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O ANTIBIOGRAMA NO LABORATÓRIOMarilene Rodrigues Chang&Ana Cláudia Souza Rodrigues
Métodos de Teste de Sensibilidade aosAntimicrobianos (TSA)Dra. Marilene Rodrigues ChangDepartamento de Farmácia e Bioquímica da UFMSMestre em Análises Clínicas, área de Micologia, FCF/USP-SPDoutora em Ciências,  área de Bacteriologia, IOC/FIOCRUZ- RJ
Resistência Bacteriana a Antimicrobianos
Atividade Antimicrobiana: Primeira ObservaçãoAlexander Fleming 1920
Ensaios BiológicosReprodução da descoberta de FlemingReprodução da placa de Fleming para a prova de sensibilidade aos antibióticos   Susceptibilidade  Antimicrobiana
Quando e porquê realizar o antibiograma?Isolado requer terapia antimicrobiana
Isolado cuja susceptibilidade não é preditiva
Isolado capaz de exibir resistência
Orientação terapêutica
Permite individualizar padrões de resistênciaImportância e indicações do teste de sensibilidadeAvalia o padrão da resposta da bactéria diante de concentrações pré-estabelecidas de antibióticos correlacionadas com níveis séricosO antibiograma reflete a bactéria e a droga, sem considerar aspectos clínicos Deve ser realizado para microrganismos cujas técnica é referendada em consensosIndicado para bactéria cujo padrão de resistência não é previsível Ex. Desnecessária para bactéria cuja sensibilidade é conhecida como a do S. pyogenes frente à penicilinaNão indicada para bactérias no seu sítio anatômico usual. Ex. E. coli de fezes e S. viridans do TRS.A liberação de um resultado pode encorajar o clínico ao tratamento de uma condição normal e encobrir seu verdadeiro problema
TESTE DE SENSIBILIDADE AOS ANTIMICROBIANOSMETODOLOGIASAvaliação QUALITATIVADISCO DIFUSÃO EM ÁGAR (Kirby e Bauer, 1966)Avaliação QUANTITATIVA  DILUIÇÃO EM CALDOMacrodiluiçãoMicrodiluição	DILUIÇÃO EM ÁGAR
  ETEST
AUTOMATIZADOSCLINICAL and LABORATORY STANDARDS INSTITUTECLSI - antigo“NCCLS”Organização internacional, interdisciplinar e educacional que promove o desenvolvimento de normas e procedimentos laboratoriais padronizados.Composta de representantes da área da saúde, incluindo médicos, microbiologistas, educadores, farmacêuticos, representantes do governo e indústria, etc.
TESTE DE SENSISIBILIDADE AOSANTIBIÓTICOSPadronizaçãoControle de qualidade dos itens:meiospH		temperatura		incubação		discos (Cepas ATCC)
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TSA

  • 1. O ANTIBIOGRAMA NO LABORATÓRIOMarilene Rodrigues Chang&Ana Cláudia Souza Rodrigues
  • 2. Métodos de Teste de Sensibilidade aosAntimicrobianos (TSA)Dra. Marilene Rodrigues ChangDepartamento de Farmácia e Bioquímica da UFMSMestre em Análises Clínicas, área de Micologia, FCF/USP-SPDoutora em Ciências, área de Bacteriologia, IOC/FIOCRUZ- RJ
  • 3. Resistência Bacteriana a Antimicrobianos
  • 4. Atividade Antimicrobiana: Primeira ObservaçãoAlexander Fleming 1920
  • 5. Ensaios BiológicosReprodução da descoberta de FlemingReprodução da placa de Fleming para a prova de sensibilidade aos antibióticos Susceptibilidade Antimicrobiana
  • 6. Quando e porquê realizar o antibiograma?Isolado requer terapia antimicrobiana
  • 7. Isolado cuja susceptibilidade não é preditiva
  • 8. Isolado capaz de exibir resistência
  • 10. Permite individualizar padrões de resistênciaImportância e indicações do teste de sensibilidadeAvalia o padrão da resposta da bactéria diante de concentrações pré-estabelecidas de antibióticos correlacionadas com níveis séricosO antibiograma reflete a bactéria e a droga, sem considerar aspectos clínicos Deve ser realizado para microrganismos cujas técnica é referendada em consensosIndicado para bactéria cujo padrão de resistência não é previsível Ex. Desnecessária para bactéria cuja sensibilidade é conhecida como a do S. pyogenes frente à penicilinaNão indicada para bactérias no seu sítio anatômico usual. Ex. E. coli de fezes e S. viridans do TRS.A liberação de um resultado pode encorajar o clínico ao tratamento de uma condição normal e encobrir seu verdadeiro problema
  • 11. TESTE DE SENSIBILIDADE AOS ANTIMICROBIANOSMETODOLOGIASAvaliação QUALITATIVADISCO DIFUSÃO EM ÁGAR (Kirby e Bauer, 1966)Avaliação QUANTITATIVA DILUIÇÃO EM CALDOMacrodiluiçãoMicrodiluição DILUIÇÃO EM ÁGAR
  • 13. AUTOMATIZADOSCLINICAL and LABORATORY STANDARDS INSTITUTECLSI - antigo“NCCLS”Organização internacional, interdisciplinar e educacional que promove o desenvolvimento de normas e procedimentos laboratoriais padronizados.Composta de representantes da área da saúde, incluindo médicos, microbiologistas, educadores, farmacêuticos, representantes do governo e indústria, etc.
  • 14. TESTE DE SENSISIBILIDADE AOSANTIBIÓTICOSPadronizaçãoControle de qualidade dos itens:meiospH temperatura incubação discos (Cepas ATCC)
  • 15. Teste de sensibilidade aos antimicrobianosBactéria e Preparo do Inóculo Suspensão direta
  • 16. Método de crescimento0,5 McFarland 1a 2x108 UFC/mL
  • 17. Teste de sensibilidade aos antimicrobianosProcedimentoBactéria e Inóculo
  • 18. TESTE DE SENSIBILIDADE AOS ANTIMICROBIANOSInóculo - Método do crescimento“3 a 5” colônias 4 a 5 mL de Salina
  • 19. Incubar 33 a 35oC - (2 a 6h)*
  • 20. Ajustar a turbidez 0,5 McFarland1 a 2x108 UFC/mL
  • 21. TESTE DE SENSIBILIDADE AOS ANTIMICROBIANOSInóculo - Suspensão direta 3 a 5 colônias 4 a 5 mL de salina
  • 22. Ajustar a turbidez 0,5 McFarland1 a 2 x 108 UFC/mL Estabilizar 15 min.TESTE DE SENSIBILIDADE AOS ANTIMICROBIANOSInóculo
  • 24. TESTE DE DISCO DIFUSÃO EM ÁGAR Fácil execução Flexibilidade na escolha dos antibióticos Padronização dos resultados Baixo custo
  • 25. TESTE DE DISCO DIFUSÃO EM ÁGARMeiosÁgar Mueller-HintonÁgar Mueller-Hinton suplementadoReprodutibilidade do teste. Baixo teor de inibidores de sulfonamidas, trimetoprim e tetraciclinas.
  • 26. Permite crescimento satisfatório da maioria dos patógenosTESTE DE DIFUSÃO EM ÁGARO que devemos saber sobre os meios? Umidade
  • 27. Efeito da Timidina ou TiminaInibidores das sulfonamidas e trimetoprim. Teste de esterilidade
  • 28. Efeitos da variação de Magnésio e Cálcio TESTE DE DIFUSÃO EM ÁGARDiscos Conservação 8oC ou  freezer(não “frost free”)Imipenem, Ertapenem, Cefaclor e combinações de ác.clavulânicoRetirar do refrigerador ou do freezer até 2 horas antes do uso
  • 29. Evitar umidade
  • 30. Data de validadeTESTE DE DIFUSÃO EM ÁGARInoculaçãoSuperfície do ágar não deve estar úmida
  • 32. Esperar diminuir a umidade antes da aplicação dos discos Cuidado na distribuição do inóculoInadequadoAdequado
  • 33. TESTE DE DIFUSÃO EM ÁGARAplicação dos discos Bateria pré determinada
  • 34. Aplicar e pressionar o disco
  • 35. Aplicar no máximo 12 discos na placa de 150mm 5 discos na placa de 90mm Inverter a placa e incubar 15 minutos após a aplicação TESTE DE DIFUSÃO EM ÁGARIncubação Temperatura 33 a 35oC
  • 36. Atmosfera atm ambienteexceção Haemoplilus spp., N. gonorrhoeae e estreptococos:  CO2Obs.P/ S. maltophilia, B. cepacea, Streptococcus spp, Leitura de OXA e VAN para Staphylococcus – 20 a 24h de incubaçãoTESTE DE DIFUSÃO EM ÁGARPrincípio do método
  • 37. TESTE DE DIFUSÃO EM ÁGARLeitura e Interpretaçãomm
  • 38. TESTE de MACRODILUIÇÃOg/mL 100 50 25 12.5 6.25 3.12 .16 .8 .4 controle Método quantitativo MICConceito
  • 41. DesvantagensÉ a menor concentração da droga que inibe completamente o crescimento bacteriano.
  • 42. MICg/mL100 50 25 12.5 6.25 3.12 .16 . 8 .4 controle • • •• • •• • • •• • • • •• • • •MBCConcentração Bactericida MínimaMACRODILUIÇÃO
  • 43. MICRODILUIÇÃOConc. decrescente do antimicrobianoAntimicrobianos testados
  • 44. DILUIÇÃO EM ÁGARVANTAGENS:Utilizado em estudos epidemiológicos Fácil execução Permite testar vários isolados simultaneamente Promove resultados quantitativos Permite o teste de bactérias fastidiosas Baixo custo (relativo) Preparo das placas e estocagemDESVANTAGENSMuito trabalhoso, tanto a preparação das placas quanto a preparação do inóculo, especialmente quando vários antimicrobianos devem ser testados
  • 45. As placas de ágar não podem ser armazenadas por muito tempoEtestPrincípio do método
  • 48. MÉTODOS AUTOMATIZADOSPainelSistema WalkAway(Dade Behring™) Incuba automaticamente asuspensão bacteriana, Adiciona reagentes e executa a leitura dos painéis. Determina CIMDupla metodologia:Colorimétrica e Fluorogênica.Tem capacidade de processar,simultaneamente,40 painéis (WalkAway® 40) ou96 painéis (WalkAway® 96).
  • 50. Antibiograma não padronizado para todas as bactérias
  • 51. Mudança de MIC, software novo demora chegar
  • 53. Falsa resistênciaInterpretação do ResultadoSusceptível (S)A categoria susceptível implica que a infecção causada pela cepa bacteriana isolada pode ser adequadamente tratada com a dosagem do antimicrobiano recomendada para o tipo de infecção e o agente infeccioso. Desde que não haja contra indicação.
  • 54. Interpretação do ResultadoIntermediária (I)A categoria intermediária inclui isolados cujos MICs são próximos aos do sangue e tecidos. Ela permite a aplicabilidade do antimicrobiano em infecções em sítios onde as drogas são fisiologicamente concentradas ou quando doses maiores podem ser utilizadas.
  • 55. Interpretação do ResultadoResistente (R)A categoria resistente inclui isolados que não são inibidos pelas concentrações usuais do antimicrobiano na dosagem padrão e/ou falha quando um específico mecanismo de resistência é expressado.
  • 56. CONSIDERAÇÕES FINAISA avaliação da sensibilidade aos antimicrobianos representa uma das tarefas mais importantes do laboratório de microbiologia.
  • 57. O constante aparecimento de novos mecanismos bacterianos de resistência e novos antimicrobianos tornam os testes cada vez mais complexos
  • 58. É necessário uma atualização constante dos protocolos e a freqüente implementação de novos testes e metodologias.
  • 59. Microbiologistas, patologistas clínicos e médicos assistentes são obrigados a estarem em constante atualizaçãoReferências1. The MASTER website (self-training) for AST:http://www.phppo.cdc.gov/dls/master/default.aspx2. Fact sheets from CDC on laboratory issues, including AST:http://www.cdc.gov/ncidod/hip/Lab/LAB.HTM3. www.anvisa.gov.br/servicosaude/manuais/clsi.asp4. Koneman et al. Diagnóstico microbiológico: Texto e Atlas Colorido. 6a. Ed., 2008.