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Material e Técnicas Básicas Utilizadas no Laboratório de Microbiologia
Normas de segurança ,[object Object],[object Object],[object Object],[object Object],[object Object],[object Object]
Normas de segurança ,[object Object],[object Object],[object Object],[object Object]
Cultura pura Crescimento, em meio de cultivo adequado, de um conjunto de células idênticas, correspondentes a mesma espécie
Esterilização –  eliminação de  toda e qualquer forma  de vida presente em determinado material ou ambiente. Assepsia –  uso de manobras assépticas, que são técnicas que  impedem a entrada de micro-organismos  onde não são desejados.
 
Prática 1 ,[object Object],[object Object],[object Object],[object Object],[object Object],[object Object]
Execução 1ª:  Apresentação do material de laboratório: mostrar a vidraria principal (tubos, pipetas Pasteur, placas, etc) 2ª: Treinar manobras assépticas: 1 – Distribuição,  de um tubo para o outro , caldo simples estéril, usando  pipeta  (2,0ml). Repetir quando a técnica não se mostrar adequada. 2 –  Transferir  uma porção do crescimento de  Serratia  sp crescida em tubo de  agar inclinado  contendo meio de agar simples, para outro meio idêntico, com auxílio de  alça de inoculação . 3 –  Transferir  uma porção do crescimento de  Serratia  sp crescida em tubo de  agar inclinado  para  meio líquido  de caldo simples. Incubar os tubos no escuro por, no mínimo 48 horas.
3ª: Verificar a presença de micro-organismos no ambiente: 1 –  Verter o meio  de agar simples fundido  em placa e esperar solodificar . 2 –  Expor  uma das placas durante  15 minutos ao ar . 3 – Com uma  2ª placa , realizar uma das seguintes opções: 1) Friccionar um swab na bancada e em seguida espqlhar o mesmo  na superfície do agar; 2) Friccionar alguns fios de cabelo sobre o agar; 3) Tocar suavemente a superfície dos dedos na superfície do  agar; 4) Soprar, tossir ou esperrar sobre a superfície do agar.  Incubar as placas a temperatura ambiente por cerca de uma  semana.
Interpretação dos resultados 2ª: Manobras assépticas a) Leitura dos tubos de caldo simples estéreis, submetidos a transferência em condições assépticas: a observação de turvação no meio de cultura indica a presença de crescimento bacteriano, e portanto, manobra asséptica inadequada.
Interpretação dos resultados b) Leitura dos tubos de agar simples inclinado, inoculado com  Serratia  sp: a presença de crescimento vermelho-alaranjado indica  Serratia  sp; a presença de outro tipo de crescimento que não apresente a referida cor indica contaminação, e portanto, manobra asséptica inadequada.
c) Leitura dos tubos de caldo simples inoculados com  Serratia  sp: a observação de turvação no meio de cultura indica crescimento da  Serratia  sp, mas não permite verificar se houve ou não contaminação Interpretação dos resultados
3ª: Presença de micro-organismos no ambiente Observar a presença de diferentes colônias na superfície das placas; observar os diferentes tipos de bactérias e fungos; preparar lâminas e observa-las ao microscópia. Distinguir os diferentes tipos microbianos. Interpretação dos resultados
Morfologia Colonial ,[object Object],Interpretação dos resultados
Métodos Físicos e Agentes Químicos no Controle do Crescimento Microbiano: Esterilização, Desinfecção e Antissepsia O crescimento dos micro-organismo pode ser controlado através de métodos físicos e químicos.  Eliminação total ou parcial
Esterilização –  Eliminação total dos micro-organismos presentes em determinado material ou ambiente. Desinfecção –  Inativação ou redução do número de micro-organismos presentes em material inanimado. A desinfecção não implica na eliminação de todos os micro-organismos viáveis, porém elimina a potencialidade infecciosa do objeto, superfícies ou local de trabalho. Assim, a desinfecção tem como objetivo eliminar os micro-organismos. Antissepsia –  Consiste no mesmo conceito de desinfecção, porém está relacionado com substâncias (antissépticos) aplicados em tecido vivo.
I – Métodos Físicos de Controle do Crescimento de Micro-organismos
Calor 1 – Calor úmido Autoclave –  utiliza o calor na forma de vapor d’água sob pressão. Destrói formas vegetativas e esporuladas (121ºC/15-30minutos). Usados para meios de cultivo, vidrarias, etc.  Água em ebulição  – utiliza o calor na forma de vapor d’água livre. Destrói apenas formas vegetativas (100ºC/20minutos
Tindalização  – utiliza o calor na forma de vapor d’água livre. Visa destruir formas vegetativas e esporuladas. É também denominado esterilização fracionada ou intermitente (100ºC/20min. Durante 3 dias consecutivos). Usado no preparo de alguns medicamento, vacinas, etc. Pasteurização  – Reduz as populações microbianas sem destruir necessariamente todas as formas vegetativas. Muito utilizado nas indústrias de alimentos (leite, cremes, cerveja, etc). Dois tipos:  - Alta temperatura – usa um tempo curto (15 seg.) a 72ºC - Baixa temperatura – usa um tempo mais longo (30 seg) a 63ºC
2 – Calor Seco Fornos ou estufas  – utiliza o calor seco a 180ºC durante 1 ou 2 horas. Muito usado para vidrarias e para materiais danificáveis pela umidade como os metais ou óleos. Flambagem  – esteriliza agulhas e alças microbiológicas: aquecimento ao rubro                                                
Incineração  – para eliminar animais de laboratório
Radiações Ultravioleta  – o comprimento de onda mais efetivo para efeitos germicidas é entre 2600-2700A. Muito usado para salas cirúrgicas. O poder de penetração é muito baixo. Atua no DNA formando dímeros de timina. Raios    - empregado para materiais descartáveis e material cirúrgico termolábil. Método caro e perigoso. Uso industrial.
Filtração Filtros bacteriológicos  – empregados para esterilizar materiais termolábeis como soro, enzimas, etc. São filtros de materiais diversos como ésteres (acetato ou nitrato) de celulose e amianto
Prática 2 ,[object Object],[object Object],[object Object],[object Object],[object Object],[object Object],[object Object]
Execução ,[object Object],[object Object],[object Object],[object Object],[object Object],[object Object]
Interpretação dos Resultados: 1ª -   Ação do calor  sobre bactérias. Observar os 4 tubos semeados na aula anterior. A  turvação  do meio de cultura, ou a presença de uma  película  na superfície do meio, indica a  presença do crescimento  bacteriano.  Avaliar a  eficiência dos tratamentos  comparando o crescimento em relação ao tubo 1 (controle). Comparar  os resultados obtidos com cada uma das duas espécies bacterianas:  B. Subtilis  e  E. coli . As culturas de  B. Sutilis , por serem  esporuladas , são muito  mais resistentes  e só são destruídas por autoclavação. Já as formas vegetativas de ambas as culturas são destruídas em banho-maria.
Escherichia coli  X  Bacillus calor
II – Metodos Químicos de Controle de Crescimento Microbiano ,[object Object],[object Object],[object Object],Toxidade seletiva – atuação sobre microrganismos sem afetar celulas hospedeiras
Fenóis e derivados (fenol, cresol) - desnaturação de proteínas Álcoois (metílico, etílico, propílico) - solvente para lipídios - desnatura e coagula proteínas Compostos de cloro (hipoclorito de sódio, cloramina, cloro) - se combina com proteínas - agente ocidante Tintura de iodo, água sanitária, permanganato de potássio - agentes oxidantes Detergentes (lauril sulfato de sódio) - rompe membrana celular - altera permeabilidade celular - diminui tensão superficial Corantes (cristal violeta) - tem afinidade por ácidos nucleicos Óxido de etileno (gás esterilizante) - agente alquilante - ativo contra formas vegetativas e esporulados. Usado na preservação de alimento, esterilização de material plástico, equipamentos médicos etc. Desnatura proteínas e danifica DNA e RNA (ação mutagênica) Agentes Mecanismo de ação
2ª -  Teste da  eficácia  da ação de agentes químicos ( antissépticos ) sobre os micro-organismos. Será demonstrada a  ação do álcool, álcool iodado, detergentes, água sanitária, etc . Sobre o crescimento de  Serratia  sp (técnica do polegar) 1 – Em placa de petri contendo meio de cultura,  delimitar 3 regiões , utilizando lápis cera. Marcar as regiões 1, 2 e 3; 2 – Sobre a superfície do meio,  comprimir ligeiramente o polegar  na região 1, tomando cuidado para não ferir o agar; 3 –  Umidece o polegar no papel de filtro  embebido com cultura de  Serratia  e comprimi-lo ligeiramente na região 2; 4 –  Lavar o polegar  utilizando qualquer um dos agentes  antissepticos  a sua escolha ( alcool, alcool iodado, detergente ou água santária); 5 –  Secar o polegar  ao ar e novamente comprimi-lo ligeiramente na região 3; 6 – Anotar o composto utilizado. Identificar a placa. Embrulhar com papel e incubar a temperatura ambiante (25-28ºC) por 24/72h; Prática 2
Interpretação dos Resultados: 2ª -  Teste da ação dos agente antissépticos. Observar a placa da aula anterior, e verificar o crescimento bacteriano nas quatro regiões. Comparar a eficiência dos diferentes antiossépticos usados pelos colegas.
Assunto 3: Exame Microscópio de Micro-organismos
0,2 mm 300 nm a 1   m Bactérias e Arqueas Fungos Protozoários Algas 10   m a 100   m  Pox vius Herpes vius 27 nm a 300nm
Bactérias e Arqueas Fungos Protozoários Algas
Microscopia óptica, corada pelo método de Gram, de cocos em um arranjo denominado estafilococos. Microscopia eletrônica de varredura das células apresentadas acima.
Varredura Transmissão Varredura Transmissão Pox vius Herpes vius
Principais tipos de preparações microscópicas para visualizar micro-organismos
Tipos de coloração utilizadas em microscopia óptica Colorações SIMPLES Positiva Negativa DIFERENCIAL SEPARAÇÃO DE GRUPOS Coloração de Gram Coloração de Ziehl-Neelsen – Alcool-ácido resistente VISUALIZAÇÃO DE ESTRUTURAS Esporos Cápsulas Flagelo
POSITIVA –  corantes carregados positivamente (núcleo superfície) Ex: Giemsa NEGATIVA –  corante acídico (lâmina) Ex: Nanquim T. cruzi Plasmodium  falciparum C. neoformans COLORAÇÃO SIMPLES  Uso de apenas 1 corantes
Coloração de Ziehl-Neelsen Dificulta a penetração de vários corantes – grande hidrofobicidade COLORAÇÃO DIFERENCIADA Uso de apenas 2 corante
Solução àlcool-ácido (etanol 95% + HCL concentrado) 5 min, aquecendo Água destilada Carbolfucsina Até o líquisdo que pararmde sair colorido Água destilada Azul de Metileno Água destilada 2 min Papel de filtro e micorscópio óptico Coloração de Ziehl-Neelsen
COLORAÇÃO DIFERENCIADA Uso de apenas 2 corantes Lugol (mordente – forma complexo insolúvel com o corante primário-iodo para-rosalina) 1 min Água destilada Cristal Violeta (cora o citoplasma de púrpura, independentemente do tipo de célula)  1 min Água destilada Etanol a 95%  (álcool-acetona ou ambos: solvente lipídico  Água destilada Safranina  (cora o citoplasma de vermelho)   45 seg Água destilada Papel de filtro e micorscópio óptico Coloração de Gram
 
Gram + Gram -
Formas e  Arranjos (eubactérias)
 
 
Prática 3 ,[object Object],[object Object],[object Object],[object Object],[object Object],[object Object]
Execução: 1ª - Observação microscópica de lâminas prontas a) Esporos de  Bacillus megaterium  (cultura com mais de 48 horas de crescimento), coradas pelo método de Schaeffer fulton (célula corada de vermelho (safranina) e esporos corados de verde (verde malaquita) b) Bactérias coradas pelo Gram:  B. subtilis ,  S. aureus  (Gram positiva e  E. coli  (Gram negativa)
2ª- Preparação de lâminas para observações microscópicas  1) Preparação a fresco de  E. coli . Após flambar a alça, colocar uma gota de suspensão bacteriana em uma lâmina, cobrir com lamínula. Adicionar uma pequena gota de óleo de cedro e observar com objetiva de imersão (100x) 2) Preparação a fresco de  Sccharomyces cerevisiae . Retirar, com uma alça flambada, uma porção do crescimento da levedura e suspender em uma gota de solução salina em uma lâmina. Cobrir com lamínula e observar com objetiva de 40x.
3) Preparação a fresco de  Aspergillus versicolor . Cuidadosamente, para não alterar as estruturas fúngicas, retirar com alça flambada uma porção do crescimento do fungo e suspender em uma gota de solução salina, em uma lâmina. Observar entre lâmina e lamínula com objetiva de 40x. 4) Preparação a fresco de  Herpetomonas  sp. Retirar, com uma alça flambada, uma porção do crescimento em meio líquido do protozoário e colocar sobre uma lâmina. Cobrir cuidadosamente com uma lamínula. Observar com objetiva de 40x.
5) Coloração de Gram ,[object Object],[object Object],Lugol (mordente – forma complexo insolúvel com o corante primário-iodo para-rosalina) 1 min Água destilada Cristal Violeta (cora o citoplasma de púrpura, independentemente do tipo de célula)  1 min Água destilada Etanol a 95%  (álcool-acetona ou ambos: solvente lipídico  Água destilada Safranina  (cora o citoplasma de vermelho)   45 seg Água destilada Papel de filtro e micorscópio óptico
[object Object],[object Object],[object Object]
Interpretação dos Resultados (Leitura) 1ª – Observação de lâminas prontas: 1) Observação de lâminas de  Bacillus megaterium . Distinguir os esporos, corados em verde das células vegetativas, coradas em vermelho. Observar esporos dentro e fora da célula. 2) Observação de lâminas de bactérias coradas ao Gram. Distinguir o tamanho, a forma (coco ou bacilo) e a reação ao Gram, roxas, Gram (+) ou vermelhas, Gram (-). Observar algum arranjo característico.
Interpretação dos Resultados (Leitura) 2ª – Observação de lâminas preparadas pelo aluno: 1) Observar, na preparação a fresco de  E. coli , seu tamanho relativo, sua forma e sua locomoção. 2) Observar  S. cerevisiae  quanto a forma, tamanho relativo e a presença ou ausência de brotamento. 3) Observar A. versicolor quanto ao tamanho. Identificar o micélio, hifas septadas ou não, e se possível as estruturas que contêm os esporos. 4) Observar  Herpetomonas  sp quanto ao tamanho e capacidade de locomoção. 5) Observar as lâminas coradas pelo Gram, como em 2), 1 parte.
Interpretação dos Resultados (Leitura) 3ª – Observação de colônias desconhecidas de micro-organismos do ambiente: - Observar ao microscópio as lâminas preparadas pelo próprio aluno. De acordo com as características observadas tais como tamanho, forma, Gram, presença de hifas, etc. Confirmar tratar-se de bactéria, levedura ou fungo.
Assunto 4: Técnicas de Isolamento e Contagem de Micro-organismos: Obtenção de Cultura Pura
Meios de Cultura:  Destinam-se ao cultivo artificial dos micro-organismos e portanto devem fornecer os nutrientes indispensáveis ao seu crescimento. Normalmente contém uma fonte de C, N e sais minerais, além de fatores de crescimento, para o caso de micro-organismos exigentes. Meio de enriquecimento:  Adequado ao crescimento de micro-organismos heterotrófico mais exigentes em termos nutritivos, tais como os patogênicos. Costuma-se adicionar sangue, soro, extrato de plantas ou animais. Ex.: B.H.I (Brain Heart Infusion), para protozoários. Meio Seletivo:  Adequado ao isolamento de um grupo particular de micro-organismos, através da adição de substâncias químicas que vão inibir certos grupos sem afetar outros, ou, ao contrário, facilitar certos grupos e não outros. Ex.: adição de antibióticos, de fonte de C específicas, como a celulose para celulolíticos
Meio diferencial:  Através da adição de certos reagentes ao meio, após inoculação e incubação, poder-se-á observar uma modificação que permita diferenciar tipos de bactérias. Ex.: meio BEM para diferenciar  E. coli , meio de agareur manitol sal para diferenciar Staphylococcus aureus, meio de Teaguer, que diferencia bactérias lactose positivas (escuras) das lactose negativa (claras). EMB – E. coli – verde metálico Agar manitol sal –  S. aureus  – amarelo ouro MacConkey – Lactose+ - rosa
[object Object],[object Object],[object Object],[object Object],[object Object],[object Object],[object Object],[object Object],[object Object],[object Object]
Esgotamento
 
Técnica de Diluição para obtenção de cultura pura e contagem de colônias
Prática 4 ,[object Object],[object Object],[object Object]
Execução:  1ª -  Técnica do esgotamento para o isolamento de bactérias (obtenção de cultura em meio sólido) a) Utilizar a suspensão mista de bactérias (Serratia sp +  Micococcus  sp) a ser distribuída pelo professor; b) Flambar a alça e retirar com ela uma pequena gota da suspensão mista de bactérias; semeá-las sobre a superfície de um meio (agar simples) em placas. A semeadura deve ser feita por estrias, de acordo com o esquema, na seguinte sequência. 1ª operação: colocar a gota na superfície do meio e passar a alça em zig-zag sem tocar no meio já semeado, cobrindo outro 1/3 da placa; 2ª operação: mudar a direção do estriamento para a 2ª região da placa, com o mesmo cuidade da região 1, cobrindo outro 1/3 da placa 3ª operação: mudar a direção da estriamento para a parte final do meio, sem tocar na superfície já semeada. c) Embrulhar as placas e incubar na estufa a 37°C por 24 horas.
 
Interpretação dos resultados ,[object Object],[object Object],[object Object]
 

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File1 integracao de metabolismo
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File1 5 degradacao aa - balanço n
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Aulas práticas microbiologia

  • 1. Material e Técnicas Básicas Utilizadas no Laboratório de Microbiologia
  • 2.
  • 3.
  • 4. Cultura pura Crescimento, em meio de cultivo adequado, de um conjunto de células idênticas, correspondentes a mesma espécie
  • 5. Esterilização – eliminação de toda e qualquer forma de vida presente em determinado material ou ambiente. Assepsia – uso de manobras assépticas, que são técnicas que impedem a entrada de micro-organismos onde não são desejados.
  • 6.  
  • 7.
  • 8. Execução 1ª: Apresentação do material de laboratório: mostrar a vidraria principal (tubos, pipetas Pasteur, placas, etc) 2ª: Treinar manobras assépticas: 1 – Distribuição, de um tubo para o outro , caldo simples estéril, usando pipeta (2,0ml). Repetir quando a técnica não se mostrar adequada. 2 – Transferir uma porção do crescimento de Serratia sp crescida em tubo de agar inclinado contendo meio de agar simples, para outro meio idêntico, com auxílio de alça de inoculação . 3 – Transferir uma porção do crescimento de Serratia sp crescida em tubo de agar inclinado para meio líquido de caldo simples. Incubar os tubos no escuro por, no mínimo 48 horas.
  • 9. 3ª: Verificar a presença de micro-organismos no ambiente: 1 – Verter o meio de agar simples fundido em placa e esperar solodificar . 2 – Expor uma das placas durante 15 minutos ao ar . 3 – Com uma 2ª placa , realizar uma das seguintes opções: 1) Friccionar um swab na bancada e em seguida espqlhar o mesmo na superfície do agar; 2) Friccionar alguns fios de cabelo sobre o agar; 3) Tocar suavemente a superfície dos dedos na superfície do agar; 4) Soprar, tossir ou esperrar sobre a superfície do agar. Incubar as placas a temperatura ambiente por cerca de uma semana.
  • 10. Interpretação dos resultados 2ª: Manobras assépticas a) Leitura dos tubos de caldo simples estéreis, submetidos a transferência em condições assépticas: a observação de turvação no meio de cultura indica a presença de crescimento bacteriano, e portanto, manobra asséptica inadequada.
  • 11. Interpretação dos resultados b) Leitura dos tubos de agar simples inclinado, inoculado com Serratia sp: a presença de crescimento vermelho-alaranjado indica Serratia sp; a presença de outro tipo de crescimento que não apresente a referida cor indica contaminação, e portanto, manobra asséptica inadequada.
  • 12. c) Leitura dos tubos de caldo simples inoculados com Serratia sp: a observação de turvação no meio de cultura indica crescimento da Serratia sp, mas não permite verificar se houve ou não contaminação Interpretação dos resultados
  • 13. 3ª: Presença de micro-organismos no ambiente Observar a presença de diferentes colônias na superfície das placas; observar os diferentes tipos de bactérias e fungos; preparar lâminas e observa-las ao microscópia. Distinguir os diferentes tipos microbianos. Interpretação dos resultados
  • 14.
  • 15. Métodos Físicos e Agentes Químicos no Controle do Crescimento Microbiano: Esterilização, Desinfecção e Antissepsia O crescimento dos micro-organismo pode ser controlado através de métodos físicos e químicos. Eliminação total ou parcial
  • 16. Esterilização – Eliminação total dos micro-organismos presentes em determinado material ou ambiente. Desinfecção – Inativação ou redução do número de micro-organismos presentes em material inanimado. A desinfecção não implica na eliminação de todos os micro-organismos viáveis, porém elimina a potencialidade infecciosa do objeto, superfícies ou local de trabalho. Assim, a desinfecção tem como objetivo eliminar os micro-organismos. Antissepsia – Consiste no mesmo conceito de desinfecção, porém está relacionado com substâncias (antissépticos) aplicados em tecido vivo.
  • 17. I – Métodos Físicos de Controle do Crescimento de Micro-organismos
  • 18. Calor 1 – Calor úmido Autoclave – utiliza o calor na forma de vapor d’água sob pressão. Destrói formas vegetativas e esporuladas (121ºC/15-30minutos). Usados para meios de cultivo, vidrarias, etc. Água em ebulição – utiliza o calor na forma de vapor d’água livre. Destrói apenas formas vegetativas (100ºC/20minutos
  • 19. Tindalização – utiliza o calor na forma de vapor d’água livre. Visa destruir formas vegetativas e esporuladas. É também denominado esterilização fracionada ou intermitente (100ºC/20min. Durante 3 dias consecutivos). Usado no preparo de alguns medicamento, vacinas, etc. Pasteurização – Reduz as populações microbianas sem destruir necessariamente todas as formas vegetativas. Muito utilizado nas indústrias de alimentos (leite, cremes, cerveja, etc). Dois tipos: - Alta temperatura – usa um tempo curto (15 seg.) a 72ºC - Baixa temperatura – usa um tempo mais longo (30 seg) a 63ºC
  • 20. 2 – Calor Seco Fornos ou estufas – utiliza o calor seco a 180ºC durante 1 ou 2 horas. Muito usado para vidrarias e para materiais danificáveis pela umidade como os metais ou óleos. Flambagem – esteriliza agulhas e alças microbiológicas: aquecimento ao rubro                                          
  • 21. Incineração – para eliminar animais de laboratório
  • 22. Radiações Ultravioleta – o comprimento de onda mais efetivo para efeitos germicidas é entre 2600-2700A. Muito usado para salas cirúrgicas. O poder de penetração é muito baixo. Atua no DNA formando dímeros de timina. Raios  - empregado para materiais descartáveis e material cirúrgico termolábil. Método caro e perigoso. Uso industrial.
  • 23. Filtração Filtros bacteriológicos – empregados para esterilizar materiais termolábeis como soro, enzimas, etc. São filtros de materiais diversos como ésteres (acetato ou nitrato) de celulose e amianto
  • 24.
  • 25.
  • 26. Interpretação dos Resultados: 1ª - Ação do calor sobre bactérias. Observar os 4 tubos semeados na aula anterior. A turvação do meio de cultura, ou a presença de uma película na superfície do meio, indica a presença do crescimento bacteriano. Avaliar a eficiência dos tratamentos comparando o crescimento em relação ao tubo 1 (controle). Comparar os resultados obtidos com cada uma das duas espécies bacterianas: B. Subtilis e E. coli . As culturas de B. Sutilis , por serem esporuladas , são muito mais resistentes e só são destruídas por autoclavação. Já as formas vegetativas de ambas as culturas são destruídas em banho-maria.
  • 27. Escherichia coli X Bacillus calor
  • 28.
  • 29. Fenóis e derivados (fenol, cresol) - desnaturação de proteínas Álcoois (metílico, etílico, propílico) - solvente para lipídios - desnatura e coagula proteínas Compostos de cloro (hipoclorito de sódio, cloramina, cloro) - se combina com proteínas - agente ocidante Tintura de iodo, água sanitária, permanganato de potássio - agentes oxidantes Detergentes (lauril sulfato de sódio) - rompe membrana celular - altera permeabilidade celular - diminui tensão superficial Corantes (cristal violeta) - tem afinidade por ácidos nucleicos Óxido de etileno (gás esterilizante) - agente alquilante - ativo contra formas vegetativas e esporulados. Usado na preservação de alimento, esterilização de material plástico, equipamentos médicos etc. Desnatura proteínas e danifica DNA e RNA (ação mutagênica) Agentes Mecanismo de ação
  • 30. 2ª - Teste da eficácia da ação de agentes químicos ( antissépticos ) sobre os micro-organismos. Será demonstrada a ação do álcool, álcool iodado, detergentes, água sanitária, etc . Sobre o crescimento de Serratia sp (técnica do polegar) 1 – Em placa de petri contendo meio de cultura, delimitar 3 regiões , utilizando lápis cera. Marcar as regiões 1, 2 e 3; 2 – Sobre a superfície do meio, comprimir ligeiramente o polegar na região 1, tomando cuidado para não ferir o agar; 3 – Umidece o polegar no papel de filtro embebido com cultura de Serratia e comprimi-lo ligeiramente na região 2; 4 – Lavar o polegar utilizando qualquer um dos agentes antissepticos a sua escolha ( alcool, alcool iodado, detergente ou água santária); 5 – Secar o polegar ao ar e novamente comprimi-lo ligeiramente na região 3; 6 – Anotar o composto utilizado. Identificar a placa. Embrulhar com papel e incubar a temperatura ambiante (25-28ºC) por 24/72h; Prática 2
  • 31. Interpretação dos Resultados: 2ª - Teste da ação dos agente antissépticos. Observar a placa da aula anterior, e verificar o crescimento bacteriano nas quatro regiões. Comparar a eficiência dos diferentes antiossépticos usados pelos colegas.
  • 32. Assunto 3: Exame Microscópio de Micro-organismos
  • 33. 0,2 mm 300 nm a 1  m Bactérias e Arqueas Fungos Protozoários Algas 10  m a 100  m Pox vius Herpes vius 27 nm a 300nm
  • 34. Bactérias e Arqueas Fungos Protozoários Algas
  • 35. Microscopia óptica, corada pelo método de Gram, de cocos em um arranjo denominado estafilococos. Microscopia eletrônica de varredura das células apresentadas acima.
  • 36. Varredura Transmissão Varredura Transmissão Pox vius Herpes vius
  • 37. Principais tipos de preparações microscópicas para visualizar micro-organismos
  • 38. Tipos de coloração utilizadas em microscopia óptica Colorações SIMPLES Positiva Negativa DIFERENCIAL SEPARAÇÃO DE GRUPOS Coloração de Gram Coloração de Ziehl-Neelsen – Alcool-ácido resistente VISUALIZAÇÃO DE ESTRUTURAS Esporos Cápsulas Flagelo
  • 39. POSITIVA – corantes carregados positivamente (núcleo superfície) Ex: Giemsa NEGATIVA – corante acídico (lâmina) Ex: Nanquim T. cruzi Plasmodium falciparum C. neoformans COLORAÇÃO SIMPLES Uso de apenas 1 corantes
  • 40. Coloração de Ziehl-Neelsen Dificulta a penetração de vários corantes – grande hidrofobicidade COLORAÇÃO DIFERENCIADA Uso de apenas 2 corante
  • 41. Solução àlcool-ácido (etanol 95% + HCL concentrado) 5 min, aquecendo Água destilada Carbolfucsina Até o líquisdo que pararmde sair colorido Água destilada Azul de Metileno Água destilada 2 min Papel de filtro e micorscópio óptico Coloração de Ziehl-Neelsen
  • 42. COLORAÇÃO DIFERENCIADA Uso de apenas 2 corantes Lugol (mordente – forma complexo insolúvel com o corante primário-iodo para-rosalina) 1 min Água destilada Cristal Violeta (cora o citoplasma de púrpura, independentemente do tipo de célula) 1 min Água destilada Etanol a 95% (álcool-acetona ou ambos: solvente lipídico Água destilada Safranina (cora o citoplasma de vermelho) 45 seg Água destilada Papel de filtro e micorscópio óptico Coloração de Gram
  • 43.  
  • 45. Formas e Arranjos (eubactérias)
  • 46.  
  • 47.  
  • 48.
  • 49. Execução: 1ª - Observação microscópica de lâminas prontas a) Esporos de Bacillus megaterium (cultura com mais de 48 horas de crescimento), coradas pelo método de Schaeffer fulton (célula corada de vermelho (safranina) e esporos corados de verde (verde malaquita) b) Bactérias coradas pelo Gram: B. subtilis , S. aureus (Gram positiva e E. coli (Gram negativa)
  • 50. 2ª- Preparação de lâminas para observações microscópicas 1) Preparação a fresco de E. coli . Após flambar a alça, colocar uma gota de suspensão bacteriana em uma lâmina, cobrir com lamínula. Adicionar uma pequena gota de óleo de cedro e observar com objetiva de imersão (100x) 2) Preparação a fresco de Sccharomyces cerevisiae . Retirar, com uma alça flambada, uma porção do crescimento da levedura e suspender em uma gota de solução salina em uma lâmina. Cobrir com lamínula e observar com objetiva de 40x.
  • 51. 3) Preparação a fresco de Aspergillus versicolor . Cuidadosamente, para não alterar as estruturas fúngicas, retirar com alça flambada uma porção do crescimento do fungo e suspender em uma gota de solução salina, em uma lâmina. Observar entre lâmina e lamínula com objetiva de 40x. 4) Preparação a fresco de Herpetomonas sp. Retirar, com uma alça flambada, uma porção do crescimento em meio líquido do protozoário e colocar sobre uma lâmina. Cobrir cuidadosamente com uma lamínula. Observar com objetiva de 40x.
  • 52.
  • 53.
  • 54. Interpretação dos Resultados (Leitura) 1ª – Observação de lâminas prontas: 1) Observação de lâminas de Bacillus megaterium . Distinguir os esporos, corados em verde das células vegetativas, coradas em vermelho. Observar esporos dentro e fora da célula. 2) Observação de lâminas de bactérias coradas ao Gram. Distinguir o tamanho, a forma (coco ou bacilo) e a reação ao Gram, roxas, Gram (+) ou vermelhas, Gram (-). Observar algum arranjo característico.
  • 55. Interpretação dos Resultados (Leitura) 2ª – Observação de lâminas preparadas pelo aluno: 1) Observar, na preparação a fresco de E. coli , seu tamanho relativo, sua forma e sua locomoção. 2) Observar S. cerevisiae quanto a forma, tamanho relativo e a presença ou ausência de brotamento. 3) Observar A. versicolor quanto ao tamanho. Identificar o micélio, hifas septadas ou não, e se possível as estruturas que contêm os esporos. 4) Observar Herpetomonas sp quanto ao tamanho e capacidade de locomoção. 5) Observar as lâminas coradas pelo Gram, como em 2), 1 parte.
  • 56. Interpretação dos Resultados (Leitura) 3ª – Observação de colônias desconhecidas de micro-organismos do ambiente: - Observar ao microscópio as lâminas preparadas pelo próprio aluno. De acordo com as características observadas tais como tamanho, forma, Gram, presença de hifas, etc. Confirmar tratar-se de bactéria, levedura ou fungo.
  • 57. Assunto 4: Técnicas de Isolamento e Contagem de Micro-organismos: Obtenção de Cultura Pura
  • 58. Meios de Cultura: Destinam-se ao cultivo artificial dos micro-organismos e portanto devem fornecer os nutrientes indispensáveis ao seu crescimento. Normalmente contém uma fonte de C, N e sais minerais, além de fatores de crescimento, para o caso de micro-organismos exigentes. Meio de enriquecimento: Adequado ao crescimento de micro-organismos heterotrófico mais exigentes em termos nutritivos, tais como os patogênicos. Costuma-se adicionar sangue, soro, extrato de plantas ou animais. Ex.: B.H.I (Brain Heart Infusion), para protozoários. Meio Seletivo: Adequado ao isolamento de um grupo particular de micro-organismos, através da adição de substâncias químicas que vão inibir certos grupos sem afetar outros, ou, ao contrário, facilitar certos grupos e não outros. Ex.: adição de antibióticos, de fonte de C específicas, como a celulose para celulolíticos
  • 59. Meio diferencial: Através da adição de certos reagentes ao meio, após inoculação e incubação, poder-se-á observar uma modificação que permita diferenciar tipos de bactérias. Ex.: meio BEM para diferenciar E. coli , meio de agareur manitol sal para diferenciar Staphylococcus aureus, meio de Teaguer, que diferencia bactérias lactose positivas (escuras) das lactose negativa (claras). EMB – E. coli – verde metálico Agar manitol sal – S. aureus – amarelo ouro MacConkey – Lactose+ - rosa
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  • 63. Técnica de Diluição para obtenção de cultura pura e contagem de colônias
  • 64.
  • 65. Execução: 1ª - Técnica do esgotamento para o isolamento de bactérias (obtenção de cultura em meio sólido) a) Utilizar a suspensão mista de bactérias (Serratia sp + Micococcus sp) a ser distribuída pelo professor; b) Flambar a alça e retirar com ela uma pequena gota da suspensão mista de bactérias; semeá-las sobre a superfície de um meio (agar simples) em placas. A semeadura deve ser feita por estrias, de acordo com o esquema, na seguinte sequência. 1ª operação: colocar a gota na superfície do meio e passar a alça em zig-zag sem tocar no meio já semeado, cobrindo outro 1/3 da placa; 2ª operação: mudar a direção do estriamento para a 2ª região da placa, com o mesmo cuidade da região 1, cobrindo outro 1/3 da placa 3ª operação: mudar a direção da estriamento para a parte final do meio, sem tocar na superfície já semeada. c) Embrulhar as placas e incubar na estufa a 37°C por 24 horas.
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  • 67.
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