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Meios de cultura e características
bacterianas
UNG 2017
PROCEDIMENTOS GERAIS
• Sempre que for usado o termo "esterilizar por filtração",usar
o filtro com porosidade de 0,22 micra, recomendado para
partículas bacterianas.
• Quando distribuir o meio antes de autoclavar, os tubos não
precisam estar esterilizados;
• Quando distribuir o meio após a autoclavação, os tubos,
frascos, placas, pipetas e vidrarias ou materiais auxiliares
obrigatoriamente devem ser estéreis.
• Os meios devem ser autoclavados com as tampas semi
• abertas, para que a esterilização seja por igual em todo o
conteúdo dos tubos - tampas fechadas não permitem a
entrada do vapor
PROCEDIMENTOS GERAIS
• Os meios comerciais devem ser hidratados em pequena quantidade de
água até que todo o meio fique úmido e só depois deve-se acrescentar
o restante da água.
• Os meios preparados não comerciais, devem ser pesados
separadamente em papel manteiga ou papel alumínio e adicionados
em um único frasco (normalmente em béquer), hidratar em pequena
quantidade de água até que todo o meio fique úmido e só depois
deve-se acrescentar o restante da água.
• Sempre que for necessário levar o meio para fundir, usar vidro Pyrex,
aquecer sobre a tela de amianto ou similar e tripé, no bico de Bunsen.
• Usar sempre luvas térmicas apropriadas para laboratório para
manipular vidrarias quentes;
• Sempre que for usado o termo "esterilizar em autoclave", o tempo de
esterilização é de 15 minutos e a temperatura de 121ºC
C
CONTROLE DE QUALIDADE DE ESTERILIDADE
E CRESCIMENTO
• Para todos os meios confeccionados, colocar no mínimo 10%
do lote preparado na estufa 35 ± 1°C por 24 horas para o
controle de esterilidade.
• Não deve haver mudança de cor nem crescimento de
qualquer colônia.
• Para o controle de crescimento, sempre que possível usar
cepas ATCC, que são cepas de referências de origem e
padrão definido de provas para a sua caracterização.
• Se não for possível o uso de cepas ATCC, usar cepas 100%
positivas para os controles de qualidade de crescimento
realizados.
RECOMENDAÇÕES GERAIS
• Evitar usar meios vencidos (liofilizados e prontos para uso); se usar, certificar-se com o
controle de crescimento de que realmente está funcionando. ƒ
• Não usar meios prontos para uso em tubos ou placas que estejam ressecados.
• Observar com atenção para as instruções de alguns inóculos que são específicos para
alguns meios de cultura.
• Recomenda-se o uso de tubos com tampa de rosca, pois evitam o ressecamento rápido do
meio (tamanho dos tubos utilizados geralmente são de 11 por 100 mm).
• As placas de Petri são de 50, 90 ou 150 mm de diâmetro.
• Todos os meios confeccionados devem ser devidamente identificados com o nome, data de
fabricação, data de validade e tipo de armazenamento.
• Todos os meios de placa devem ser embalados em filme plástico PVC transparente para
evitar o ressecamento.
• Evitar o uso de sacos plásticos para embalar as placas, pois a água de condensação
formada facilita a proliferação de fungos; para meios de cultura em tubos, colocar em
sacos plásticos, procurando tirar o excesso de ar.
• Para todos os meios confeccionados, colocar no mínimo 10%
do lote preparado na estufa 35 ± 1°C por 24 horas para o
controle de esterilidade.
• Não deve haver mudança de cor nem crescimento de
qualquer colônia.
• Para o controle de crescimento, sempre que possível usar
cepas ATCC, que são cepas de referências de origem e
padrão definido de provas para a sua caracterização.
• Se não for possível o uso de cepas ATCC, usar cepas 100%
positivas para os controles de qualidade de crescimento
realizados.
RECOMENDAÇÕES GERAIS
MEIOS DE CULTURA PARA TRANSPORTE
E CONSERVAÇÃO
CARY BLAIR
• PRINCÍPIO
• meio de Cary Blair foi formulado à partir do meio de Stuart, uma vez que
microrganismos patogênicos e outros coliformes fecais sobrevivem bem neste
meio.
• A carência de uma fonte de nitrogênio impede consideravelmente a
multiplicação de microrganismos e a composição nutritiva garante a
sobrevivência deles.
• ƒO que difere este meio do meio de Stuart, é a adição de uma solução salina
balanceada de tampão fosfato inorgânico e omitindoda fórmula o azul de
metileno.
• UTILIDADE
• ƒ
• Transporte de material fecal e consequente conservação dos microrganismos
MEIOS DE CULTURA PARA TRANSPORTE
E CONSERVAÇÃO
CARY BLAIR
• PRINCÍPIO
• meio de Cary Blair foi formulado à partir do meio de Stuart, uma vez que
microrganismos patogênicos e outros coliformes fecais sobrevivem bem neste
meio.
• A carência de uma fonte de nitrogênio impede consideravelmente a
multiplicação de microrganismos e a composição nutritiva garante a
sobrevivência deles.
• O que difere este meio do meio de Stuart, é a adição de uma solução salina
balanceada de tampão fosfato inorgânico e omitindo da fórmula o azul de
metileno.
UTILIDADE
• Transporte de material fecal e consequente conservação dos microrganismos
MEIOS DE CULTURA PARA TRANSPORTE
E CONSERVAÇÃO
CARY BLAIR
• CONTROLE DE QUALIDADE
• Crescimento bom (com 0, 24 e 48 horas de crescimento): Shigella flexneri
• CONSERVAÇÃO E VALIDADE
• Conservar de 4 a 10°C de 6 a 8 semanas.
• INOCULAÇÃO
• Introduzir um "swab" estéril de madeira nas fezes recém coletadas;
• Após a coleta, introduzir imediatamente o "swab" no meio de cultura e quebrar a ponta da haste, de modo que
a parte que contém o algodão fique no meio de cultura;
• Fechar o tubo;
• ƒManter em temperatura ambiente até o momento de semear nos meios seletivos adequados.
• INTERPRETAÇÃO
• Cor original do meio: Branco opalescente.
• Como este é um meio de transporte, não há evidência de crescimento bacteriano.
MEIOS DE CULTURA PARA TRANSPORTE
E CONSERVAÇÃO
• SALINA TAMPONADA
• PRINCÍPIO
• Meio líquido tamponado que mantém a bactéria viável.
• UTILIDADE
• Meio de transporte de fezes.
• FÓRMULA /PRODUTO
• Fórmula:
• NaCl - 4,2 g
• Fosfato dipotássico anidro - 3,1 g
• Glicerina bidestilada - 300 ml
• Água destilada - 700 ml
MEIOS DE CULTURA PARA TRANSPORTE
E CONSERVAÇÃO
• CONTROLE DE QUALIDADE
• Shigella flexneri (ATCC 12022)
• INOCULAÇÃO
• Inocular 2 g da amostra de fezes e homogeneizar;
• Incubar a 35 ±1°C por 12 a 18 horas.
• INTERPRETAÇÃO
• O crescimento é indicado pela turbidez do meio.
• Após incubação semear 3 a 4 alçadas da amostra em uma placa de
SS e/ou MacConkey.
• CONSERVAÇÃO E VALIDADE
• Conservar de 4 a 8°C por até 3 meses
MEIOS DE CULTURA PARA TRANSPORTE
E CONSERVAÇÃO
• CONTROLE DE QUALIDADE
• Shigella flexneri
• INOCULAÇÃO
• Inocular 2 g da amostra de fezes e homogeneizar;
• Incubar a 35 ±1°C por 12 a 18 horas.
• INTERPRETAÇÃO
• O crescimento é indicado pela turbidez do meio.
• Após incubação semear 3 a 4 alçadas da amostra em uma placa de
SS e/ou MacConkey.
• CONSERVAÇÃO E VALIDADE
• Conservar de 4 a 8°C por até 3 meses
MEIOS DE CULTURA PARA TRANSPORTE
E CONSERVAÇÃO
• MEIO STUART
• PRINCÍPIO
• A carência de uma fonte de nitrogênio impede
consideravelmente a multiplicação de microorganismos e a
composição nutritiva garante a sobrevivência deles.
• UTILIDADE
• Transporte de diversos materiais e conseqüente conservação
dos microorganismos.
• Conservação de microorganismos patogênicos como:
Haemophilus spp., Pneumococcus, Salmonella spp., Shigella
spp. entre outros.
MEIOS DE CULTURA PARA TRANSPORTE
E CONSERVAÇÃO
• MEIO STUART
• CONTROLE DE QUALIDADE
• Crescimento bom (com 0, 24 e 48 horas de crescimento):
• Haemophilus influenzae
• Shigella flexneri
• Streptococcus pneumoniae
• Bordetella pertussis
• CONSERVAÇÃO E VALIDADE
• Conservar embalado de 4 a 8°C por 1 a 2 semanas
MEIOS DE CULTURA PARA TRANSPORTE
E CONSERVAÇÃO
• MEIO STUART
• INOCULAÇÃO
• O material biológico deve ser coletado com auxílio de um "swab"
estéril com haste de madeira;
• Após a coleta, introduzir imediatamente o "swab" no meio de cultura e
quebrar a ponta da haste, de modo que a parte que contém o algodão
fique no meio de cultura;
• Fechar o tubo;
• Manter em temperatura ambiente até o momento de semear nos
meios seletivos adequados.
• INTERPRETAÇÃO
• Cor original do meio: Branco opalescente.
• Como este é um meio de transporte, não há evidência de crescimento
bacteriano.
MEIOS DE CULTURA PARA TRANSPORTE
E CONSERVAÇÃO
• MEIO STUART
• INOCULAÇÃO
• O material biológico deve ser coletado com auxílio de um "swab"
estéril com haste de madeira;
• Após a coleta, introduzir imediatamente o "swab" no meio de cultura e
quebrar a ponta da haste, de modo que a parte que contém o algodão
fique no meio de cultura;
• Fechar o tubo;
• Manter em temperatura ambiente até o momento de semear nos
meios seletivos adequados.
• INTERPRETAÇÃO
• Cor original do meio: Branco opalescente.
• Como este é um meio de transporte, não há evidência de crescimento
bacteriano.
MEIOS DE CULTURA PARA TRANSPORTE
E CONSERVAÇÃO
• ÁGAR NUTRIENTE
• PRINCÍPIO
• O Nutriente Ágar é um meio relativamente simples, de fácil preparação e
barato, muito usado nos procedimentos do laboratório de Microbiologia.
• UTILIDADE
• nutriente ágar tem várias aplicações no laboratório de Microbiologia, e
pode ser utilizado para análise de água, alimentos e leite como meio para
cultivo preliminar das amostras submetidas à exames bacteriológicos e
isolamento de organismos para culturas puras.
• uso mais freqüente é para a conservação e manutenção de culturas em
temperatura ambiente neste ágar, como método opcional para os
laboratórios que não dispõem do método da crioconservação
(congelamento das cepas em freezer à - 70ºC).
MEIOS DE CULTURA PARA TRANSPORTE
E CONSERVAÇÃO
• ÁGAR NUTRIENTE
• PRINCÍPIO
• O Nutriente Ágar é um meio relativamente simples, de fácil preparação e
barato, muito usado nos procedimentos do laboratório de Microbiologia.
• UTILIDADE
• nutriente ágar tem várias aplicações no laboratório de Microbiologia, e
pode ser utilizado para análise de água, alimentos e leite como meio para
cultivo preliminar das amostras submetidas à exames bacteriológicos e
isolamento de organismos para culturas puras.
• uso mais freqüente é para a conservação e manutenção de culturas em
temperatura ambiente neste ágar, como método opcional para os
laboratórios que não dispõem do método da crioconservação
(congelamento das cepas em freezer à - 70ºC).
MEIOS DE CULTURA PARA TRANSPORTE
E CONSERVAÇÃO
• ÁGAR NUTRIENTE
• FÓRMULA /PRODUTO
• Produto: Nutriente Ágar
• Fórmula:
• Extrato de carne - 3 g
• Peptona - 5 g
• Ágar ágar - 15 g
• Água destilada 1000 ml
• pH: 6,8 +/- 0,2
MEIOS DE CULTURA PARA TRANSPORTE
E CONSERVAÇÃO
• CONTROLE DE QUALIDADE
• Crescimento bom a excelente:
• Escherichia coli
• Streptococcus pneumoniae
• CONSERVAÇÃO E VALIDADE
• Conservar embalado de 4 a 8°C por até 3 meses.
• INOCULAÇÃO
• Estriar a superfície inclinada do meio;
• Incubar.
• INTERPRETAÇÃO
• Cor original do meio: branco opalescente
• Positivo: Crescimento na superfície do ágar;
• Negativo: Ausência de crescimento
MEIOS PARA CRESCIMENTO E ISOLAMENTO
• ÁGAR CHOCOLATE
• PRINCÍPIO
• Meio de Ágar Chocolate é amplamente utilizado para o cultivo de
microrganismos exigentes, embora cresçam neste meio quase
todos os tipos de microrganismos.
• À base do meio, é adicionado sangue de cavalo, carneiro ou coelho
em temperatura alta, o que faz com que as hemácias lisem,
liberando hemina e hematina, compostos fundamentais para o
crescimento dos microrganismos exigentes.
• Observação:
• se utilizar sangue de carneiro ou coelho no lugar do sangue de
cavalo, adicionar os suplementos a base de NAD (coenzima I) e
cisteína após resfriar a base achocolatada à aproximadamente
50ºC.
MEIOS PARA CRESCIMENTO E ISOLAMENTO
• ÁGAR CHOCOLATE
• CONTROLE DE QUALIDADE
• Crescimento bom a excelente: Haemophilus influenzae
• CONSERVAÇÃO E VALIDADE
• Conservar de 4 a 10°C por 4 meses.
• INOCULAÇÃO
• Estriar a superfície do meio, usando a técnica de semeadura
para isolamento;
• Incubar a 35ºC por 24 horas.
MEIOS PARA CRESCIMENTO E ISOLAMENTO
• INTERPRETAÇÃO
• Cor original do meio: castanho escuro (chocolate).
• Colônias de tamanho pequeno a médio, com pigmento
amarelo: sugestivo de Neisseria spp, Branhamella
catarrhalis ou Moraxella spp.
• Colônias pequenas e delicadas, com pigmento creme
claro: sugestivo de Haemophilus spp.
MEIOS PARA CRESCIMENTO E ISOLAMENTO
• ÁGAR THAYER-MARTIN CHOCOLATE
• PRINCÍPIO
• ƒÉ um meio rico e superior a outros meios de cultivo
destinados para o isolamento de Neisseria gonorrhoeae e
Neisseria meningitidis
• Contém em sua fórmula antibióticos que inibem o
crescimento de Neisserias saprófitas e outras bactérias
• UTILIDADE ƒ
• Usado para o isolamento seletivo de Neisseria gonorrhoeae e
Neisseria meningitidis, a partir do material de investigação.
MEIOS PARA CRESCIMENTO E ISOLAMENTO
• ÁGAR SALMONELLA-SHIGELLA (SS)
• PRINCÍPIO
• ƒÁgar SS possue componentes (sais de bile, verde brilhante e
citrato de sódio) que inibem microrganismos Gram positivos. ƒ
A incorporação de lactose ao meio permite diferenciar se o
microrganismo é lactose positiva (bactérias que fermentam a
lactose produzem ácido que na presença do indicador
vermelho neutro resultando na formação de colônias de cor
rosa)
MEIOS PARA CRESCIMENTO E ISOLAMENTO
• ÁGAR SALMONELLA-SHIGELLA (SS)
• PRINCÍPIO
• ƒBactérias que não fermentam a lactose formam colônias
transparentes. ƒ
• Tissulfato de sódio e o citrato férrico permitem a detecção
de H²S evidenciado por formação de colônias de cor negra no
centro.
• UTILIDADE
• ƒSelecionar e isolar espécies de Salmonella e Shigella, em
amostras de fezes, alimentos e água
MEIOS PARA CRESCIMENTO E ISOLAMENTO
• ÁGAR SALMONELLA-SHIGELLA (SS)
• CONTROLE DE QUALIDADE
• ƒPositivo: Salmonella typhimurium
• ƒNegativo: Staphylococcus aureus
•
• INOCULAÇÃO
• ƒInocular as placas e incubar por 18 a 24 horas; ƒSe negativo
após 24 horas, reincubar por mais 24 horas.
MEIOS PARA CRESCIMENTO E ISOLAMENTO
• ÁGAR SALMONELLA-SHIGELLA (SS)
•
• INTERPRETAÇÃO
• Cor original do meio: vermelho alaranjado.
• Colônias com centro negro (H²S) ou colônias incolores: suspeita
de Salmonella.
• Colônias incolores: suspeita de Shigella spp.
• Colônias cor de rosa ou vermelho: suspeita de Escherichia coli
ou Klebsiella spp.
• As bactérias não fermentadoras de lactose são incolores.
• As bactérias fermentadoras de lactose aparecem na cor rosa.
MEIOS PARA CRESCIMENTO E ISOLAMENTO
• ÁGAR SANGUE
• O meio de Ágar sangue, usando uma base rica como abaixo descrita,
oferece ótimas condições de crescimento a maioria dos microrganismos.
• A conservação dos eritrócitos íntegros favorecem a formação de halos de
hemólise nítidos, úteis para a diferenciação de Streptococcus spp. E
Staphylococcus spp.
• UTILIDADE
• Usado para o isolamento de microrganismos não fastidiosos.
• Verificação de hemólise dos Streptococcus spp. e Staphylococcus spp.
• Usado na prova de satelitismo (para identificação presuntiva de
Haemophilus spp.).
MEIOS PARA CRESCIMENTO E ISOLAMENTO
• Usado na prova de satelitismo (para identificação presuntiva de
Haemophilus spp.). (O crescimento, em uma cultura, de bactérias de
uma espécie, ao redor de colônias de outra, que lhe fornece os
micronutrientes)
MEIOS PARA CRESCIMENTO E ISOLAMENTO
• CONTROLE DE QUALIDADE
• Hemólise beta hemolítica (lise completa das hemácias): Streptococcus
pyogenes ou Staphylococcus aureus
• Hemólise alfa hemolítica (hemólise parcial das hemácias): Streptococcus
do grupo viridans ou Streptococcus pneumoniae
• Hemólise gama (sem hemólise): Enterococcus faecalis ATCC 29212 ou
Staphylococcus epidermidis
MEIOS PARA CRESCIMENTO E ISOLAMENTO
• INTERPRETAÇÃO
• Cor original do meio: vermelho.
• Beta hemólise: presença de halo transparente ao redor das colônias
semeadas (lise total dos eritrócitos).
• Alfa hemólise: presença de halo esverdeado ao redor das colônias
semeadas (lise parcial dos eritrócitos).
• 􀂃 Gama hemólise (sem hemólise): ausência de halo ao redor das colônias
(eritrócitos permanecem íntegros).
MEIOS PARA CRESCIMENTO E ISOLAMENTO
• ÁGAR CLED – CYSTINE LACTOSE ELECTROLYTE DEFICIENT
• PRINCÍPIO
• Usado para isolamento e quantificação de microrganismos presentes em
amostras urina. A deficiência de eletrólitos inibe cepas de Proteus.
• UTILIDADE
• Isolar e quantificar microrganismos Gram positivos, Gram negativos e
leveduras
MEIOS PARA CRESCIMENTO E ISOLAMENTO
• ÁGAR CLED – CYSTINE LACTOSE ELECTROLYTE DEFICIENT
• CONTROLE DE QUALIDADE
• Positivo:
• Lactose positiva: Escherichia coli ATCC 25922: crescimento moderado a
denso, colônias
• médias ou grandes amareladas, após 48 horas de incubação.
• Lactose negativa: Proteus vulgaris ATCC 8427: crescimento moderado a
denso, colônias azuis
• translúcidas.
• Negativo: ausência de crescimento
MEIOS PARA CRESCIMENTO E ISOLAMENTO
• ÁGAR CLED – CYSTINE LACTOSE ELECTROLYTE DEFICIENT
• CONTROLE DE QUALIDADE
• Positivo:
• Lactose positiva: Escherichia coli ATCC 25922: crescimento moderado a
denso, colônias médias ou grandes amareladas, após 48 horas de incubação.
• Lactose negativa: Proteus vulgaris ATCC 8427: crescimento moderado a
denso, colônias azuis translúcidas.
• Negativo: ausência de crescimento
• INTERPRETAÇÃO
• Cor original do meio: azul claro.
• Colônias lactose positiva: cor amarela.
• Colônias lactose negativa: cor azul.
MEIOS PARA CRESCIMENTO E ISOLAMENTO
• Características de crescimento:
• Escherichia coli: colônias opacas, amarelas com ligeira cor amarelo
escuro no centro, com cerca de 1,25 mm de diâmetro, as não
fermentadoras de lactose colônias azuis
• Espécies de Klebsiella: colônias muito mucosas, cor variável de amarelo
a branco azulado
• Espécies de Proteus: colônias azul translúcidas, geralmente menor que
E.coli
• Espécies de Salmonella: colônias planas, cor azul
MEIOS PARA CRESCIMENTO E ISOLAMENTO
• Características de crescimento:
• Enterococcus faecalis: colônias amarelas, com cerca de 0,5 mm de
diâmetro
• Staphylococcus aureus: colônias amarelas, com cerca de 0,75 mm de
diâmetro
• Staphylococcus coagulase negativa: colônias amarelo palha e brancas
• Corynebacterium: colônias pequenas e cinza
• Lactobacilos: colônias pequenas e com superfície rugosa
• Pseudomonas aeruginosa: colônias verdes, com superfície prateada e
periferia rugosa
MEIOS PARA CRESCIMENTO E ISOLAMENTO
• CALDO BHI – BRAIN HEART INFUSION
• PRINCÍPIO
• É um meio derivado de nutrientes de cérebro e coração, peptona e
dextrose.
• A peptona e a infusão são fontes de nitrogênio, carbono, enxofre e
vitaminas.
• A dextrose é um carboidrato que os microrganismos utilizam para
fermentação
MEIOS PARA CRESCIMENTO E ISOLAMENTO
• CALDO BHI – BRAIN HEART INFUSION
• UTILIDADE
• Meio para cultivo de estreptococcos, pneumococos, meningococos,
enterobactérias, não fermentadores, leveduras e fungos.
• Pode ser utilizado na preparação do inóculo para teste de
susceptibilidade aos antimicrobianos, para realização de teste de
coagulase em tubo, para teste de crescimento bacteriano a 42 e 44°Ce
para teste de motilidade em lâmina
MEIOS PARA CRESCIMENTO E ISOLAMENTO
• CALDO BHI – BRAIN HEART INFUSION
• CONTROLE DE QUALIDADE
• Positivo: Streptococcus pneumoniae e Candida albicans.
• Negativo: meio sem inocular
• INTERPRETAÇÃO
• Cor original do meio: amarelo claro, límpido.
• Positivo: presença de turvação = crescimento bacteriano.
• Negativo: ausência de turvação.
MEIOS PARA CRESCIMENTO E ISOLAMENTO
• LÖWENSTEIN JENSEN
• PRINCÍPIO
• A base do meio é constituída por ovos integrais, o que permite amplo
crescimento das micobactérias e o crescimento é satisfatório para o teste
de niacina (que é positivo para Mycobacterium tuberculosis).
• UTILIDADE
• Isolamento primário das micobactérias.
MEIOS PARA CRESCIMENTO E ISOLAMENTO
• LÖWENSTEIN JENSEN
• FÓRMULA / PRODUTO
• Meio comercial: Meio TB para Bacilos de Koch Seg. Löwenstein Jensen ou
Löwenstein Medium Base
• Ovos de galinha frescos –
• CONTROLE DE QUALIDADE
• Esterilização: colocar todos os tubos em estufa;
• Crescimento bom a excelente: Mycobacterium tuberculosis, Mycobacterium
avium
• As bactérias podem ser identificadas por características do
seu metabolismo, como a capacidade de degradar
determinados substratos e produzir gases.
• As provas bioquímicas utilizam meios de cultura e reagentes
específicos para detectar metabólitos resultantes da
atividade bacteriana, auxiliando na sua identificação.
• As provas mais conhecidas são:
– Utilização de fontes de carbono
– Utilização de fontes de nitrogênio
– Produção de enzimas
– Motilidade
Provas Bioquímicas para identificação de
bactérias
• Motilidade
• A motilidade é observada através do aspecto do meio.
• Utiliza-se um meio semi-sólido o que permite o crescimento
bacteriano no interior do meio, por todo o tubo.
• Se a bactéria for móvel (motilidade positiva), o aspecto do meio
será turvo
• Se a bactéria for imóvel (motilidade negativa), o crescimento só
será observado no local de inoculação.
– Espiroquetas
Provas Bioquímicas para identificação de
bactérias
• Produção de enzimas
• Catalase
• Algumas bactérias são capazes de produzir a enzima catalase.
• Decompõe o peróxido de hidrogênio (H2O2) liberando água e oxigênio
molecular (O2) – produção de bolhas.
• 2 H2O2 → 2 H2O + O2
• Coloca-se uma gota da cultura líquida em uma lâmina e deposita-se sobre
ela uma gota de peróxido de hidrogênio a 3%.
• O peróxido de hidrogênio pode ser gotejado diretamente sobre uma cultura
em placa.
• Distinção entre Staphylococcus (catalase positiva) e Streptococcus (catalase
negativa)
Provas Bioquímicas para identificação de
bactérias
• Produção de enzimas
• Oxidase
• As bactérias que produzem a enzima oxidase apresentam um sistema de
transporte de elétrons denominado sistema citocromo oxidase.
• Neste sistema, os aceptores eletrônicos naturais podem ser substituídos por
substratos artificiais.
• Na presença de oxigênio atmosférico, são oxidados pela citocromo oxidase,
formando um composto colorido.
• A determinação da oxidase é um teste diferencial importante na identificação
de bactérias Gram negativas
• utiliza-se para diferenciar o género Neisseria (oxidase positiva) de outros cocos
gram negativos e para distinguir a família Enterobacteriacea (oxidase negativa)
Provas Bioquímicas para identificação de
bactérias
• Produção de enzimas
• Hidrólise da gelatina
• Determina a habilidade do microrganismo de produzir enzimas proteolíticas
(gelatinases) que liquefazem/hidrolisam gelatina;
• Identificar e classificar bactérias fermentadoras, não fermentadoras e bacilos
Gram positivos esporulados.
• Bacillus anthracis, Bacillus cereus, Bacillus subtilis, Clostridium perfringens e
Clostridium tetani
Provas Bioquímicas para identificação de
bactérias
• Produção de enzimas
• Coagulase
• Princípio
• Verificar a capacidade de microrganismos reagirem com o plasma e
formarem um coágulo, uma vez que a coagulase é uma proteína com
atividade similar à protombrina, capaz de converter o fibrinogênio em
fibrina, que resulta na formação de um coágulo visível.
• Pode ser encontrada em duas formas que possuem diferentes propriedades:
coagulase conjugada e coagulase livre.
• A coagulase conjugada, também conhecida como fator de aglutinação,
encontra-se unida à parede celular bacteriana
• Quando as células bacterianas são suspensas em plasma (fibrinogênio),
formam-se cordões de fibrina entre elas, o que causa agrupamento sob a
forma de grumos visíveis.
Provas Bioquímicas para identificação de
bactérias
• Produção de enzimas
• Coagulase
• A coagulase livre é uma substância similar à trombina e está presente em
filtrados de cultivos.
• É secretada extracelularmente e reage com uma substância presente no
plasma denominado Fator de Reação com a Coagulase – CRF, para formar um
complexo que, por sua vez, reage com fibrinogênio, formando fibrina
(coágulos).
• Quando uma suspensão em plasma do microrganismo produtor de coagulase
é preparada em tubo de ensaio, forma-se um coágulo visível após o período
de incubação
• Separa as espécies de Staphylococcus de importância clínica (S. aureus –
coagulase positiva), das demais espécies – coagulase negativa.
Provas Bioquímicas para identificação de
bactérias
• Produção de enzimas
• Fenilalanina desaminase
• Há bactérias que produzem enzimas que removem o grupo amina da
fenilalanina presente no meio
• Origina o ácido fenilpirúvico.
• O ácido fenilpirúvico reage com o cloreto férrico (10%) adicionado ao meio,
formando uma cor verde.
• Diferenciar gêneros e espécies de enterobactérias.
• Proteus
Provas Bioquímicas para identificação de
bactérias
• Produção de enzimas
• Lisina
• Algumas bactérias possuem a lisina descarboxilase (LDC) que atua sobre
a porção carboxila dos aminoácidos.
• Formam-se aminas, de reação alcalina (por ex. cadaverina), e CO2.
• A reação ocorre preferencialmente em condições anaeróbias e
ligeiramente ácidas
• Inicialmente ocorre a utilização da glicose do meio para enriquecimento
da cultura e acidificação do meio.
Provas Bioquímicas para identificação de
bactérias
• Produção de enzimas
• Lisina
• O meio contém o indicador bromocresol púrpura.
• Nas etapas iniciais de incubação, o tubo torna-se amarelo devido à
fermentação da glicose.
• Se o aminoácido é descarboxilado o meio retorna à cor púrpura. A
reação se processa em anaerobiose, podendo-se cobrir o meio com óleo
mineral para agilizar o processo
Provas Bioquímicas para identificação de
bactérias
• Produção de enzimas
• Indol
• O indol é produzido pela ação da enzima triptofanase sobre o triptofano
existente no meio de cultura
• Ocorre a produção de ácido pirúvico e amônia.
• O indol pode ser detectado pela formação de um anel rosa (pink) na
parte superior do tubo, após a adição do reativo de Erlich
Provas Bioquímicas para identificação de
bactérias
• Produção de enzimas
• Uréia
• Há bactérias que possuem a enzima urease - capacidade de degradar a
uréia presente no meio liberando amônia, CO2 e H2O.
• A amônia reage formando carbonato de amônia que alcaliniza o meio.
• O indicador de pH é o vermelho de fenol, que em meio alcalino toma a
coloração pink.
• Uma coloração meio rosa é suficiente para considerar a reação positiva.
• BGN fermentadores e não fermentadores / Staphylococcus e
Haemophilus.
Provas Bioquímicas para identificação de
bactérias
• Utilização de fontes de carbono
• Citrato
• Determina se a bactéria é capaz de utilizar o citrato de sódio como única fonte
de carbono para crescer.
• Deve ser utilizado o meio Citrato de Simmons, contendo citrato de sódio, fosfato
de amônia e azul de bromotimol.
• Com a facilidade do transporte de citrato pela citrato-permease há a sua
utilização pela citrase, com produção de hidróxido de amônia que eleva o pH,
fazendo com que a reação se torne azul.
• O CO2 produzido reage com o sódio do citrato formando carbonatos de reação
alcalina.
• Citrato positivo – Salmonella
• Citrato negativo – E. coli
Provas Bioquímicas para identificação de
bactérias
• Fermentação
• Vermelho de Metila (VM)
• Avalia se as bactérias produzem ácidos a partir da fermentação da glicose
pela via ácida mista.
• Podem ser produzidos: ácido fórmico, lático, acético, provocando redução
do pH abaixo de 4,4 ( viragem do indicador).
• Todas as enterobactérias fermentam glicose.
• Porém, algumas, durante a fase final de incubação, convertem esses ácidos
a produtos não ácidos como o etanol e a acetoína, resultando num pH mais
elevado (pH 6).
• O indicador de pH é o vermelho de metila
– pH abaixo de 4,4 é vermelho
– acima de 6 é amarelo
Provas Bioquímicas para identificação de
bactérias
• Hidrólise do Amido
• Amido - polissacarídeo - alto peso molecular.
• Para ser transportado para o interior da célula e ser utilizado - quebra em
unidades menores.
• A habilidade para hidrolisar esse polímero depende da produção e secreção de
várias amilases.
• A quebra do amido é detectada utilizando-se culturas em ágar amido que são
cobertas com uma solução de iodo.
• O iodo reage com o amido para formar um complexo azul escuro.
• As colônias que podem hidrolisar o amido apresentarão uma zona clara a seu
redor
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  • 1. Meios de cultura e características bacterianas UNG 2017
  • 2. PROCEDIMENTOS GERAIS • Sempre que for usado o termo "esterilizar por filtração",usar o filtro com porosidade de 0,22 micra, recomendado para partículas bacterianas. • Quando distribuir o meio antes de autoclavar, os tubos não precisam estar esterilizados; • Quando distribuir o meio após a autoclavação, os tubos, frascos, placas, pipetas e vidrarias ou materiais auxiliares obrigatoriamente devem ser estéreis. • Os meios devem ser autoclavados com as tampas semi • abertas, para que a esterilização seja por igual em todo o conteúdo dos tubos - tampas fechadas não permitem a entrada do vapor
  • 3. PROCEDIMENTOS GERAIS • Os meios comerciais devem ser hidratados em pequena quantidade de água até que todo o meio fique úmido e só depois deve-se acrescentar o restante da água. • Os meios preparados não comerciais, devem ser pesados separadamente em papel manteiga ou papel alumínio e adicionados em um único frasco (normalmente em béquer), hidratar em pequena quantidade de água até que todo o meio fique úmido e só depois deve-se acrescentar o restante da água. • Sempre que for necessário levar o meio para fundir, usar vidro Pyrex, aquecer sobre a tela de amianto ou similar e tripé, no bico de Bunsen. • Usar sempre luvas térmicas apropriadas para laboratório para manipular vidrarias quentes; • Sempre que for usado o termo "esterilizar em autoclave", o tempo de esterilização é de 15 minutos e a temperatura de 121ºC
  • 4. C CONTROLE DE QUALIDADE DE ESTERILIDADE E CRESCIMENTO • Para todos os meios confeccionados, colocar no mínimo 10% do lote preparado na estufa 35 ± 1°C por 24 horas para o controle de esterilidade. • Não deve haver mudança de cor nem crescimento de qualquer colônia. • Para o controle de crescimento, sempre que possível usar cepas ATCC, que são cepas de referências de origem e padrão definido de provas para a sua caracterização. • Se não for possível o uso de cepas ATCC, usar cepas 100% positivas para os controles de qualidade de crescimento realizados.
  • 5. RECOMENDAÇÕES GERAIS • Evitar usar meios vencidos (liofilizados e prontos para uso); se usar, certificar-se com o controle de crescimento de que realmente está funcionando. ƒ • Não usar meios prontos para uso em tubos ou placas que estejam ressecados. • Observar com atenção para as instruções de alguns inóculos que são específicos para alguns meios de cultura. • Recomenda-se o uso de tubos com tampa de rosca, pois evitam o ressecamento rápido do meio (tamanho dos tubos utilizados geralmente são de 11 por 100 mm). • As placas de Petri são de 50, 90 ou 150 mm de diâmetro. • Todos os meios confeccionados devem ser devidamente identificados com o nome, data de fabricação, data de validade e tipo de armazenamento. • Todos os meios de placa devem ser embalados em filme plástico PVC transparente para evitar o ressecamento. • Evitar o uso de sacos plásticos para embalar as placas, pois a água de condensação formada facilita a proliferação de fungos; para meios de cultura em tubos, colocar em sacos plásticos, procurando tirar o excesso de ar.
  • 6. • Para todos os meios confeccionados, colocar no mínimo 10% do lote preparado na estufa 35 ± 1°C por 24 horas para o controle de esterilidade. • Não deve haver mudança de cor nem crescimento de qualquer colônia. • Para o controle de crescimento, sempre que possível usar cepas ATCC, que são cepas de referências de origem e padrão definido de provas para a sua caracterização. • Se não for possível o uso de cepas ATCC, usar cepas 100% positivas para os controles de qualidade de crescimento realizados. RECOMENDAÇÕES GERAIS
  • 7. MEIOS DE CULTURA PARA TRANSPORTE E CONSERVAÇÃO CARY BLAIR • PRINCÍPIO • meio de Cary Blair foi formulado à partir do meio de Stuart, uma vez que microrganismos patogênicos e outros coliformes fecais sobrevivem bem neste meio. • A carência de uma fonte de nitrogênio impede consideravelmente a multiplicação de microrganismos e a composição nutritiva garante a sobrevivência deles. • ƒO que difere este meio do meio de Stuart, é a adição de uma solução salina balanceada de tampão fosfato inorgânico e omitindoda fórmula o azul de metileno. • UTILIDADE • ƒ • Transporte de material fecal e consequente conservação dos microrganismos
  • 8. MEIOS DE CULTURA PARA TRANSPORTE E CONSERVAÇÃO CARY BLAIR • PRINCÍPIO • meio de Cary Blair foi formulado à partir do meio de Stuart, uma vez que microrganismos patogênicos e outros coliformes fecais sobrevivem bem neste meio. • A carência de uma fonte de nitrogênio impede consideravelmente a multiplicação de microrganismos e a composição nutritiva garante a sobrevivência deles. • O que difere este meio do meio de Stuart, é a adição de uma solução salina balanceada de tampão fosfato inorgânico e omitindo da fórmula o azul de metileno. UTILIDADE • Transporte de material fecal e consequente conservação dos microrganismos
  • 9. MEIOS DE CULTURA PARA TRANSPORTE E CONSERVAÇÃO CARY BLAIR • CONTROLE DE QUALIDADE • Crescimento bom (com 0, 24 e 48 horas de crescimento): Shigella flexneri • CONSERVAÇÃO E VALIDADE • Conservar de 4 a 10°C de 6 a 8 semanas. • INOCULAÇÃO • Introduzir um "swab" estéril de madeira nas fezes recém coletadas; • Após a coleta, introduzir imediatamente o "swab" no meio de cultura e quebrar a ponta da haste, de modo que a parte que contém o algodão fique no meio de cultura; • Fechar o tubo; • ƒManter em temperatura ambiente até o momento de semear nos meios seletivos adequados. • INTERPRETAÇÃO • Cor original do meio: Branco opalescente. • Como este é um meio de transporte, não há evidência de crescimento bacteriano.
  • 10. MEIOS DE CULTURA PARA TRANSPORTE E CONSERVAÇÃO • SALINA TAMPONADA • PRINCÍPIO • Meio líquido tamponado que mantém a bactéria viável. • UTILIDADE • Meio de transporte de fezes. • FÓRMULA /PRODUTO • Fórmula: • NaCl - 4,2 g • Fosfato dipotássico anidro - 3,1 g • Glicerina bidestilada - 300 ml • Água destilada - 700 ml
  • 11. MEIOS DE CULTURA PARA TRANSPORTE E CONSERVAÇÃO • CONTROLE DE QUALIDADE • Shigella flexneri (ATCC 12022) • INOCULAÇÃO • Inocular 2 g da amostra de fezes e homogeneizar; • Incubar a 35 ±1°C por 12 a 18 horas. • INTERPRETAÇÃO • O crescimento é indicado pela turbidez do meio. • Após incubação semear 3 a 4 alçadas da amostra em uma placa de SS e/ou MacConkey. • CONSERVAÇÃO E VALIDADE • Conservar de 4 a 8°C por até 3 meses
  • 12. MEIOS DE CULTURA PARA TRANSPORTE E CONSERVAÇÃO • CONTROLE DE QUALIDADE • Shigella flexneri • INOCULAÇÃO • Inocular 2 g da amostra de fezes e homogeneizar; • Incubar a 35 ±1°C por 12 a 18 horas. • INTERPRETAÇÃO • O crescimento é indicado pela turbidez do meio. • Após incubação semear 3 a 4 alçadas da amostra em uma placa de SS e/ou MacConkey. • CONSERVAÇÃO E VALIDADE • Conservar de 4 a 8°C por até 3 meses
  • 13. MEIOS DE CULTURA PARA TRANSPORTE E CONSERVAÇÃO • MEIO STUART • PRINCÍPIO • A carência de uma fonte de nitrogênio impede consideravelmente a multiplicação de microorganismos e a composição nutritiva garante a sobrevivência deles. • UTILIDADE • Transporte de diversos materiais e conseqüente conservação dos microorganismos. • Conservação de microorganismos patogênicos como: Haemophilus spp., Pneumococcus, Salmonella spp., Shigella spp. entre outros.
  • 14. MEIOS DE CULTURA PARA TRANSPORTE E CONSERVAÇÃO • MEIO STUART • CONTROLE DE QUALIDADE • Crescimento bom (com 0, 24 e 48 horas de crescimento): • Haemophilus influenzae • Shigella flexneri • Streptococcus pneumoniae • Bordetella pertussis • CONSERVAÇÃO E VALIDADE • Conservar embalado de 4 a 8°C por 1 a 2 semanas
  • 15. MEIOS DE CULTURA PARA TRANSPORTE E CONSERVAÇÃO • MEIO STUART • INOCULAÇÃO • O material biológico deve ser coletado com auxílio de um "swab" estéril com haste de madeira; • Após a coleta, introduzir imediatamente o "swab" no meio de cultura e quebrar a ponta da haste, de modo que a parte que contém o algodão fique no meio de cultura; • Fechar o tubo; • Manter em temperatura ambiente até o momento de semear nos meios seletivos adequados. • INTERPRETAÇÃO • Cor original do meio: Branco opalescente. • Como este é um meio de transporte, não há evidência de crescimento bacteriano.
  • 16. MEIOS DE CULTURA PARA TRANSPORTE E CONSERVAÇÃO • MEIO STUART • INOCULAÇÃO • O material biológico deve ser coletado com auxílio de um "swab" estéril com haste de madeira; • Após a coleta, introduzir imediatamente o "swab" no meio de cultura e quebrar a ponta da haste, de modo que a parte que contém o algodão fique no meio de cultura; • Fechar o tubo; • Manter em temperatura ambiente até o momento de semear nos meios seletivos adequados. • INTERPRETAÇÃO • Cor original do meio: Branco opalescente. • Como este é um meio de transporte, não há evidência de crescimento bacteriano.
  • 17. MEIOS DE CULTURA PARA TRANSPORTE E CONSERVAÇÃO • ÁGAR NUTRIENTE • PRINCÍPIO • O Nutriente Ágar é um meio relativamente simples, de fácil preparação e barato, muito usado nos procedimentos do laboratório de Microbiologia. • UTILIDADE • nutriente ágar tem várias aplicações no laboratório de Microbiologia, e pode ser utilizado para análise de água, alimentos e leite como meio para cultivo preliminar das amostras submetidas à exames bacteriológicos e isolamento de organismos para culturas puras. • uso mais freqüente é para a conservação e manutenção de culturas em temperatura ambiente neste ágar, como método opcional para os laboratórios que não dispõem do método da crioconservação (congelamento das cepas em freezer à - 70ºC).
  • 18. MEIOS DE CULTURA PARA TRANSPORTE E CONSERVAÇÃO • ÁGAR NUTRIENTE • PRINCÍPIO • O Nutriente Ágar é um meio relativamente simples, de fácil preparação e barato, muito usado nos procedimentos do laboratório de Microbiologia. • UTILIDADE • nutriente ágar tem várias aplicações no laboratório de Microbiologia, e pode ser utilizado para análise de água, alimentos e leite como meio para cultivo preliminar das amostras submetidas à exames bacteriológicos e isolamento de organismos para culturas puras. • uso mais freqüente é para a conservação e manutenção de culturas em temperatura ambiente neste ágar, como método opcional para os laboratórios que não dispõem do método da crioconservação (congelamento das cepas em freezer à - 70ºC).
  • 19. MEIOS DE CULTURA PARA TRANSPORTE E CONSERVAÇÃO • ÁGAR NUTRIENTE • FÓRMULA /PRODUTO • Produto: Nutriente Ágar • Fórmula: • Extrato de carne - 3 g • Peptona - 5 g • Ágar ágar - 15 g • Água destilada 1000 ml • pH: 6,8 +/- 0,2
  • 20. MEIOS DE CULTURA PARA TRANSPORTE E CONSERVAÇÃO • CONTROLE DE QUALIDADE • Crescimento bom a excelente: • Escherichia coli • Streptococcus pneumoniae • CONSERVAÇÃO E VALIDADE • Conservar embalado de 4 a 8°C por até 3 meses. • INOCULAÇÃO • Estriar a superfície inclinada do meio; • Incubar. • INTERPRETAÇÃO • Cor original do meio: branco opalescente • Positivo: Crescimento na superfície do ágar; • Negativo: Ausência de crescimento
  • 21. MEIOS PARA CRESCIMENTO E ISOLAMENTO • ÁGAR CHOCOLATE • PRINCÍPIO • Meio de Ágar Chocolate é amplamente utilizado para o cultivo de microrganismos exigentes, embora cresçam neste meio quase todos os tipos de microrganismos. • À base do meio, é adicionado sangue de cavalo, carneiro ou coelho em temperatura alta, o que faz com que as hemácias lisem, liberando hemina e hematina, compostos fundamentais para o crescimento dos microrganismos exigentes. • Observação: • se utilizar sangue de carneiro ou coelho no lugar do sangue de cavalo, adicionar os suplementos a base de NAD (coenzima I) e cisteína após resfriar a base achocolatada à aproximadamente 50ºC.
  • 22. MEIOS PARA CRESCIMENTO E ISOLAMENTO • ÁGAR CHOCOLATE • CONTROLE DE QUALIDADE • Crescimento bom a excelente: Haemophilus influenzae • CONSERVAÇÃO E VALIDADE • Conservar de 4 a 10°C por 4 meses. • INOCULAÇÃO • Estriar a superfície do meio, usando a técnica de semeadura para isolamento; • Incubar a 35ºC por 24 horas.
  • 23. MEIOS PARA CRESCIMENTO E ISOLAMENTO • INTERPRETAÇÃO • Cor original do meio: castanho escuro (chocolate). • Colônias de tamanho pequeno a médio, com pigmento amarelo: sugestivo de Neisseria spp, Branhamella catarrhalis ou Moraxella spp. • Colônias pequenas e delicadas, com pigmento creme claro: sugestivo de Haemophilus spp.
  • 24. MEIOS PARA CRESCIMENTO E ISOLAMENTO • ÁGAR THAYER-MARTIN CHOCOLATE • PRINCÍPIO • ƒÉ um meio rico e superior a outros meios de cultivo destinados para o isolamento de Neisseria gonorrhoeae e Neisseria meningitidis • Contém em sua fórmula antibióticos que inibem o crescimento de Neisserias saprófitas e outras bactérias • UTILIDADE ƒ • Usado para o isolamento seletivo de Neisseria gonorrhoeae e Neisseria meningitidis, a partir do material de investigação.
  • 25. MEIOS PARA CRESCIMENTO E ISOLAMENTO • ÁGAR SALMONELLA-SHIGELLA (SS) • PRINCÍPIO • ƒÁgar SS possue componentes (sais de bile, verde brilhante e citrato de sódio) que inibem microrganismos Gram positivos. ƒ A incorporação de lactose ao meio permite diferenciar se o microrganismo é lactose positiva (bactérias que fermentam a lactose produzem ácido que na presença do indicador vermelho neutro resultando na formação de colônias de cor rosa)
  • 26. MEIOS PARA CRESCIMENTO E ISOLAMENTO • ÁGAR SALMONELLA-SHIGELLA (SS) • PRINCÍPIO • ƒBactérias que não fermentam a lactose formam colônias transparentes. ƒ • Tissulfato de sódio e o citrato férrico permitem a detecção de H²S evidenciado por formação de colônias de cor negra no centro. • UTILIDADE • ƒSelecionar e isolar espécies de Salmonella e Shigella, em amostras de fezes, alimentos e água
  • 27. MEIOS PARA CRESCIMENTO E ISOLAMENTO • ÁGAR SALMONELLA-SHIGELLA (SS) • CONTROLE DE QUALIDADE • ƒPositivo: Salmonella typhimurium • ƒNegativo: Staphylococcus aureus • • INOCULAÇÃO • ƒInocular as placas e incubar por 18 a 24 horas; ƒSe negativo após 24 horas, reincubar por mais 24 horas.
  • 28. MEIOS PARA CRESCIMENTO E ISOLAMENTO • ÁGAR SALMONELLA-SHIGELLA (SS) • • INTERPRETAÇÃO • Cor original do meio: vermelho alaranjado. • Colônias com centro negro (H²S) ou colônias incolores: suspeita de Salmonella. • Colônias incolores: suspeita de Shigella spp. • Colônias cor de rosa ou vermelho: suspeita de Escherichia coli ou Klebsiella spp. • As bactérias não fermentadoras de lactose são incolores. • As bactérias fermentadoras de lactose aparecem na cor rosa.
  • 29. MEIOS PARA CRESCIMENTO E ISOLAMENTO • ÁGAR SANGUE • O meio de Ágar sangue, usando uma base rica como abaixo descrita, oferece ótimas condições de crescimento a maioria dos microrganismos. • A conservação dos eritrócitos íntegros favorecem a formação de halos de hemólise nítidos, úteis para a diferenciação de Streptococcus spp. E Staphylococcus spp. • UTILIDADE • Usado para o isolamento de microrganismos não fastidiosos. • Verificação de hemólise dos Streptococcus spp. e Staphylococcus spp. • Usado na prova de satelitismo (para identificação presuntiva de Haemophilus spp.).
  • 30. MEIOS PARA CRESCIMENTO E ISOLAMENTO • Usado na prova de satelitismo (para identificação presuntiva de Haemophilus spp.). (O crescimento, em uma cultura, de bactérias de uma espécie, ao redor de colônias de outra, que lhe fornece os micronutrientes)
  • 31. MEIOS PARA CRESCIMENTO E ISOLAMENTO • CONTROLE DE QUALIDADE • Hemólise beta hemolítica (lise completa das hemácias): Streptococcus pyogenes ou Staphylococcus aureus • Hemólise alfa hemolítica (hemólise parcial das hemácias): Streptococcus do grupo viridans ou Streptococcus pneumoniae • Hemólise gama (sem hemólise): Enterococcus faecalis ATCC 29212 ou Staphylococcus epidermidis
  • 32. MEIOS PARA CRESCIMENTO E ISOLAMENTO • INTERPRETAÇÃO • Cor original do meio: vermelho. • Beta hemólise: presença de halo transparente ao redor das colônias semeadas (lise total dos eritrócitos). • Alfa hemólise: presença de halo esverdeado ao redor das colônias semeadas (lise parcial dos eritrócitos). • 􀂃 Gama hemólise (sem hemólise): ausência de halo ao redor das colônias (eritrócitos permanecem íntegros).
  • 33. MEIOS PARA CRESCIMENTO E ISOLAMENTO • ÁGAR CLED – CYSTINE LACTOSE ELECTROLYTE DEFICIENT • PRINCÍPIO • Usado para isolamento e quantificação de microrganismos presentes em amostras urina. A deficiência de eletrólitos inibe cepas de Proteus. • UTILIDADE • Isolar e quantificar microrganismos Gram positivos, Gram negativos e leveduras
  • 34. MEIOS PARA CRESCIMENTO E ISOLAMENTO • ÁGAR CLED – CYSTINE LACTOSE ELECTROLYTE DEFICIENT • CONTROLE DE QUALIDADE • Positivo: • Lactose positiva: Escherichia coli ATCC 25922: crescimento moderado a denso, colônias • médias ou grandes amareladas, após 48 horas de incubação. • Lactose negativa: Proteus vulgaris ATCC 8427: crescimento moderado a denso, colônias azuis • translúcidas. • Negativo: ausência de crescimento
  • 35. MEIOS PARA CRESCIMENTO E ISOLAMENTO • ÁGAR CLED – CYSTINE LACTOSE ELECTROLYTE DEFICIENT • CONTROLE DE QUALIDADE • Positivo: • Lactose positiva: Escherichia coli ATCC 25922: crescimento moderado a denso, colônias médias ou grandes amareladas, após 48 horas de incubação. • Lactose negativa: Proteus vulgaris ATCC 8427: crescimento moderado a denso, colônias azuis translúcidas. • Negativo: ausência de crescimento • INTERPRETAÇÃO • Cor original do meio: azul claro. • Colônias lactose positiva: cor amarela. • Colônias lactose negativa: cor azul.
  • 36. MEIOS PARA CRESCIMENTO E ISOLAMENTO • Características de crescimento: • Escherichia coli: colônias opacas, amarelas com ligeira cor amarelo escuro no centro, com cerca de 1,25 mm de diâmetro, as não fermentadoras de lactose colônias azuis • Espécies de Klebsiella: colônias muito mucosas, cor variável de amarelo a branco azulado • Espécies de Proteus: colônias azul translúcidas, geralmente menor que E.coli • Espécies de Salmonella: colônias planas, cor azul
  • 37. MEIOS PARA CRESCIMENTO E ISOLAMENTO • Características de crescimento: • Enterococcus faecalis: colônias amarelas, com cerca de 0,5 mm de diâmetro • Staphylococcus aureus: colônias amarelas, com cerca de 0,75 mm de diâmetro • Staphylococcus coagulase negativa: colônias amarelo palha e brancas • Corynebacterium: colônias pequenas e cinza • Lactobacilos: colônias pequenas e com superfície rugosa • Pseudomonas aeruginosa: colônias verdes, com superfície prateada e periferia rugosa
  • 38. MEIOS PARA CRESCIMENTO E ISOLAMENTO • CALDO BHI – BRAIN HEART INFUSION • PRINCÍPIO • É um meio derivado de nutrientes de cérebro e coração, peptona e dextrose. • A peptona e a infusão são fontes de nitrogênio, carbono, enxofre e vitaminas. • A dextrose é um carboidrato que os microrganismos utilizam para fermentação
  • 39. MEIOS PARA CRESCIMENTO E ISOLAMENTO • CALDO BHI – BRAIN HEART INFUSION • UTILIDADE • Meio para cultivo de estreptococcos, pneumococos, meningococos, enterobactérias, não fermentadores, leveduras e fungos. • Pode ser utilizado na preparação do inóculo para teste de susceptibilidade aos antimicrobianos, para realização de teste de coagulase em tubo, para teste de crescimento bacteriano a 42 e 44°Ce para teste de motilidade em lâmina
  • 40. MEIOS PARA CRESCIMENTO E ISOLAMENTO • CALDO BHI – BRAIN HEART INFUSION • CONTROLE DE QUALIDADE • Positivo: Streptococcus pneumoniae e Candida albicans. • Negativo: meio sem inocular • INTERPRETAÇÃO • Cor original do meio: amarelo claro, límpido. • Positivo: presença de turvação = crescimento bacteriano. • Negativo: ausência de turvação.
  • 41. MEIOS PARA CRESCIMENTO E ISOLAMENTO • LÖWENSTEIN JENSEN • PRINCÍPIO • A base do meio é constituída por ovos integrais, o que permite amplo crescimento das micobactérias e o crescimento é satisfatório para o teste de niacina (que é positivo para Mycobacterium tuberculosis). • UTILIDADE • Isolamento primário das micobactérias.
  • 42. MEIOS PARA CRESCIMENTO E ISOLAMENTO • LÖWENSTEIN JENSEN • FÓRMULA / PRODUTO • Meio comercial: Meio TB para Bacilos de Koch Seg. Löwenstein Jensen ou Löwenstein Medium Base • Ovos de galinha frescos – • CONTROLE DE QUALIDADE • Esterilização: colocar todos os tubos em estufa; • Crescimento bom a excelente: Mycobacterium tuberculosis, Mycobacterium avium
  • 43. • As bactérias podem ser identificadas por características do seu metabolismo, como a capacidade de degradar determinados substratos e produzir gases. • As provas bioquímicas utilizam meios de cultura e reagentes específicos para detectar metabólitos resultantes da atividade bacteriana, auxiliando na sua identificação. • As provas mais conhecidas são: – Utilização de fontes de carbono – Utilização de fontes de nitrogênio – Produção de enzimas – Motilidade Provas Bioquímicas para identificação de bactérias
  • 44. • Motilidade • A motilidade é observada através do aspecto do meio. • Utiliza-se um meio semi-sólido o que permite o crescimento bacteriano no interior do meio, por todo o tubo. • Se a bactéria for móvel (motilidade positiva), o aspecto do meio será turvo • Se a bactéria for imóvel (motilidade negativa), o crescimento só será observado no local de inoculação. – Espiroquetas Provas Bioquímicas para identificação de bactérias
  • 45. • Produção de enzimas • Catalase • Algumas bactérias são capazes de produzir a enzima catalase. • Decompõe o peróxido de hidrogênio (H2O2) liberando água e oxigênio molecular (O2) – produção de bolhas. • 2 H2O2 → 2 H2O + O2 • Coloca-se uma gota da cultura líquida em uma lâmina e deposita-se sobre ela uma gota de peróxido de hidrogênio a 3%. • O peróxido de hidrogênio pode ser gotejado diretamente sobre uma cultura em placa. • Distinção entre Staphylococcus (catalase positiva) e Streptococcus (catalase negativa) Provas Bioquímicas para identificação de bactérias
  • 46. • Produção de enzimas • Oxidase • As bactérias que produzem a enzima oxidase apresentam um sistema de transporte de elétrons denominado sistema citocromo oxidase. • Neste sistema, os aceptores eletrônicos naturais podem ser substituídos por substratos artificiais. • Na presença de oxigênio atmosférico, são oxidados pela citocromo oxidase, formando um composto colorido. • A determinação da oxidase é um teste diferencial importante na identificação de bactérias Gram negativas • utiliza-se para diferenciar o género Neisseria (oxidase positiva) de outros cocos gram negativos e para distinguir a família Enterobacteriacea (oxidase negativa) Provas Bioquímicas para identificação de bactérias
  • 47. • Produção de enzimas • Hidrólise da gelatina • Determina a habilidade do microrganismo de produzir enzimas proteolíticas (gelatinases) que liquefazem/hidrolisam gelatina; • Identificar e classificar bactérias fermentadoras, não fermentadoras e bacilos Gram positivos esporulados. • Bacillus anthracis, Bacillus cereus, Bacillus subtilis, Clostridium perfringens e Clostridium tetani Provas Bioquímicas para identificação de bactérias
  • 48. • Produção de enzimas • Coagulase • Princípio • Verificar a capacidade de microrganismos reagirem com o plasma e formarem um coágulo, uma vez que a coagulase é uma proteína com atividade similar à protombrina, capaz de converter o fibrinogênio em fibrina, que resulta na formação de um coágulo visível. • Pode ser encontrada em duas formas que possuem diferentes propriedades: coagulase conjugada e coagulase livre. • A coagulase conjugada, também conhecida como fator de aglutinação, encontra-se unida à parede celular bacteriana • Quando as células bacterianas são suspensas em plasma (fibrinogênio), formam-se cordões de fibrina entre elas, o que causa agrupamento sob a forma de grumos visíveis. Provas Bioquímicas para identificação de bactérias
  • 49. • Produção de enzimas • Coagulase • A coagulase livre é uma substância similar à trombina e está presente em filtrados de cultivos. • É secretada extracelularmente e reage com uma substância presente no plasma denominado Fator de Reação com a Coagulase – CRF, para formar um complexo que, por sua vez, reage com fibrinogênio, formando fibrina (coágulos). • Quando uma suspensão em plasma do microrganismo produtor de coagulase é preparada em tubo de ensaio, forma-se um coágulo visível após o período de incubação • Separa as espécies de Staphylococcus de importância clínica (S. aureus – coagulase positiva), das demais espécies – coagulase negativa. Provas Bioquímicas para identificação de bactérias
  • 50. • Produção de enzimas • Fenilalanina desaminase • Há bactérias que produzem enzimas que removem o grupo amina da fenilalanina presente no meio • Origina o ácido fenilpirúvico. • O ácido fenilpirúvico reage com o cloreto férrico (10%) adicionado ao meio, formando uma cor verde. • Diferenciar gêneros e espécies de enterobactérias. • Proteus Provas Bioquímicas para identificação de bactérias
  • 51. • Produção de enzimas • Lisina • Algumas bactérias possuem a lisina descarboxilase (LDC) que atua sobre a porção carboxila dos aminoácidos. • Formam-se aminas, de reação alcalina (por ex. cadaverina), e CO2. • A reação ocorre preferencialmente em condições anaeróbias e ligeiramente ácidas • Inicialmente ocorre a utilização da glicose do meio para enriquecimento da cultura e acidificação do meio. Provas Bioquímicas para identificação de bactérias
  • 52. • Produção de enzimas • Lisina • O meio contém o indicador bromocresol púrpura. • Nas etapas iniciais de incubação, o tubo torna-se amarelo devido à fermentação da glicose. • Se o aminoácido é descarboxilado o meio retorna à cor púrpura. A reação se processa em anaerobiose, podendo-se cobrir o meio com óleo mineral para agilizar o processo Provas Bioquímicas para identificação de bactérias
  • 53. • Produção de enzimas • Indol • O indol é produzido pela ação da enzima triptofanase sobre o triptofano existente no meio de cultura • Ocorre a produção de ácido pirúvico e amônia. • O indol pode ser detectado pela formação de um anel rosa (pink) na parte superior do tubo, após a adição do reativo de Erlich Provas Bioquímicas para identificação de bactérias
  • 54. • Produção de enzimas • Uréia • Há bactérias que possuem a enzima urease - capacidade de degradar a uréia presente no meio liberando amônia, CO2 e H2O. • A amônia reage formando carbonato de amônia que alcaliniza o meio. • O indicador de pH é o vermelho de fenol, que em meio alcalino toma a coloração pink. • Uma coloração meio rosa é suficiente para considerar a reação positiva. • BGN fermentadores e não fermentadores / Staphylococcus e Haemophilus. Provas Bioquímicas para identificação de bactérias
  • 55. • Utilização de fontes de carbono • Citrato • Determina se a bactéria é capaz de utilizar o citrato de sódio como única fonte de carbono para crescer. • Deve ser utilizado o meio Citrato de Simmons, contendo citrato de sódio, fosfato de amônia e azul de bromotimol. • Com a facilidade do transporte de citrato pela citrato-permease há a sua utilização pela citrase, com produção de hidróxido de amônia que eleva o pH, fazendo com que a reação se torne azul. • O CO2 produzido reage com o sódio do citrato formando carbonatos de reação alcalina. • Citrato positivo – Salmonella • Citrato negativo – E. coli Provas Bioquímicas para identificação de bactérias
  • 56. • Fermentação • Vermelho de Metila (VM) • Avalia se as bactérias produzem ácidos a partir da fermentação da glicose pela via ácida mista. • Podem ser produzidos: ácido fórmico, lático, acético, provocando redução do pH abaixo de 4,4 ( viragem do indicador). • Todas as enterobactérias fermentam glicose. • Porém, algumas, durante a fase final de incubação, convertem esses ácidos a produtos não ácidos como o etanol e a acetoína, resultando num pH mais elevado (pH 6). • O indicador de pH é o vermelho de metila – pH abaixo de 4,4 é vermelho – acima de 6 é amarelo Provas Bioquímicas para identificação de bactérias
  • 57. • Hidrólise do Amido • Amido - polissacarídeo - alto peso molecular. • Para ser transportado para o interior da célula e ser utilizado - quebra em unidades menores. • A habilidade para hidrolisar esse polímero depende da produção e secreção de várias amilases. • A quebra do amido é detectada utilizando-se culturas em ágar amido que são cobertas com uma solução de iodo. • O iodo reage com o amido para formar um complexo azul escuro. • As colônias que podem hidrolisar o amido apresentarão uma zona clara a seu redor Provas Bioquímicas para identificação de bactérias