional
ANTICORPOS QUE PODEM SER SIGNIFICANTES
Os anticorpos dirigidos contra os antígenos Lea, M, N, P, Lua e Lub podem ocasionalmente
determinar reação transfusional
ANTICORPOS QUE RARAMENTE SÃO SIGNIFICANTES
Os anticorpos dirigidos contra os antígenos Leb, Cha, Rga, Xga e os dirigidos contra antígenos de alto
título e baixa afinidade (HTLA) dificilmente estão envolvidos em problemas transfusionais
Prova de Compatibilidade (PC)
Consiste em colocar as hemácias do hemocomponente eritrocitário
frente ao soro/plasma do paciente
candidato a transfusão
Para os casos clínicos
Padrão de leitura
Casos Clínicos
Caso 1: De quem é esse sangue?
Um mulher de 81 anos foi admitida no hospital com sangramento gastrointestinal. Foi realizada o
GS e o PAI. Os resultado estão abaixo.
Ela foi transfundida de emergência com 2 CH compatíveis no dia da admissão.
A pos neg
I II
Casos Clínicos
Caso 1: De quem é esse sangue?
- Dois dias depois, hemoglobina cai, surge dor no peito, tontura e dispneia.
- Liberado 1 CH do grupo A compatível.
Tudo OK até aqui! Certo?
Casos Clínicos
Caso 1: De quem é esse sangue?
- Duas horas após o início da transfusão, a paciente reclama de sensação de queimação no local da
punção e febre de 40°C com calafrios e hipotensão.
Investigação de RT
- GS realizado com todas as amostras nova amostra. Resultados a seguir:
O que fazer nesse momento?
E agora? O que o laboratório deve fazer?
- Transfusão interrompida – paciente segue para CTI com quadro instável e hemoglobinúria. Paciente
prontamente assistida.
Casos Clínicos
? pos
Amostra pós tx
A pos
Amostra pré tx
Caso 1: De quem é esse sangue?
Casos Clínicos
Caso 1: De quem é esse sangue?
- Com claros sintomas de RTH por incompatibilidade ABO, a investigação acabou sendo conduzida
até o técnico que efetuou as coletas
- Ele informa que coletou mais de uma amostra na mesma sala no mesmo momento.
- Busca-se a informação dos outros pacientes. Havia somente mais um no dia. Segue GS desse
paciente com amostra pré-tx e com nova amostra para investigação
A posO pos
2ª amostraAmostra pré-tx
Casos Clínicos
Caso 1: De quem é esse sangue?
- RESULTADO: O técnico que efetuou as coletas trocou as amostras no momento da identificação,
que não foi efetuado ao lado dos pacientes, mas ao retornar ao laboratório
Highlight do caso
Discrepância ABO por erro na identificação
da amostra
Casos Clínicos
Caso 2: Tem um frio aí? Ou tem dois?
Um paciente de 65 anos com doença linfoproliferativa, politransfundida em um evento prévio há
algum anos atrás. Hoje, internada eu um hospital de outro estado, foi solicitada tx. O resultado do
GS ABO segue abaixo:
Estranho? Causas???
1. Auto-frio
2. A2 com anti A1
3. Aloanticorpo
4. Um pouco de cada???
Casos Clínicos
Caso 2: Tem um frio aí? Ou tem dois?
Como resolver?
Auto frio A2 com anti-A1
Lectinas
PAI +
Casos Clínicos
Caso 2: Tem um frio aí? Ou tem dois?
Auto frio
? pos
Casos Clínicos
Caso 2: Tem um frio aí? Ou tem dois?
PAI AGH, TA, 4°C
Casos Clínicos
Caso 2: Tem um frio aí? Ou tem dois?
- RESULTADO: O paciente é subgrupo de A, sendo caracterizado como A2 e ainda possui uma auto-
aglutinina fria.
Highlight do caso
A maioria dos processos são plenamente passíveis
de serem realizados nas ATs
Casos Clínicos
Caso 3: Filho da mãe!
- Mulher, 37a, primeira gestação, nunca foi transfundida. Na rotina pré-natal, na tipagem sanguínea
dessa mulher, obtém-se os seguintes resultado:
O pos ? neg
I II
Casos Clínicos
Caso 3: Filho da mãe!
- Preocupado em classificar o paciente corretamente, o teste de D fraco é feito e o resultado
encontra-se abaixo:
neg
I II Df
4+
D fraco
positivo E aí?
Casos Clínicos
Caso 3: Filho da mãe!
- Uma amostra do pai da criança foi coletada e o resultado foi o seguinte:
O pos
Grandes chances da
criança ser RhD positivo
Qual a conduta?
Faz imunoglobulina nela
ou não?
Casos Clínicos
Caso 3: Filho da mãe!
- O teste de D fraco só nos mostra D fracos mesmo?
Clones DII DIV DBT DAR DVI Df2
ESD1 + + + + - +
LHM77/64 - - - + + +
MS26 - - - - + +
D parcial D fraco
Casos Clínicos
Caso 3: Filho da mãe!
- RESULTADO: Amostra encaminhada para posterior investigação molecular. Confirmado D parcial
tipo IV. Profilaxia com imunoglobulina realizada. Recém-nascido sem DHFRN.
Highlight do caso
Atenção com as reações entre +/- e 2+ na classificação
RhD
Casos Clínicos
Caso 4: PAI negativo e PC incompatível? Como pode?
- Um homem negro foi admitido no CTI de um hospital geral com quadro de hemorragia digestiva
baixa, dispinéico, hipocorado e foram solicitados 1 CH O+ (previamente classificados) em urgência.
Familiares informam que ele nunca foi transfundido.
- Amostra coletada e os resultados dos testes pré-transfusionais seguem abaixo:
B pos neg
I II x1
2+
PC
E agora?
Casos Clínicos
Caso 4: PAI negativo e PC incompatível? Como pode?
- Investigar a incompatibilidade.
TAD do CH
Ac x Ag alta
frequência
Como?
Casos Clínicos
Caso 4: PAI negativo e PC incompatível? Como pode?
- Proceder com o TAD da bolsa
neg
I II x1
2+
PC
x1
TAD
Casos Clínicos
Caso 4: PAI negativo e PC incompatível? Como pode?
- RESULTADO: O CH 1 está com TAD positivo, o que inviabiliza a sua compatibilização.
Finalizamos o caso?
Vamos retornar aos primeiros
resultados
Casos Clínicos
Caso 4: PAI negativo e PC incompatível? Como pode?
- Um homem negro foi admitido no CTI de um hospital geral com quadro de hemorragia digestiva
baixa, dispinéico, hipocorado e foram solicitados 1 CH O+ (previamente classificados) em urgência.
Familiares informam que ele nunca foi transfundido.
- Amostra coletada e os resultados dos testes pré-transfusionais seguem abaixo:
B pos ??? neg
I II x1
2+
PC
x1
TAD
Casos Clínicos
Caso 4: PAI negativo e PC incompatível? Como pode?
- É RhD positivo ou negativo ou não sei?
B pos Parcial tipo VI
Possui um clone que
detecta a variante
DVI sem a
necessidade do
teste de D fraco
Blend de clones que
não detectam a
variante DVI
Liberar CH RhD neg
Casos Clínicos
Caso 4: PAI negativo e PC incompatível? Como pode?
- RESULTADO: TAD positivo da bolsa impediu uma possível futura aloimunização anti-D
Highlight do caso
• Entender como os reagentes funcionam
• Ter a consciência de que o trabalho na AT abrange muito mais
do que se imagina
Agradecimento
Obrigado
thiago.vianna.carvalho@gmail.com

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Imuno-hematologia Básica

  • 2. Timeline da hemoterapia Mundo antigo 1000 AC 1665 Idade Média 1628 1667 1678/79 Proibição da prática transfusional na Europa 1818 1867 1901 1912Sec. III Taurobolium Papa Inocêncio VIII W. Harvey J. B. Denis K. Landsteiner R. OttenbergR. Lower J. Lister J. Blundell Hiato 1945 R. Coombs
  • 3. Imuno-hematologia Imuno-hematologia é um ramo da hemoterapia que estuda os antígenos presentes nos eritrócitos e seus anticorpos correspondentes, assim como fenômenos análogos relacionados com a patogênese e com as manifestações clínicas provocadas por problemas do sangue
  • 4. Imuno-hematologia As máximas da imuno-hematologia 1°- tudo se resume a interação antígeno x anticorpo 2°- se o alvo da pesquisa é o antígeno, usamos anticorpos conhecidos e vice-versa 3°- se o teste diz que é “direto”, a pesquisa é na hemácia e se o teste é “indireto” ou “reverso”, a pesquisa é no plasma/soro
  • 5. Introdução O que são antígenos eritrocitários? São marcadores de superfície que possuem função definida e podem deflagrar a resposta imune
  • 6. Introdução O que são anticorpos? São proteínas cuja reação se dá somente com o antígeno contra o qual foi produzido
  • 7. Sistema ABO e algumas peculiaridades
  • 8. Sistema ABO Grupo A Grupo B Grupo AB Grupo O Tipo das hemácias Anticorpos presentes Nenhum Antígenos presentes Nenhum Anti-B Anti-A
  • 9. Sistema ABO ITENS ANTÍGENOS ANTICORPOS PRODUÇÃO Desde a 5ª semana de vida IU À partir do 4º mês após o nascimento APRESENTAÇÃO Em RN, 1/3 dos sítios de A e B IU: somente anticorpos maternos Neonato: anticorpos maternos e início da produção no 4º mês EXPRESSÃO MÁXIMA 2-4 anos de vida N/A OUTRAS CONSIDERAÇÕES Antígenos de histocompatibilidade PAI: Atenção aos anticorpos MATERNOS
  • 10. Sistema ABO • Considerações gerais ABO Glicosil transferases N-acetilgalactosaminil transferase Galactosiltransferase Sem produção de transferase Cromossomo 9 Gene B Gene H Substância H
  • 11. Sistema ABO • Considerações gerais ABO Glicosil transferases N-acetilgalactosaminil transferase Galactosiltransferase Sem produção de transferase Cromossomo 9 Gene B Gene H Substância HSubstância H
  • 12. Sistema ABO • Considerações gerais ABO Glicosil transferases N-acetilgalactosaminil transferase Galactosiltransferase Sem produção de transferase Cromossomo 9 Gene B Gene H Substância HSubstância H Substância H
  • 13. Sistema ABO • Considerações gerais ABO Glicosil transferases N-acetilgalactosaminil transferase Galactosiltransferase Sem produção de transferase Cromossomo 9 Gene B Gene H Substância HSubstância H Substância H Substância H
  • 14. Sistema ABO • Considerações gerais ABO Glicosil transferases N-acetilgalactosaminil transferase Galactosiltransferase Sem produção de transferase Cromossomo 9 Grupo A GalNac + H Grupo B Gal + H Gene B Grupo O Substância H Gene H Substância H Substância H Substância H Substância H
  • 15. Sistema ABO • Considerações gerais ABO Glicosil transferases N-acetilgalactosaminil transferase Galactosiltransferase Sem produção de transferase Cromossomo 9 Grupo A GalNac + H Grupo B Gal + H Gene B Grupo O Substância H Gene H Substância H Substância H Substância H Substância H
  • 16. Sistema ABO • Técnica de classificação ABO geral • Prova direta – consiste em por as hemácias a serem testadas frente a antissoros comercias • Prova reversa – consiste em por o plasma a ser testado frente a hemácias comercias
  • 17. Sistema ABO Adaptado de Imuno-hematologia laboratorial, MS, Brasil - 2014
  • 18. Sistema ABO – Subgrupo • Os polimorfismos do sistema ABO são causados por mutações nas sequências de nucleotídeos no DNA. O gene A1 é considerado o gene selvagem • Subgrupos diferem pela quantidade antígenos nas hemácias • Os subgrupos de A (A1, A2, A3, Ax, Aend, Am) e B (B3, Bx,Bm) resultam de polimorfismos na estrutura do gene produtor da glicosiltransferase • A1: 80% indivíduo • A2: 19,9 % • A3, Ax, Aend, Am,...: 0,1% • Grupo A e subgrupos de A –acetilgalactosamina • Grupo B e subgrupos de B – galactose
  • 19. Sistema ABO – Subgrupo • Sorologia: • Fraca expressão antigênica na fenotipagem c/ reagentes anti-A, anti-B ou anti- AB – reagentes policlonais principalmente • Possibilidade de discrepância entre tipagem direta e reversa • Lectinas servem como ferramenta para elucidação de subgrupos. As mais comuns são as lectinas para os antígenos A1 e H
  • 20. Sistema ABO – Subgrupo • As lectinas são proteínas, de origem não-imunológica, com propriedades de se ligar de forma reversível a carboidratos • São produzidas à partir de extratos herbários Lec. Anti-A1: Dolichos biflorus Lec. Anti-H: Ulex europaeus Já existem anticorpos monoclonais no mercado Anti-H Mono-type Grifols – clone 10934C11
  • 21. Reatividade de A1 e A2 com Lectinas Por que a Lectina anti-A1 (Dolichos biflorus) identifica somente o antígeno A1 e não o A2 se o açúcar imunodominante é o mesmo? Reativos Hemácias Teste A1 A1B A2 A2B Anti-A1 (Dolichos biflorus) 4+ 4+ Neg. Neg. Anti-A1 (Humano) 4+ 2/3+ Neg. Neg. Anti-H (Ulex europaeus) Neg. Neg. 3/4+ 2/3+ Anti-H (Humano) Neg. Neg. 2/3+ 1/2+
  • 22. Reatividade de A1 e A2 com Lectinas A1 A2 A lectina anti-A1 reage somente com cadeias ramificadas do Ag A1 N-acetilgalactosamina
  • 23. Relação dos grupos ABO/sítios antigênicos A, B e H Concentração do Antígeno H: O > A2 > B > A2B > A1 > A1B Grupo Sanguíneo # de sítios do ag. A # de sítios do ag. B # de sítios do ag. H O - - 1.590.000 a 1.740.000 A2 160.000 a 290.000 - 1.080.000 a 1.210.000 B - 610.000 a 830.000 540.000 a 760.000 A2B 120.000 a 200.000 450.000 a 550.000 300.000 a 500.000 A1 910.000 a 1.300.000 - 70.000 a 170.000 A1B 420.000 a 850.000 310.000 a 560.000 20.000 a 70.000
  • 24. Com o que resolver a maioria dos problemas de ABO em ATs?
  • 25. ABO Direta Reversa Poliaglutinabilidade Lavar Hm Reagentes aquecidos Antígenos fracos Fixação e eluição Incubação a 4°C Tratamento com DTT Mais reações Menos reações Aloanticorpo Autoanticorpo Incubação a 4°C Subgrupos Outras informações Lectinas e outras hms
  • 26. Sistema RH em 2019: Panorama atual
  • 27. Sistema Rh (004 – ISBT) • Cromossomo 1 – RHD e RHCE • 417 aminoácidos • Antígenos polimórficos: D, C, c, E, e • Antígenos compostos: f • Exclusivo de hemácias • Enzima - resistentes Anticorpos: Geralmente imunes – IgG e não fixam “C” RT e DHPN (moderada a grave) Autoanticorpos Efeitos de dose TA, AGH e enzima C/c Ser103Pro E/e Pro226Ala COOH NH 2 Antígeno Frequência % Caucasianos Africanos D 85 92 C 68 27 c 80 96 E 29 22 e 98 98
  • 28. Sistema RH • Considerações gerais RH Genes Rh Antígeno D Antígenos CcEe Cromossomo 1 D normal D fraco D parcial D negativo SNPs
  • 29. Sistema RH ITENS ANTÍGENOS PRODUÇÃO 6ª semana de vida IU APRESENTAÇÃO Proteína com 417 aa, atravessando a membrana 12 vezes FUNÇÃO Integridade da membrana e auxílio no transporte de amônia e CO2 ASSOCIAÇÃO COM DOENÇAS DHPN é a mais importante EFEITO DAS PROTEASES Aumenta a expressão dos ags EFEITO DE REAGENTES Resistentes ao tratamento OUTRAS CONSIDERAÇÕES Exclusivo de hemácias
  • 30. Sistema RH ITENS ANTICORPOS PRODUÇÃO Irregulares e imunes APRESENTAÇÃO IgG na maioria. Alguns IgM (IgA raro) Dificilmente fixam complemento TÉCNICA DE MELHOR DETECÇÃO Antiglobulina humana (AGH) e enzima (papaína, bromelina, etc.) AUTOANTICORPOS Sim. Podem aparecer como aloanticorpos mimetizantes, especialmente em AHAI REAÇÃO TRANSFUSIONAL Rara já que é necessária compatibilização prévia. Varia de imediata a tardia e pode ser de moderada a grave DHPN Moderada a grave
  • 31. Fenótipos Rh • Fenótipo D positivo • Presença do antígeno D • Fenótipo D Negativo • Ausência do antígeno D • Mecanismos moleculares: Deleção do gene RHD e pseudo gene • Fenótipos Variantes • Presença do antígeno D em quantidade/qualidade diferentes • Ex.: D fraco e D parcial • Mecanismos moleculares: principalmente SNPs e genes híbridos
  • 34. D fraco • É uma variação quantitativa do antígeno RhD na superfície da hemácia, porém, os poucos antígenos presentes possuem todos os epítopos (região reconhecida por anticorpos) de forma normal • Alterações nas regiões transmembranares e intracelulares na proteína RhD normal: 10.000 a 50.000 epítopos D fraco: de 66 a 5.000 Sítios Tipo Tipo 2: discrepâncias Tipo 5: geralmente tipado como RhD negativo 2300 1900 1300 500 300 Tipo 4 Tipo 3 Tipo 1 Tipo 2 Tipo 5 Cut off sorológico 500 ags/Hm
  • 35. D parcial • É uma alteração caracterizada pela ausência de um ou mais epítopos de RhD e substituídos por epítopos da proteína RhCE (CcEe) ou por SNPs • Alterações encontram-se na região na extracelular, o que confere a alteração de um sítio antigênico, levando a um perfil imunogênico diferente do D normal RhD normal: 10.000 a 50.000 epítopos D parcial: de 500 a 25.000 Imuno-hematologia laboratorial, MS, Brasil - 2014
  • 36. Sistema RH D negativo D positivo D fraco D parcial ATENÇÃO SEM PROBLEMA ATENÇÃO REDOBRADA ATENÇÃO REDOBRADA Paciente: Pode fazer anti-D Doador: Tx em RhD e RhD + Paciente: Não faz anti-D Doador: Tx só em RhD + Paciente: Não faz anti-D* Doador: Tx só em RhD + Paciente: Pode fazer anti-D Doador: Tx só em RhD +
  • 37. Sistema RH D fraco D parcial Difícil diferenciação sorológica Pesquisa D fraco Reagentes de rotina atualmente não distinguem o antígeno D fraco e D parcial Difícil manejo com o resultado obtido Pode aparecer como: D negativo D positivo Problema! Atenção a resultados inconsistentes
  • 38. RhD RhD CTL Rh Positivo TAD positivo Aloanticorpos Autoanticorpos Reações mais fracas D parcial D negativo Pesquisa de D fraco Positivo D fraco
  • 39. AGH: Por que ela é tão revolucionária?
  • 40. Antiglobulina humana (soro de Coombs) Teste da Antiglobulina Direta (TAD) •Identificação de anticorpos fixados à superfície da hemácia •Fixação in vivo Pesquisa de Anticorpos Irregulares (PAI) •Identificação de anticorpos livres no plasma •Teste in vitro AGH Prova de Compatibilidade •Compatibilização de componentes eritrocitários pré-txTeste in vitro
  • 41. Antiglobulina humana (soro de Coombs) • É um heteroanticorpo (anticorpos produzidos contra antígenos advindos de indivíduos de espécies diferentes) que reconhece proteínas humanas • Sua fração Fab se liga na fração Fc das imunoglobulinas
  • 42. Teste da Antiglobulina Humana Direta (TAD) • Aplicações diagnósticas do TAD: • Investigação de Doença Hemolítica do Perinatal (DHPN) • Investigação de Reação Hemolítica Transfusional (RHT) • Testes de bloqueio • Investigação de Anemia Hemolítica auto-imune (AHAI): • Quente • Fria • Mista • Por drogas
  • 43. Teste da Antiglobulina Humana Direta (TAD) AGH Anti-IgG Aglutinação TAD positivo IgG
  • 44. Pesquisa de anticorpos irregulares - PAI Aplicações diagnósticas da PAI: Investigação de anticorpos irregulares em pacientes submetidos a regime transfusional/gestantes RhD negativas • Clinicamente significantes * • Regime crônico de transfusão • Politransfundidos • Falciformes • Talassêmicos
  • 45. Pesquisa de anticorpos irregulares - PAI • ISBT (International Society of Blood Transfusion) • 36 sistemas de grupos sanguíneos descritos com mais de 300 alelos • Mais conhecidos: sistema ABO (A, B e O) e sistema Rh (RhD) • Outros sistemas de importância transfusional • Rh (RH) – 4 antígenos + RhD • Kell (KEL) – 6 antígenos • Kidd (JK) – 2 antígenos • Duffy (FY) – 2 antígenos • MNSs (MNS) – 5 antígenos • Diego (DI) – 4 antígenos Anticorpos contra esses antígenos são descobertos na PAI
  • 46. Pesquisa de anticorpos irregulares - PAI Consiste em colocar o soro ou plasma a ser pesquisado frente e hemácias comerciais fenotipadas para os principais antígenos de sistemas de grupos sanguíneos. Hm I – CCDee Hm II - ccDEE
  • 47. Pesquisa de anticorpos irregulares - PAI Ponto positivo  R1R1 e R2R2  Fya Fyb Jka Jkb  M S homozigose Ponto negativo  Dia positivo
  • 48. Pesquisa de anticorpos irregulares - PAI Ponto positivo  R1R1 e R2R2  Fya Fyb Jka Jkb  M S homozigose Ponto negativo  Dia positivo
  • 49. Pesquisa de anticorpos irregulares - PAI ANTICORPOS CLINICAMENTE SIGNIFICANTES Os anticorpos dos Sistemas ABO, RH, KELL, KIDD, DUFFY e contra os antígenos SsU devem ser respeitados no caso de necessidade transfusional ANTICORPOS QUE PODEM SER SIGNIFICANTES Os anticorpos dirigidos contra os antígenos Lea, M, N, P, Lua e Lub podem ocasionalmente determinar reação transfusional ANTICORPOS QUE RARAMENTE SÃO SIGNIFICANTES Os anticorpos dirigidos contra os antígenos Leb, Cha, Rga, Xga e os dirigidos contra antígenos de alto título e baixa afinidade (HTLA) dificilmente estão envolvidos em problemas transfusionais
  • 50. Prova de Compatibilidade (PC) Consiste em colocar as hemácias do hemocomponente eritrocitário frente ao soro/plasma do paciente candidato a transfusão
  • 51. Para os casos clínicos Padrão de leitura
  • 52. Casos Clínicos Caso 1: De quem é esse sangue? Um mulher de 81 anos foi admitida no hospital com sangramento gastrointestinal. Foi realizada o GS e o PAI. Os resultado estão abaixo. Ela foi transfundida de emergência com 2 CH compatíveis no dia da admissão. A pos neg I II
  • 53. Casos Clínicos Caso 1: De quem é esse sangue? - Dois dias depois, hemoglobina cai, surge dor no peito, tontura e dispneia. - Liberado 1 CH do grupo A compatível. Tudo OK até aqui! Certo?
  • 54. Casos Clínicos Caso 1: De quem é esse sangue? - Duas horas após o início da transfusão, a paciente reclama de sensação de queimação no local da punção e febre de 40°C com calafrios e hipotensão. Investigação de RT - GS realizado com todas as amostras nova amostra. Resultados a seguir: O que fazer nesse momento? E agora? O que o laboratório deve fazer? - Transfusão interrompida – paciente segue para CTI com quadro instável e hemoglobinúria. Paciente prontamente assistida.
  • 55. Casos Clínicos ? pos Amostra pós tx A pos Amostra pré tx Caso 1: De quem é esse sangue?
  • 56. Casos Clínicos Caso 1: De quem é esse sangue? - Com claros sintomas de RTH por incompatibilidade ABO, a investigação acabou sendo conduzida até o técnico que efetuou as coletas - Ele informa que coletou mais de uma amostra na mesma sala no mesmo momento. - Busca-se a informação dos outros pacientes. Havia somente mais um no dia. Segue GS desse paciente com amostra pré-tx e com nova amostra para investigação A posO pos 2ª amostraAmostra pré-tx
  • 57. Casos Clínicos Caso 1: De quem é esse sangue? - RESULTADO: O técnico que efetuou as coletas trocou as amostras no momento da identificação, que não foi efetuado ao lado dos pacientes, mas ao retornar ao laboratório Highlight do caso Discrepância ABO por erro na identificação da amostra
  • 58. Casos Clínicos Caso 2: Tem um frio aí? Ou tem dois? Um paciente de 65 anos com doença linfoproliferativa, politransfundida em um evento prévio há algum anos atrás. Hoje, internada eu um hospital de outro estado, foi solicitada tx. O resultado do GS ABO segue abaixo: Estranho? Causas??? 1. Auto-frio 2. A2 com anti A1 3. Aloanticorpo 4. Um pouco de cada???
  • 59. Casos Clínicos Caso 2: Tem um frio aí? Ou tem dois? Como resolver? Auto frio A2 com anti-A1 Lectinas PAI +
  • 60. Casos Clínicos Caso 2: Tem um frio aí? Ou tem dois? Auto frio ? pos
  • 61. Casos Clínicos Caso 2: Tem um frio aí? Ou tem dois? PAI AGH, TA, 4°C
  • 62. Casos Clínicos Caso 2: Tem um frio aí? Ou tem dois? - RESULTADO: O paciente é subgrupo de A, sendo caracterizado como A2 e ainda possui uma auto- aglutinina fria. Highlight do caso A maioria dos processos são plenamente passíveis de serem realizados nas ATs
  • 63. Casos Clínicos Caso 3: Filho da mãe! - Mulher, 37a, primeira gestação, nunca foi transfundida. Na rotina pré-natal, na tipagem sanguínea dessa mulher, obtém-se os seguintes resultado: O pos ? neg I II
  • 64. Casos Clínicos Caso 3: Filho da mãe! - Preocupado em classificar o paciente corretamente, o teste de D fraco é feito e o resultado encontra-se abaixo: neg I II Df 4+ D fraco positivo E aí?
  • 65. Casos Clínicos Caso 3: Filho da mãe! - Uma amostra do pai da criança foi coletada e o resultado foi o seguinte: O pos Grandes chances da criança ser RhD positivo Qual a conduta? Faz imunoglobulina nela ou não?
  • 66. Casos Clínicos Caso 3: Filho da mãe! - O teste de D fraco só nos mostra D fracos mesmo? Clones DII DIV DBT DAR DVI Df2 ESD1 + + + + - + LHM77/64 - - - + + + MS26 - - - - + + D parcial D fraco
  • 67. Casos Clínicos Caso 3: Filho da mãe! - RESULTADO: Amostra encaminhada para posterior investigação molecular. Confirmado D parcial tipo IV. Profilaxia com imunoglobulina realizada. Recém-nascido sem DHFRN. Highlight do caso Atenção com as reações entre +/- e 2+ na classificação RhD
  • 68. Casos Clínicos Caso 4: PAI negativo e PC incompatível? Como pode? - Um homem negro foi admitido no CTI de um hospital geral com quadro de hemorragia digestiva baixa, dispinéico, hipocorado e foram solicitados 1 CH O+ (previamente classificados) em urgência. Familiares informam que ele nunca foi transfundido. - Amostra coletada e os resultados dos testes pré-transfusionais seguem abaixo: B pos neg I II x1 2+ PC E agora?
  • 69. Casos Clínicos Caso 4: PAI negativo e PC incompatível? Como pode? - Investigar a incompatibilidade. TAD do CH Ac x Ag alta frequência Como?
  • 70. Casos Clínicos Caso 4: PAI negativo e PC incompatível? Como pode? - Proceder com o TAD da bolsa neg I II x1 2+ PC x1 TAD
  • 71. Casos Clínicos Caso 4: PAI negativo e PC incompatível? Como pode? - RESULTADO: O CH 1 está com TAD positivo, o que inviabiliza a sua compatibilização. Finalizamos o caso? Vamos retornar aos primeiros resultados
  • 72. Casos Clínicos Caso 4: PAI negativo e PC incompatível? Como pode? - Um homem negro foi admitido no CTI de um hospital geral com quadro de hemorragia digestiva baixa, dispinéico, hipocorado e foram solicitados 1 CH O+ (previamente classificados) em urgência. Familiares informam que ele nunca foi transfundido. - Amostra coletada e os resultados dos testes pré-transfusionais seguem abaixo: B pos ??? neg I II x1 2+ PC x1 TAD
  • 73. Casos Clínicos Caso 4: PAI negativo e PC incompatível? Como pode? - É RhD positivo ou negativo ou não sei? B pos Parcial tipo VI Possui um clone que detecta a variante DVI sem a necessidade do teste de D fraco Blend de clones que não detectam a variante DVI Liberar CH RhD neg
  • 74. Casos Clínicos Caso 4: PAI negativo e PC incompatível? Como pode? - RESULTADO: TAD positivo da bolsa impediu uma possível futura aloimunização anti-D Highlight do caso • Entender como os reagentes funcionam • Ter a consciência de que o trabalho na AT abrange muito mais do que se imagina