O documento discute dosagem de proteínas plasmáticas através de ensaios de imunodiagnóstico. Resume os principais tipos de proteínas plasmáticas, métodos de dosagem como ELISA e imunodifusão, e fatores que podem interferir nos resultados como escolha entre plasma e soro e hemólise.

1. Dosagem de proteínas plasmáticas
através de ensaios de Imunodiagnóstico
Prof. Ricardo Portela
Salvador – Fevereiro 2013

2. Proteínas plasmáticas
• Resumidamente, todo e qualquer tipo de
molécula complexa que pode ser encontrada
no soro
• Sua identificação e dosagem têm como
objetivo avaliar o estado clínico de algum
paciente perante algum tipo possível de
patologia e/ou tratamento.

3. Proteínas plasmáticas
• Intervalos de referência ou valores de
referência:
– Intervalo de valores no qual 95 a 99% da
população da espécie estudada apresenta os
níveis de proteínas plasmáticas sem apresentar
nenhum tipo de alteração patológica – pacientes
hígidos!
– É calculado levando em consideração os valores
obtidos em uma população clinicamente hígida!

4. Intervalos de Referência
• Cálculos de Intervalo de Referências:
– TEMA DE AULA PRÁTICA!

5. Proteínas Constituintes
• Tipos de proteínas a serem analisadas:
– Proteínas constituintes básicas: albumina
– “Colesterol”
– “Triglicerídeos”

6. Enzimas
• São proteínas altamente especializadas com
atividade catalítica; praticamente todas as
reações químicas celulares onde participam
biomoléculas orgânicas são catalisadas por
enzimas.
• Existem milhares de enzimas, cada uma capaz de
catalisar um tipo de reação química diferente.
• Exemplos: fosfatase ácida, fosfatase
básica, transaminases
• Podem não ser típicas do soro, mas sua presença
neste serve de marcador de injúria tecidual

7. Proteínas Transportadoras
• São proteínas que se ligam a íons ou a
moléculas específicas, as quais são
transportadas de um órgão para outro.
Transportam hormônios, vitaminas, metais,
drogas e oxigênio (hemoglobina); solubilizam os
lipídios (apoproteínas). Transportam, por
exemplo, a glicose, aminoácidos e outras
substâncias.

8. Proteínas de Armazenamento
• Atuam no armazenamento de certas
substâncias, ex.: ferritina, que armazena
átomos de ferro.

9. Proteínas com função imunológica
• Imunoglobulinas
• Proteínas da cascata da coagulação
• Proteínas do Sistema do Complemento
• Proteínas de Fase Aguda

10. Proteínas Reguladoras - Hormônios
• Muitas vezes presentes na circulação
sanguínea, pois é a via de transporte desde o
órgão produtor ao órgão alvo
• Prolactina, FSH, LH, TSH, eritropoietina,
hormônio do crescimento
• Não proteínas: testosterona, progesterona,
estrógeno

11. Escolha do método a ser empregado
• Natureza da molécula: proteína, açúcar, lipídeo
• Tamanho da molécula e complexidade
• Peso molecular
• Possibilidade ou não de formação de complexos com outras
moléculas
• Função da molécula: hormônio, enzima...
• Concentração da molécula no soro

12. ENZIMAS - MÉTODOS
• Grande parte das enzimas plasmáticas NÃO são
quantificadas por métodos imunológicos
• Levando-se em consideração a sua ação
enzimática específica, utilizam-se métodos nos
quais se adiciona o substrato da enzima, e um
marcador para a transformação enzimática
• Resultados lidos por espectrofotometria

13. ENZIMAS
• Exemplos
– Amilase: adição de amido e iodo, e a diminuição da
cor azul é correspondente a quantidade de amilase na
amostra;
– GamaGT: catalisa a transferência de glutamil para
glicilglicina, formando p-nitroanilina, que absorve a
405nm
– Lipase: clivagem de triglicéride de cadeia longa, com
formação de composto de coloração vermelha

14. ENZIMAS
• Exemplos
– Fosfatase ácida: atuando sobre timolftaleína, e um
álcali converte o resultado da reação em
substância de cor azul
– Transaminase pirúvica: formação de piruvato e
hidrazona, formando cor em meio alcalino
– CK-MB: formação de tiocolina, e redução de
ferricianeto.

15. ENZIMAS
• Mas...
– Algumas enzimas são presentes em baixas
concentrações no soro, e não se pode dosá-las por
métodos bioquímicos de pouca sensibilidade;
– A ação enzimática de algumas é difícil de reproduzir in
vitro, com alto custo de substrato e co-enzimas;
– Algumas tem ação enzimática muito específica, e
ainda não foi desenvolvida técnica para tornar essa
ação detectável...

16. MÉTODOS E SUAS UTILIZAÇÕES

17. IMUNODIFUSÃO
(IMUNODIFUSÃO SIMPLES)
• Método antigo, de boa especificidade, mas de baixa
sensibilidade
• Medição dos halos de precipitação, e comparação
com os halos de calibradores
• Praticidade, baixo custo, não há necessidade de
aparato sofisticado, confecção rápida

18. IMUNODIFUSÃO
(IMUNODIFUSÃO RADIAL SIMPLES)
• Limitação: utilizado para proteínas séricas que
tenham alta concentração em fluidos corporais
(nível de mg/mL)
• Utilizado para proteínas séricas que tenham um
intervalo de referência largo (pequenas variações
não influenciariam no resultado)
• Em desuso atualmente, principalmente devido a
problemas de reprodutibilidade, de manutenção
do gel (comercialmente)

19. IMUNODIFUSÃO
• O caso das Imunoglobulinas:
– Por terem uma concentração sérica considerada
alta (com exceção de IgE), e por terem largas
faixas de referências, podem ser dosadas por
Imunodifusão simples.
– Praticidade, custo baixo
– Exceção: quando se necessita do resultado com
urgência (incubações podem durar até 3 dias)

20. ELISA SANDUÍCHE
• Utilizado atualmente como método de
referência para diversas proteínas plasmáticas
• Consegue realizar detecção e quantificação de
proteínas plasmáticas com sensibilidade de
até nanogramas (dependendo do tipo de
sistema utilizado)
• Relação custo/benefício boa

21. Outros componentes do soro
ELISA “SANDWICH”
Antígeno a ser dosado Anticorpo primário
Anticorpo conjugado
TMB
Enzima Peroxidase

22. ELISA SANDUÍCHE
• Para o desenvolvimento do método:
– Necessário a proteína ser de um peso molecular e
complexidade razoáveis – necessidade de haver mais
de um epitopo
– Necessário o emprego de anticorpos para dois
epitopos diferentes, e espacialmente afastados um do
outro
– Necessário o analito purificado e quantificado de
forma confiável

23. ELISA SANDUÍCHE
• Para o desenvolvimento do método:
– Necessário quantidade razoável de soros para serem
empregados como referências – previamente
quantificados para o analito em questão
– Decidir quanto ao método enzimático a ser
empregado
– Verificar questões de sensibilidade analítica,
linearidade, range de detecção, reprodutibilidade,
repetitividade...

24. QUESTÃO DO MEIO PONTO
• O caso do PSA e do PSA Livre:
– PSA utilizado como um marcador para alterações e
patologias prostáticas
– Dosado rotineiramente por Elisa Sanduíche
– Encontrado normalmente complexado com anti-
proteases
– PSA Livre e relação PSA Livre/PSA Total normalmente
é mais informativo do que somente PSA Livre
– Pergunta-se: como desenvolver uma dosagem em
ELISA sanduíche de PSA Livre, sem ser influenciado
pelo PSA Total?

25. ELISA COMPETIÇÃO
• Moléculas monovalentes – possuem somente
um epitopo (as vezes a molécula inteira é um
anticorpo) – incapacidade de realizar um ELISA
Sanduíche
• Alternativa para dosar esse tipo de molécula:
ELISA de competição

26. ELISA DE COMPETIÇÃO
Outros componentes do soro
Antígeno a ser dosado Anticorpo primário
Antígeno biotinilado
TMB
ST-AV- Peroxidase

27. ELISA COMPETIÇÃO
• Exemplos de moléculas séricas com essas
características: T3, T4, estrógeno, progesterona,
testosterona
• Diferença importante: Na competição a correlação
entre reação desenvolvida e quantidade de analito é
inversamente proporcional!
• Importante frisar: a curva desenvolvida é, além de
inversa, também logarítmica, para a grande maioria
dos analitos em ELISA Competição!

28. ELISA COMPETIÇÃO
• Pontos necessários para desenvolvimento de um ELISA
competição:
– Necessário: ter um anticorpo específico para o epitopo
único de seu analito!
– Necessário: ter o seu analito marcado/conjugado com
substância enzimática, purificado e quantificado
corretamente
– Necessário: Saber previamente o intervalo de referência
do analito para poder fazer calibrações na concentração de
analito conjugado a ser utilizado no ensaio

29. QUESTÃO DO MEIO PONTO
• O caso de T3/T4:
– T3 e T4 são moléculas bem pequenas, que devem
ser dosadas em sistema de competição.
– Enzimas como a peroxidase e a fosfatase alcalina
são grandes, complexas
– A diferença de tamanho entre a enzima e o analito
pode influenciar em seu reconhecimento pelo
anticorpo de captura
– PERGUNTA: como proceder?

30. ELISA DE COMPETIÇÃO
• A questão da Biotina:
– Biotina - vitamina H, B7 ou B8
– Streptoavidina: quelação de biotina em indivíduos
infectados com Streptomyces
– Ligação de grande afinidade de Streptoavidina
com biotina

31. ELISA DE COMPETIÇÃO
• A questão da Biotina:
– Biotina: pode ser usada em mecanismos de
conjugação com grande sucesso!
– Streptoavidina: pode ser conjugada com peroxidase!
– Uma streptoavidina pode carregar 4 peroxidases (3
para deixar um sítio para ligar a biotina)
– E daí???

32. IMUNOQUIMIOLUMINESCÊNCIA
IMUNOFLUORESCÊNCIA
• São aplicadas quando se necessita de maior
sensibilidade analítica!
• Pode detectar analitos na ordem de pico a
fentogramas!
• Muito utilizadas hoje em dia (Luminescência mais)
em ensaios de dosagem de analitos séricos
humanos (mesmo com concentrações usuais nem
tão baixas assim!)

33. Adição de anticorpo monoclonal específico para
o antígeno pesquisado conjugado a enzima.
Uma microesfera de poliestireno é revestida com
anticorpo monoclonal contra antígeno analisado
Adição do soro do paciente, que é incubado com
agitação intermitente.
Lavagem para retirada do antígeno não fixado
Incubação do conjugado e mais uma
lavagem para tirar o anticorpo não fixadoY
Y
Y
Y
Adição do substrato da enzima, em seguida,
incubação.
A adição de substrato quimioluminescente sofre
hidrólise na presença da enzima, produzindo
substâncias instáveis que geram emissão de
fótons (luz).
Y
Y
Anticorpo monoclonal
Substrato
Conjugado
Antígeno do soro do
paciente

34. Estes impulsos são lidos em
“contagens” de luz por
segundo (cps). Essa unidade é
proporcional a quantidade de
antígenos presentes na
amostra.
Estes fótons são medidos través
de um fotomultiplicador (PMT)
que tem a função de transformar
a luz emitida pelos fótons em
impulsos elétricos.

35. IMUNOQUIMIOLUMINESCÊNCIA
IMUNOFLUORESCÊNCIA
• Possuem as mesmas variações de um ELISA:
Competição, Indireto, Sanduíche, Captura
• A escolha do tipo vai seguir os mesmos padrões
para o ELISA!
• Grande vantagem: Sensibilidade analítica elevada!
• Consegue detectar pequenas variações nas
concentrações dos analitos!

36. IMUNOQUIMIOLUMINESCÊNCIA
IMUNOFLUORESCÊNCIA
• Necessário: anticorpos diretamente conjugados
com substâncias fluorescentes ou
quimioluminescentes, ou com enzimas que
tenham ação sobre um substrato que se torne
luminescente ou fluorescente
• Necessário: substâncias fluorescentes ou
quimioluminescentes, e outras que façam sua
estabilização

37. IMUNOQUIMIOLUMINESCÊNCIA
IMUNOFLUORESCÊNCIA
• Necessário: leitores de quimioluminescência ou
fluorescência
• Necessário: soros padrões dosados por técnicas
igualmente sensíveis
• Necessário: PADRONIZAÇÃO CORRETA DE
CONCENTRAÇÃO DE REAGENTES, e determinação
de sua repetitividade e reprodutibilidade

38. QUESTÃO DE MEIO PONTO
• A questão da alta sensibilidade:
– A alta sensibilidade dos ensaios acarreta um preço:
Qualquer variação mínima em tempo de incubação,
pipetagem, temperatura de incubação, lavagens pode
acarretar um resultado distorcido
– Portanto, a reprodutibilidade pode ser problemática!
– Pergunta: como proceder?

39. AUTOMAÇÃO

40. Interferentes clássicos em dosagem
de proteínas plasmáticas
• Questão SORO x Plasma!
– Plasma: contém ainda proteínas da coagulação
– Soro: sem proteínas da coagulação – mais limpo!
– Tempo de coagulação: consumo de glicose e de outras
enzimas
– Tamanho das proteínas a serem dosadas: podem estar
aprisionadas no processo de coagulação!
– Interação Antígeno/Anticorpo e moléculas da coagulação!

41. Interferentes clássicos em dosagem
de proteínas plasmáticas
• Hemólise!
– Liberação de hemoglobina no soro/plasma
– Alteração da coloração da amostra: influência em ensaios
espectrofotométricos com utilização de grande qtdade de
amostra
– Contaminação com componentes internos das células:
problema maior em eletrólitos, e em algumas enzimas
– Interferência na ação de algumas enzimas (inibição)
– Interferências nas reações antígeno/anticorpo quando em
grande concentrações!

42. Interferentes clássicos em dosagem
de proteínas plasmáticas
• Hemólise!
• Para evitá-la:
– Retirada de sangue: cuidados com a pressão negativa
violenta, com a manipulação de seringas e agulhas,
com a retirada correta
– Evitar altas temperaturas
– Evitar exposição a luz
– Tempo de conservação
– Tempo de permanência do coágulo antes de sua
retirada

43. Interferentes clássicos em dosagem
de proteínas plasmáticas
• Cuidados pessoais do paciente pré-coleta:
– Jejum – fundamental para algumas enzimas e
proteínas carreadoras
– Suspensão de medicação: corticóides principalmente
– Relato de qualquer tipo de alteração
– Intervenções e reações cruzadas!