O documento descreve os procedimentos de segurança e técnicas básicas utilizadas em laboratório de microbiologia, incluindo normas de segurança, cultura pura, esterilização, assepsia e métodos físicos e químicos para controle do crescimento microbiano.

1. Material e Técnicas Básicas Utilizadas no Laboratório de Microbiologia

2. Normas de segurança Uso de jaleco; Desinfecção das mãos com solução germicida, água e sabão, após contato com material microbiológico; Gestos bruscos; Contato de áreas desprotegidas com material infeccioso deve ser comunicado ao professor; Instrumental usado não deve ser desprezado sobre a bancada; Verificar posição da entrada de ar do bico de Bunsen;

3. Normas de segurança Para abrir ou fechar tubos com material microbiológico, ou meio de cultura a ser inoculado, segure-o com a mão esquerda , remova a tampa com a direita retendo-a com o dedo mínimo; Ao terminar de usar o microscópio, desligá-lo; Lâminas utilizadas devem ser descartadas na travessa de vidro sobre a bancada; Não abrir os meios de cultura que estiverem sobre a bancada sem autorização do professor, para se evitar contaminações.

4. Cultura pura Crescimento, em meio de cultivo adequado, de um conjunto de células idênticas, correspondentes a mesma espécie

5. Esterilização – eliminação de toda e qualquer forma de vida presente em determinado material ou ambiente. Assepsia – uso de manobras assépticas, que são técnicas que impedem a entrada de micro-organismos onde não são desejados.

7. Prática 1 Objetivos: Identificar e manipular corretamente a vidraria principal e outros objetos de uso mais frequente em microbiologia; Definir cultura pura , esterilização e asspsia; Descrever as principais técnicas de manobras assépticas , Desenvolver habilidade de manipular tubos com meios estéries, bem como transferir micro-organismos de meio sólido para meio sólido e para meio líquido; Conscientizar-se da presença de micro-organismos no ambiente.

8. Execução 1ª: Apresentação do material de laboratório: mostrar a vidraria principal (tubos, pipetas Pasteur, placas, etc) 2ª: Treinar manobras assépticas: 1 – Distribuição, de um tubo para o outro , caldo simples estéril, usando pipeta (2,0ml). Repetir quando a técnica não se mostrar adequada. 2 – Transferir uma porção do crescimento de Serratia sp crescida em tubo de agar inclinado contendo meio de agar simples, para outro meio idêntico, com auxílio de alça de inoculação . 3 – Transferir uma porção do crescimento de Serratia sp crescida em tubo de agar inclinado para meio líquido de caldo simples. Incubar os tubos no escuro por, no mínimo 48 horas.

9. 3ª: Verificar a presença de micro-organismos no ambiente: 1 – Verter o meio de agar simples fundido em placa e esperar solodificar . 2 – Expor uma das placas durante 15 minutos ao ar . 3 – Com uma 2ª placa , realizar uma das seguintes opções: 1) Friccionar um swab na bancada e em seguida espqlhar o mesmo na superfície do agar; 2) Friccionar alguns fios de cabelo sobre o agar; 3) Tocar suavemente a superfície dos dedos na superfície do agar; 4) Soprar, tossir ou esperrar sobre a superfície do agar. Incubar as placas a temperatura ambiente por cerca de uma semana.

10. Interpretação dos resultados 2ª: Manobras assépticas a) Leitura dos tubos de caldo simples estéreis, submetidos a transferência em condições assépticas: a observação de turvação no meio de cultura indica a presença de crescimento bacteriano, e portanto, manobra asséptica inadequada.

11. Interpretação dos resultados b) Leitura dos tubos de agar simples inclinado, inoculado com Serratia sp: a presença de crescimento vermelho-alaranjado indica Serratia sp; a presença de outro tipo de crescimento que não apresente a referida cor indica contaminação, e portanto, manobra asséptica inadequada.

12. c) Leitura dos tubos de caldo simples inoculados com Serratia sp: a observação de turvação no meio de cultura indica crescimento da Serratia sp, mas não permite verificar se houve ou não contaminação Interpretação dos resultados

13. 3ª: Presença de micro-organismos no ambiente Observar a presença de diferentes colônias na superfície das placas; observar os diferentes tipos de bactérias e fungos; preparar lâminas e observa-las ao microscópia. Distinguir os diferentes tipos microbianos. Interpretação dos resultados

14. Morfologia Colonial Pigmentação Interpretação dos resultados

15. Métodos Físicos e Agentes Químicos no Controle do Crescimento Microbiano: Esterilização, Desinfecção e Antissepsia O crescimento dos micro-organismo pode ser controlado através de métodos físicos e químicos. Eliminação total ou parcial

16. Esterilização – Eliminação total dos micro-organismos presentes em determinado material ou ambiente. Desinfecção – Inativação ou redução do número de micro-organismos presentes em material inanimado. A desinfecção não implica na eliminação de todos os micro-organismos viáveis, porém elimina a potencialidade infecciosa do objeto, superfícies ou local de trabalho. Assim, a desinfecção tem como objetivo eliminar os micro-organismos. Antissepsia – Consiste no mesmo conceito de desinfecção, porém está relacionado com substâncias (antissépticos) aplicados em tecido vivo.

17. I – Métodos Físicos de Controle do Crescimento de Micro-organismos

18. Calor 1 – Calor úmido Autoclave – utiliza o calor na forma de vapor d’água sob pressão. Destrói formas vegetativas e esporuladas (121ºC/15-30minutos). Usados para meios de cultivo, vidrarias, etc. Água em ebulição – utiliza o calor na forma de vapor d’água livre. Destrói apenas formas vegetativas (100ºC/20minutos

19. Tindalização – utiliza o calor na forma de vapor d’água livre. Visa destruir formas vegetativas e esporuladas. É também denominado esterilização fracionada ou intermitente (100ºC/20min. Durante 3 dias consecutivos). Usado no preparo de alguns medicamento, vacinas, etc. Pasteurização – Reduz as populações microbianas sem destruir necessariamente todas as formas vegetativas. Muito utilizado nas indústrias de alimentos (leite, cremes, cerveja, etc). Dois tipos: - Alta temperatura – usa um tempo curto (15 seg.) a 72ºC - Baixa temperatura – usa um tempo mais longo (30 seg) a 63ºC

20. 2 – Calor Seco Fornos ou estufas – utiliza o calor seco a 180ºC durante 1 ou 2 horas. Muito usado para vidrarias e para materiais danificáveis pela umidade como os metais ou óleos. Flambagem – esteriliza agulhas e alças microbiológicas: aquecimento ao rubro

21. Incineração – para eliminar animais de laboratório

22. Radiações Ultravioleta – o comprimento de onda mais efetivo para efeitos germicidas é entre 2600-2700A. Muito usado para salas cirúrgicas. O poder de penetração é muito baixo. Atua no DNA formando dímeros de timina. Raios  - empregado para materiais descartáveis e material cirúrgico termolábil. Método caro e perigoso. Uso industrial.

23. Filtração Filtros bacteriológicos – empregados para esterilizar materiais termolábeis como soro, enzimas, etc. São filtros de materiais diversos como ésteres (acetato ou nitrato) de celulose e amianto

24. Prática 2 Objetivos: Conceituar os diferentes métodos de esterilização; Comparar os diferentes métodos físicos de esterilização; Listar alguns métodos de esterilização pelo calor; Relacionar as finalidades da desinfecção e antissepsia; Fazer apreciação dos diferentes agentes antissépticos; Testar a eficácia da ação do calor e de agentes químicos sobre o crescimento microbiano

25. Execução 1ª - Teste da ação do calor sobre as bactérias: será verificada a ação de dois métodos diferentes de controle dos micro-organismos que empregam o calor úmido, autoclave e água em ebulição Adicionar 1 a 2 gotas de cultura pura de bactérias ( Bacillus subtilis ou Escherichia coli ) a tubos contendo caldo simples e submetê-los aos seguintes tratamentos: Tubo 1: controle, sem tratamento Tubo 2: ferver 5 minutos em banho maria Tubo 3: ferver 20 minutos em banho maria Tubo 4: submeter à autoclavação durante 15 minutos.

26. Interpretação dos Resultados: 1ª - Ação do calor sobre bactérias. Observar os 4 tubos semeados na aula anterior. A turvação do meio de cultura, ou a presença de uma película na superfície do meio, indica a presença do crescimento bacteriano. Avaliar a eficiência dos tratamentos comparando o crescimento em relação ao tubo 1 (controle). Comparar os resultados obtidos com cada uma das duas espécies bacterianas: B. Subtilis e E. coli . As culturas de B. Sutilis , por serem esporuladas , são muito mais resistentes e só são destruídas por autoclavação. Já as formas vegetativas de ambas as culturas são destruídas em banho-maria.

27. Escherichia coli X Bacillus calor

28. II – Metodos Químicos de Controle de Crescimento Microbiano Antisséptico – usado em tecidos vivos para inibição do crescimento (álcool iodado) Desinfetante – inibe o crescimento de microorganismos (formas vegetativas) em material inanimado (fenol, etanol) Antimicrobianos – utilizado para o tratamento de doenças infecciosas (Penicilinas, cloranfenicol) Toxidade seletiva – atuação sobre microrganismos sem afetar celulas hospedeiras

29. Fenóis e derivados (fenol, cresol) - desnaturação de proteínas Álcoois (metílico, etílico, propílico) - solvente para lipídios - desnatura e coagula proteínas Compostos de cloro (hipoclorito de sódio, cloramina, cloro) - se combina com proteínas - agente ocidante Tintura de iodo, água sanitária, permanganato de potássio - agentes oxidantes Detergentes (lauril sulfato de sódio) - rompe membrana celular - altera permeabilidade celular - diminui tensão superficial Corantes (cristal violeta) - tem afinidade por ácidos nucleicos Óxido de etileno (gás esterilizante) - agente alquilante - ativo contra formas vegetativas e esporulados. Usado na preservação de alimento, esterilização de material plástico, equipamentos médicos etc. Desnatura proteínas e danifica DNA e RNA (ação mutagênica) Agentes Mecanismo de ação

30. 2ª - Teste da eficácia da ação de agentes químicos ( antissépticos ) sobre os micro-organismos. Será demonstrada a ação do álcool, álcool iodado, detergentes, água sanitária, etc . Sobre o crescimento de Serratia sp (técnica do polegar) 1 – Em placa de petri contendo meio de cultura, delimitar 3 regiões , utilizando lápis cera. Marcar as regiões 1, 2 e 3; 2 – Sobre a superfície do meio, comprimir ligeiramente o polegar na região 1, tomando cuidado para não ferir o agar; 3 – Umidece o polegar no papel de filtro embebido com cultura de Serratia e comprimi-lo ligeiramente na região 2; 4 – Lavar o polegar utilizando qualquer um dos agentes antissepticos a sua escolha ( alcool, alcool iodado, detergente ou água santária); 5 – Secar o polegar ao ar e novamente comprimi-lo ligeiramente na região 3; 6 – Anotar o composto utilizado. Identificar a placa. Embrulhar com papel e incubar a temperatura ambiante (25-28ºC) por 24/72h; Prática 2

31. Interpretação dos Resultados: 2ª - Teste da ação dos agente antissépticos. Observar a placa da aula anterior, e verificar o crescimento bacteriano nas quatro regiões. Comparar a eficiência dos diferentes antiossépticos usados pelos colegas.

32. Assunto 3: Exame Microscópio de Micro-organismos

33. 0,2 mm 300 nm a 1  m Bactérias e Arqueas Fungos Protozoários Algas 10  m a 100  m Pox vius Herpes vius 27 nm a 300nm

34. Bactérias e Arqueas Fungos Protozoários Algas

35. Microscopia óptica, corada pelo método de Gram, de cocos em um arranjo denominado estafilococos. Microscopia eletrônica de varredura das células apresentadas acima.

36. Varredura Transmissão Varredura Transmissão Pox vius Herpes vius

37. Principais tipos de preparações microscópicas para visualizar micro-organismos

38. Tipos de coloração utilizadas em microscopia óptica Colorações SIMPLES Positiva Negativa DIFERENCIAL SEPARAÇÃO DE GRUPOS Coloração de Gram Coloração de Ziehl-Neelsen – Alcool-ácido resistente VISUALIZAÇÃO DE ESTRUTURAS Esporos Cápsulas Flagelo

39. POSITIVA – corantes carregados positivamente (núcleo superfície) Ex: Giemsa NEGATIVA – corante acídico (lâmina) Ex: Nanquim T. cruzi Plasmodium falciparum C. neoformans COLORAÇÃO SIMPLES Uso de apenas 1 corantes

40. Coloração de Ziehl-Neelsen Dificulta a penetração de vários corantes – grande hidrofobicidade COLORAÇÃO DIFERENCIADA Uso de apenas 2 corante

41. Solução àlcool-ácido (etanol 95% + HCL concentrado) 5 min, aquecendo Água destilada Carbolfucsina Até o líquisdo que pararmde sair colorido Água destilada Azul de Metileno Água destilada 2 min Papel de filtro e micorscópio óptico Coloração de Ziehl-Neelsen

42. COLORAÇÃO DIFERENCIADA Uso de apenas 2 corantes Lugol (mordente – forma complexo insolúvel com o corante primário-iodo para-rosalina) 1 min Água destilada Cristal Violeta (cora o citoplasma de púrpura, independentemente do tipo de célula) 1 min Água destilada Etanol a 95% (álcool-acetona ou ambos: solvente lipídico Água destilada Safranina (cora o citoplasma de vermelho) 45 seg Água destilada Papel de filtro e micorscópio óptico Coloração de Gram

44. Gram + Gram -

45. Formas e Arranjos (eubactérias)

48. Prática 3 Objetivos: Manusear adequadamente um microscópio ótico; Conhecer os principais métodos de observação microscópica de micro-organismos; Distinguir,morfologicamente, bactérias, leveduras, bolores e protozoários; Identificar os principais tipos morfológicos das bactérias; Discutir a importância do método de Gram na identificação de micro-organismos;

49. Execução: 1ª - Observação microscópica de lâminas prontas a) Esporos de Bacillus megaterium (cultura com mais de 48 horas de crescimento), coradas pelo método de Schaeffer fulton (célula corada de vermelho (safranina) e esporos corados de verde (verde malaquita) b) Bactérias coradas pelo Gram: B. subtilis , S. aureus (Gram positiva e E. coli (Gram negativa)

50. 2ª- Preparação de lâminas para observações microscópicas 1) Preparação a fresco de E. coli . Após flambar a alça, colocar uma gota de suspensão bacteriana em uma lâmina, cobrir com lamínula. Adicionar uma pequena gota de óleo de cedro e observar com objetiva de imersão (100x) 2) Preparação a fresco de Sccharomyces cerevisiae . Retirar, com uma alça flambada, uma porção do crescimento da levedura e suspender em uma gota de solução salina em uma lâmina. Cobrir com lamínula e observar com objetiva de 40x.

51. 3) Preparação a fresco de Aspergillus versicolor . Cuidadosamente, para não alterar as estruturas fúngicas, retirar com alça flambada uma porção do crescimento do fungo e suspender em uma gota de solução salina, em uma lâmina. Observar entre lâmina e lamínula com objetiva de 40x. 4) Preparação a fresco de Herpetomonas sp. Retirar, com uma alça flambada, uma porção do crescimento em meio líquido do protozoário e colocar sobre uma lâmina. Cobrir cuidadosamente com uma lamínula. Observar com objetiva de 40x.

52. 5) Coloração de Gram Colocar uma gota de salina sobre a lâmina. Com alça flambada retirar uma pequena porção da cultura e colocar na gota de salina, espalhar obtendo um esfregaço. Deixar secar. Fixar o esfregaço na lâmina, presa ao pregador, passando-a na chama do bico de Bunsen Lugol (mordente – forma complexo insolúvel com o corante primário-iodo para-rosalina) 1 min Água destilada Cristal Violeta (cora o citoplasma de púrpura, independentemente do tipo de célula) 1 min Água destilada Etanol a 95% (álcool-acetona ou ambos: solvente lipídico Água destilada Safranina (cora o citoplasma de vermelho) 45 seg Água destilada Papel de filtro e micorscópio óptico

53. 3ª- A partir das placas expostas (ar, bancada, dedo, boca, etc) observar diversos tipos de colônias crescidas. Com o auxílio do professor escolher uma colônia de bactéria e outra de fungo, para estudo. Colônia de bactéria: Realizar coloração de Gram. Colônia de fungo: Preparar lâmina a fresco com solução salina.

54. Interpretação dos Resultados (Leitura) 1ª – Observação de lâminas prontas: 1) Observação de lâminas de Bacillus megaterium . Distinguir os esporos, corados em verde das células vegetativas, coradas em vermelho. Observar esporos dentro e fora da célula. 2) Observação de lâminas de bactérias coradas ao Gram. Distinguir o tamanho, a forma (coco ou bacilo) e a reação ao Gram, roxas, Gram (+) ou vermelhas, Gram (-). Observar algum arranjo característico.

55. Interpretação dos Resultados (Leitura) 2ª – Observação de lâminas preparadas pelo aluno: 1) Observar, na preparação a fresco de E. coli , seu tamanho relativo, sua forma e sua locomoção. 2) Observar S. cerevisiae quanto a forma, tamanho relativo e a presença ou ausência de brotamento. 3) Observar A. versicolor quanto ao tamanho. Identificar o micélio, hifas septadas ou não, e se possível as estruturas que contêm os esporos. 4) Observar Herpetomonas sp quanto ao tamanho e capacidade de locomoção. 5) Observar as lâminas coradas pelo Gram, como em 2), 1 parte.

56. Interpretação dos Resultados (Leitura) 3ª – Observação de colônias desconhecidas de micro-organismos do ambiente: - Observar ao microscópio as lâminas preparadas pelo próprio aluno. De acordo com as características observadas tais como tamanho, forma, Gram, presença de hifas, etc. Confirmar tratar-se de bactéria, levedura ou fungo.

57. Assunto 4: Técnicas de Isolamento e Contagem de Micro-organismos: Obtenção de Cultura Pura

58. Meios de Cultura: Destinam-se ao cultivo artificial dos micro-organismos e portanto devem fornecer os nutrientes indispensáveis ao seu crescimento. Normalmente contém uma fonte de C, N e sais minerais, além de fatores de crescimento, para o caso de micro-organismos exigentes. Meio de enriquecimento: Adequado ao crescimento de micro-organismos heterotrófico mais exigentes em termos nutritivos, tais como os patogênicos. Costuma-se adicionar sangue, soro, extrato de plantas ou animais. Ex.: B.H.I (Brain Heart Infusion), para protozoários. Meio Seletivo: Adequado ao isolamento de um grupo particular de micro-organismos, através da adição de substâncias químicas que vão inibir certos grupos sem afetar outros, ou, ao contrário, facilitar certos grupos e não outros. Ex.: adição de antibióticos, de fonte de C específicas, como a celulose para celulolíticos

59. Meio diferencial: Através da adição de certos reagentes ao meio, após inoculação e incubação, poder-se-á observar uma modificação que permita diferenciar tipos de bactérias. Ex.: meio BEM para diferenciar E. coli , meio de agareur manitol sal para diferenciar Staphylococcus aureus, meio de Teaguer, que diferencia bactérias lactose positivas (escuras) das lactose negativa (claras). EMB – E. coli – verde metálico Agar manitol sal – S. aureus – amarelo ouro MacConkey – Lactose+ - rosa

60. Obtenção de culturas puras Isolamento: técnica de semeadura por esgotamento, e diluições em placas com meio sólido. Esgotamento: Consiste em espalhar, com auxílio de alça de inoculação, suspensão de micro-organismos na superfície do meio de cultivo sólido, em três setores distintos, de modo que a quantidade de material contida na alça seja progressivamente menor. Passos para o sucesso do esgotamento: a) realizar o maior número de estrias possíveis; b) não perfurar o meio; c) não voltar com a alça sobre as estrias; d) utilizar pequena quantidade de material para semear

61. Esgotamento

63. Técnica de Diluição para obtenção de cultura pura e contagem de colônias

64. Prática 4 Objetivos: Mostrar ao aluno os métodos de obtenção de cultura pura; Treinar o aluno na execução da técnica de esgotamento;

65. Execução: 1ª - Técnica do esgotamento para o isolamento de bactérias (obtenção de cultura em meio sólido) a) Utilizar a suspensão mista de bactérias (Serratia sp + Micococcus sp) a ser distribuída pelo professor; b) Flambar a alça e retirar com ela uma pequena gota da suspensão mista de bactérias; semeá-las sobre a superfície de um meio (agar simples) em placas. A semeadura deve ser feita por estrias, de acordo com o esquema, na seguinte sequência. 1ª operação: colocar a gota na superfície do meio e passar a alça em zig-zag sem tocar no meio já semeado, cobrindo outro 1/3 da placa; 2ª operação: mudar a direção do estriamento para a 2ª região da placa, com o mesmo cuidade da região 1, cobrindo outro 1/3 da placa 3ª operação: mudar a direção da estriamento para a parte final do meio, sem tocar na superfície já semeada. c) Embrulhar as placas e incubar na estufa a 37°C por 24 horas.

67. Interpretação dos resultados Observar o aparecimento de colônias isoladas nas placas de agar simples semeadas. Notar o aparecimento de dois tipos deferentes de colônias. Observar, cor, forma, tamanho, borda, etc. Retirar com agulha flambada, uma porção de uma colônia escolhida e transferir assepticamente para o tubo de agar simples inclinado, fazendo estrias na superfície do agar. Anotar o nome do aluno e incubar a 37°C por 24 horas. Após este tempo, observar a cultura crescida no tubo de agar inclinado, verificando sua pureza através do aspecto homogêneo. Confirmar a pureza realizando Gram e observar a mesma forma e reação ao Gram de todas as células observadas.