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LAQB
                         Laboratório de Analises
                          Químicas e Biológicas




Principais conceitos e técnicas
 utilizados na microbiologia




   Aluno: Ivson Cassiano de O. Santos



                 2012
INTRODUÇÃO


   A Microbiologia é o ramo da biologia que estuda os
    microrganismos, incluindo eucariontes unicelulares e
    procariontes, que incluem Bactérias, Fungos, Vírus,
    Protozoários, Algas unicelulares, Viróides e Prions.




   A Bacteriologia é uma ciência, ramo da Biologia, que
    estuda as bactérias e suas propriedades.
CONDUTAS,     BARREIRAS,     EQUIPAMENTOS       E
    INSTRUMENTAIS DE PROTEÇÃO INDIVIDUAL E AMBIENTAL



 ambiente apropriado
 instrumentais estéreis

 luvas, máscaras e óculos protetores

 Flambar as alças e agulhas e boca dos tubos.

 limpar e desinfetar periodicamente a bancada.




         Todas as operações envolvendo manipulação de culturas e
    meios de cultura deverão ser efetuadas na área de proteção
    conferida pela chama do bico de Bunsen.
ÁLCOOL 70%

Sua atividade ocorre pela desnaturação de proteínas e remoção de
lipídios, inclusive dos envelopes de alguns vírus. Para apresentar
sua atividade germicida máxima, o álcool deve ser diluído em
água, que possibilita a desnaturação das proteínas. A concentração
recomendada para atingir maior rapidez microbicida com o álcool
etílico é de 70% em peso e com o isopropílico, entre 60 e 95%.


Possuir fácil aplicabilidade, baixo custo e reduzida toxicidade.


Diluição correta e tempo de exposição
CUIDADOS DE ASSEPSIA NA REMOÇÃO DE BACTÉRIAS
CUIDADOS DE ASSEPSIA NA REMOÇÃO DE BACTÉRIAS




 Fig.: Procedimento para remover bactérias de um caldo com a
 alça de platina
CUIDADOS DE ASSEPSIA NA REMOÇÃO DE BACTÉRIAS




  Fig.: Procedimento para inocular um meio Agar inclinado a partir de
  uma Placa de Petri
INOCULAÇÃO NA PLACA DE PETRI




                     Isolamento de colônias
                     bacterianas e obtenção
                     culturas puras.




                        Estrias múltiplas ou
                        esgotamento
DESCONTAMINAÇÃO
   Um dos principais problemas nos laboratórios de microbiologia é a grande
    quantidade de resíduos contendo microrganismos infecciosos.


   Autoclaves




   Desinfecção química
      Os recipientes que acondicionam material com perigos microbiológicos
    devem conter um desinfetante na diluição de uso apropriada.


       Compostos à base de fenol 5% , hipocloritos (água sanitária a 2%) e
    glutaraldeído 2%, formaldeído (solução alcoólica 8% e solução aquosa
    10%).
BANCO DE DADOS

    O nosso laboratório dispõe de uma tabela com as bactérias presentes
   em estoque com suas devidas informações e observações.


Bactéria      Cepa/numero         Origem         Espécie


Condições de crescimento        Incubação         Condições de estoque

       Ultima data de estoque               Observações
INTRODUÇÃO
   Cepas bacterianas




         Isto deriva dos fenômenos espontâneas ou
        induzidos da natureza ou mesmo
        artificialmente, chamado "Mutação Genética"
CEPAS PADRÃO
   São cepas destinadas ao controle de qualidade
    bacteriológico.

   Apresentam resposta conhecida a uma série de
    provas laboratoriais, entre as quais bioquimismo,
    reação tintorial ao Gram, morfologia e resposta a
    antibióticos.

     ATCC                 AYE              SDF

          ACICU                     AB
CEPAS LAQB
   Cepas ATCC - American Type Culture
    Collection.

          Escherichia coli ATCC 10536
ESCHERICHIA COLI ATCC 10536




             Referencia para esta cepa :
             Di Modugno E et al. 1994
             Misiek et al. 1973.
STAPHYLOCOCCUS AUREUS ATCC 8096
PSEUDOMONAS AERUGINOSA ATCC 9027
MICROCOCCUS LUTEUS ATCC 10240
   ATCC 14452
MEIO DE CULTURA
        Conjunto de substâncias, formuladas de maneira adequada,
    capazes de promover o crescimento bacteriano, em condições
    laboratoriais. Para isso um meio de cultura necessita conter
    características básicas, que incluem:

   - Fonte de carbono e nitrogênio

   - Fonte de energia

   - Sais minerais

   - Fatores de crescimento

   - Condições físicas

   - Esterilização
TIPOS DE MEIOS DE CULTURA
              Meios de enriquecimentos
   Caldo Brain Heart Infusion (BHI)
   Caldo Tetrationato

                  Meios de transporte
   Meio de Stuart
   Meio de Cary-Blair
   Caldo Tioglicolato

                     Meio seletivo
                     o
   Agar Manitol Salgado
   Agar SS
TIPOS DE MEIOS DE CULTURA
                  Meio diferencial
   Agar Eosin Meteiolene Blue (EMB)
   Agar McConkey
   Agar Hektoen.

                    Meio indicador
   Agar Triple Sugar Iron (TSI)
   Agar Citrato de simimons.
PROCEDIMENTOS E CUIDADOS NA PREPARAÇÃO
DE MEIOS DE CULTURA


 Na preparação de um meio, deve-se adicionar uma pequena
    quantidade de água até que o meio fique úmido e então completar
    com o resto de água homogeneizando a solução.




    O tempo de esterilização em autoclave é de 15 minutos á
    temperatura de 121°C.


   Os meios devem ser autoclavados com as tampas semi-abertas,
    para que a esterilização seja por igual em todo o conteúdo dos
    tubos - tampas fechadas não permitem a entrada do vapor.
Todos os meios confeccionados
    devem ser devidamente
  identificados com o nome do
meio e do responsável, data de
 fabricação, data de validade e
    tipo de armazenamento.
MANUTENÇÃO DE CULTURAS
    A manutenção de culturas é realizada para que
    se possa manter viável as cepas em estoque.



De acordo com a cepa a concentração de glicerol
 pode variar.
Ex.: E. coli 50% glicerol e 50% Ágar Nutriente.



          Prazo de validade: 3 meses á -20°C.
PLANO DE TRABALHO LAQB - 2012
Objetivo: Fazer o levantamento de cepas atualmente encontradas no
LAQB e preparar o mesmo para aquisição de outras.

                                Método:

1°- Inoculado as amostras em meio enriquecido para proporcionar o
crescimento das amostras. O meio de enriquecimento escolhido foi o
caldo BHI, após a semeadura , incubar por 24h á 37ºC.

Resultados: POSITIVO para turvação no meio.
            NEGATIVO para coloração intacta do meio.

2° - De acordo com os resultados obtidos na etapa 1, será semeado as
amostras de acordo com o meio seletivo de cada espécie.

                   Staphylococcus aureus = manitol
                            E. coli = EMB
             Pseudomonas areuginosa = agar Pseudomonas
                      Micrococcus luteus = MH
Método:

   Análise do crescimento bacteriano (morfologia e coloração)



                                 O Manitol é fermentado pelo Staphylococcus Aureus,
                                 mas não pela maioria dos Staphylococcus; o Sal inibe o
                                 crescimento da maioria dos microrganismos, mas o
                                 Staphylococcus Aureus.



    Meio Manitol salgado para
    Staphylococcus Aureus.



                                 O meio EMB, o azul de Eosina e Metileno
                                 inibem o crescimento de Gram positivas. E. coli
                                 apresentam colônias escuras ou verde metalico,
                                 fermentação da lactose e sacarose.


    Meio EMB (Eosine Methylene
    Blye) para E. coli
Método:
Análise do crescimento bacteriano (morfologia e coloração)


                                Permite a diferenciação de P. aeroginosa de outras
                                Pseudomonas. As P. aeroginosa apresentam
                                pigmento azul-verde escuro que se funde ao meio.



  Meio Agar Pseudomonas.




                                  M. luteus apresentam pigmentação amarela
                                  tanto em meio AN, quanto em MH.




Micrococcus luteus em meio MH
Método:

3° - Ressemear, por esgotamento, todas as amostras crescidas
e isoladas em meio agar nutriente 24h 37°C




                         Meio Agar Nutriente




4° - Teste bioquímico

  A investigação das atividades metabólicas das bactérias “in vitro” é chamada de
Provas Bioquímicas e servem para auxiliar o microbiologista a identificar grupos ou
espécies de bactérias
Método:

4° - Teste bioquímico


 Meio TSI, meio SIM, meio citrato de Simons, Meio úreia.


5° - Preparo para estoque


   Semear em placa, com swab, as amostras cultivadas no caldo


6° - Estoque




                                                    NEXT
REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
   APOSTILA DE AULAS PRÁTICAS – DISCIPLINA:
    BACTERIOLOGIA. PROFESSOR ALOYSIO
    CERQUEIRA, UFF.

   Descrição dos Meios de Cultura Empregados nos
    Exames Microbiológicos – ANVISA.

   Protocolos para Preparo de Meios de Cultura da
    Embrapa Agrobiologia, 1999.

   Biossegurança em Laboratórios Biomédicos de
    Microbiologia - 3.a edicao, 2006.
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Conceitos Basicos de Microgiologia

  • 1. LAQB Laboratório de Analises Químicas e Biológicas Principais conceitos e técnicas utilizados na microbiologia Aluno: Ivson Cassiano de O. Santos 2012
  • 2. INTRODUÇÃO  A Microbiologia é o ramo da biologia que estuda os microrganismos, incluindo eucariontes unicelulares e procariontes, que incluem Bactérias, Fungos, Vírus, Protozoários, Algas unicelulares, Viróides e Prions.  A Bacteriologia é uma ciência, ramo da Biologia, que estuda as bactérias e suas propriedades.
  • 3. CONDUTAS, BARREIRAS, EQUIPAMENTOS E INSTRUMENTAIS DE PROTEÇÃO INDIVIDUAL E AMBIENTAL  ambiente apropriado  instrumentais estéreis  luvas, máscaras e óculos protetores  Flambar as alças e agulhas e boca dos tubos.  limpar e desinfetar periodicamente a bancada. Todas as operações envolvendo manipulação de culturas e meios de cultura deverão ser efetuadas na área de proteção conferida pela chama do bico de Bunsen.
  • 4. ÁLCOOL 70% Sua atividade ocorre pela desnaturação de proteínas e remoção de lipídios, inclusive dos envelopes de alguns vírus. Para apresentar sua atividade germicida máxima, o álcool deve ser diluído em água, que possibilita a desnaturação das proteínas. A concentração recomendada para atingir maior rapidez microbicida com o álcool etílico é de 70% em peso e com o isopropílico, entre 60 e 95%. Possuir fácil aplicabilidade, baixo custo e reduzida toxicidade. Diluição correta e tempo de exposição
  • 5. CUIDADOS DE ASSEPSIA NA REMOÇÃO DE BACTÉRIAS
  • 6. CUIDADOS DE ASSEPSIA NA REMOÇÃO DE BACTÉRIAS Fig.: Procedimento para remover bactérias de um caldo com a alça de platina
  • 7. CUIDADOS DE ASSEPSIA NA REMOÇÃO DE BACTÉRIAS Fig.: Procedimento para inocular um meio Agar inclinado a partir de uma Placa de Petri
  • 8. INOCULAÇÃO NA PLACA DE PETRI Isolamento de colônias bacterianas e obtenção culturas puras. Estrias múltiplas ou esgotamento
  • 9. DESCONTAMINAÇÃO  Um dos principais problemas nos laboratórios de microbiologia é a grande quantidade de resíduos contendo microrganismos infecciosos.  Autoclaves  Desinfecção química Os recipientes que acondicionam material com perigos microbiológicos devem conter um desinfetante na diluição de uso apropriada. Compostos à base de fenol 5% , hipocloritos (água sanitária a 2%) e glutaraldeído 2%, formaldeído (solução alcoólica 8% e solução aquosa 10%).
  • 10. BANCO DE DADOS O nosso laboratório dispõe de uma tabela com as bactérias presentes em estoque com suas devidas informações e observações. Bactéria Cepa/numero Origem Espécie Condições de crescimento Incubação Condições de estoque Ultima data de estoque Observações
  • 11. INTRODUÇÃO  Cepas bacterianas Isto deriva dos fenômenos espontâneas ou induzidos da natureza ou mesmo artificialmente, chamado "Mutação Genética"
  • 12. CEPAS PADRÃO  São cepas destinadas ao controle de qualidade bacteriológico.  Apresentam resposta conhecida a uma série de provas laboratoriais, entre as quais bioquimismo, reação tintorial ao Gram, morfologia e resposta a antibióticos. ATCC AYE SDF ACICU AB
  • 13. CEPAS LAQB  Cepas ATCC - American Type Culture Collection. Escherichia coli ATCC 10536
  • 14. ESCHERICHIA COLI ATCC 10536 Referencia para esta cepa : Di Modugno E et al. 1994 Misiek et al. 1973.
  • 17. MICROCOCCUS LUTEUS ATCC 10240  ATCC 14452
  • 18. MEIO DE CULTURA Conjunto de substâncias, formuladas de maneira adequada, capazes de promover o crescimento bacteriano, em condições laboratoriais. Para isso um meio de cultura necessita conter características básicas, que incluem:  - Fonte de carbono e nitrogênio  - Fonte de energia  - Sais minerais  - Fatores de crescimento  - Condições físicas  - Esterilização
  • 19. TIPOS DE MEIOS DE CULTURA  Meios de enriquecimentos  Caldo Brain Heart Infusion (BHI)  Caldo Tetrationato  Meios de transporte  Meio de Stuart  Meio de Cary-Blair  Caldo Tioglicolato Meio seletivo o  Agar Manitol Salgado  Agar SS
  • 20. TIPOS DE MEIOS DE CULTURA Meio diferencial  Agar Eosin Meteiolene Blue (EMB)  Agar McConkey  Agar Hektoen.  Meio indicador  Agar Triple Sugar Iron (TSI)  Agar Citrato de simimons.
  • 21. PROCEDIMENTOS E CUIDADOS NA PREPARAÇÃO DE MEIOS DE CULTURA  Na preparação de um meio, deve-se adicionar uma pequena quantidade de água até que o meio fique úmido e então completar com o resto de água homogeneizando a solução.  O tempo de esterilização em autoclave é de 15 minutos á temperatura de 121°C.  Os meios devem ser autoclavados com as tampas semi-abertas, para que a esterilização seja por igual em todo o conteúdo dos tubos - tampas fechadas não permitem a entrada do vapor.
  • 22. Todos os meios confeccionados devem ser devidamente identificados com o nome do meio e do responsável, data de fabricação, data de validade e tipo de armazenamento.
  • 23. MANUTENÇÃO DE CULTURAS  A manutenção de culturas é realizada para que se possa manter viável as cepas em estoque. De acordo com a cepa a concentração de glicerol pode variar. Ex.: E. coli 50% glicerol e 50% Ágar Nutriente. Prazo de validade: 3 meses á -20°C.
  • 24. PLANO DE TRABALHO LAQB - 2012 Objetivo: Fazer o levantamento de cepas atualmente encontradas no LAQB e preparar o mesmo para aquisição de outras. Método: 1°- Inoculado as amostras em meio enriquecido para proporcionar o crescimento das amostras. O meio de enriquecimento escolhido foi o caldo BHI, após a semeadura , incubar por 24h á 37ºC. Resultados: POSITIVO para turvação no meio. NEGATIVO para coloração intacta do meio. 2° - De acordo com os resultados obtidos na etapa 1, será semeado as amostras de acordo com o meio seletivo de cada espécie. Staphylococcus aureus = manitol E. coli = EMB Pseudomonas areuginosa = agar Pseudomonas Micrococcus luteus = MH
  • 25. Método:  Análise do crescimento bacteriano (morfologia e coloração) O Manitol é fermentado pelo Staphylococcus Aureus, mas não pela maioria dos Staphylococcus; o Sal inibe o crescimento da maioria dos microrganismos, mas o Staphylococcus Aureus. Meio Manitol salgado para Staphylococcus Aureus. O meio EMB, o azul de Eosina e Metileno inibem o crescimento de Gram positivas. E. coli apresentam colônias escuras ou verde metalico, fermentação da lactose e sacarose. Meio EMB (Eosine Methylene Blye) para E. coli
  • 26. Método: Análise do crescimento bacteriano (morfologia e coloração) Permite a diferenciação de P. aeroginosa de outras Pseudomonas. As P. aeroginosa apresentam pigmento azul-verde escuro que se funde ao meio. Meio Agar Pseudomonas. M. luteus apresentam pigmentação amarela tanto em meio AN, quanto em MH. Micrococcus luteus em meio MH
  • 27. Método: 3° - Ressemear, por esgotamento, todas as amostras crescidas e isoladas em meio agar nutriente 24h 37°C Meio Agar Nutriente 4° - Teste bioquímico A investigação das atividades metabólicas das bactérias “in vitro” é chamada de Provas Bioquímicas e servem para auxiliar o microbiologista a identificar grupos ou espécies de bactérias
  • 28. Método: 4° - Teste bioquímico Meio TSI, meio SIM, meio citrato de Simons, Meio úreia. 5° - Preparo para estoque Semear em placa, com swab, as amostras cultivadas no caldo 6° - Estoque NEXT
  • 29. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS  APOSTILA DE AULAS PRÁTICAS – DISCIPLINA: BACTERIOLOGIA. PROFESSOR ALOYSIO CERQUEIRA, UFF.  Descrição dos Meios de Cultura Empregados nos Exames Microbiológicos – ANVISA.  Protocolos para Preparo de Meios de Cultura da Embrapa Agrobiologia, 1999.  Biossegurança em Laboratórios Biomédicos de Microbiologia - 3.a edicao, 2006.