Meios De Cultura E ColoraçãO

Meios de cultura e colorações

Preparação e distribuição de meios de cultura Os meios comerciais devem ser hidratados; Devem ser pesados  papel manteiga/alumínio; Frasco; Hidratar em pequena quantidade; Depois deve-se acrescentar o restante da água; Levar o meio para fundir  aquecer;

Preparação e distribuição de meios de cultura Usar sempre luvas térmicas; Sempre que for usado o termo "esterilizar em autoclave" , o tempo de esterilização é de 15 minutos e a temperatura de 121ºC; Sempre que for usado o termo "esterilizar por filtração", usar o filtro com porosidade de 0,22 micra, recomendado para partículas bacterianas; Distribuir o meio antes de autoclavar, os tubos não precisam estar esterilizados; Distribuir o meio após a autoclavação, os tubos, frascos, placas, pipetas e vidrarias  estéreis; Os meios devem ser autoclavados com as tampas semi-abertas, para que a esterilização seja por igual em todo o conteúdo dos tubos - tampas fechadas não permitem a entrada do vapor;

Meios de cultura - transporte CARY BLAIR Microrganismos patogênicos e outros coliformes fecais sobrevivem bem neste meio; A carência de uma fonte de nitrogênio impede consideravelmente a multiplicação de microrganismos e a composição nutritiva garante a sobrevivência deles; FUNÇÃO Transporte de material fecal e conseqüente conservação dos microrganismos;

Meios de cultura - transporte SALINA TAMPONADA Meio líquido tamponado que mantém a bactéria viável; FUNÇÃO Meio de transporte de fezes.

Meios de cultura - transporte MEIO STUART A carência de uma fonte de nitrogênio impede consideravelmente a multiplicação de microorganismos e a composição nutritiva garante a sobrevivência deles; FUNÇÃO Transporte de diversos materiais e conseqüente conservação dos microorganismos; Haemophilus spp., Pneumococcus , Salmonella spp., Shigella spp. entre outros.

Meios de cultura - manutenção ÁGAR NUTRIENTE Meio simples, de fácil preparação e barato; FUNÇÃO Várias aplicações  análise de água, alimentos e leite como meio para cultivo preliminar das amostras submetidas à exames bacteriológicos e isolamento de organismos para culturas puras; Conservação e manutenção de culturas em temperatura ambiente; Usado para observar esporulação de espécies de bacilos Gram positivos;

Meios para crescimento e isolamento ÁGAR CHOCOLATE Utilizado para o cultivo de microrganismos exigentes; Cresce quase todos os tipos de microrganismos; À base do meio  adiciona-se sangue de cavalo, carneiro ou coelho em temperatura alta  hemácias lisam  liberando hemina e hematina  compostos  crescimento dos m.o exigentes; Observação : s e utilizar sangue de carneiro ou coelho no lugar do sangue de cavalo, adicionar os suplementos a base de NAD (coenzima I) e cisteína após resfriar a base achocolatada à aproximadamente 50ºC;

Meios para crescimento e isolamento THAYER-MARTIN CHOCOLATE É um meio rico e superior a outros meios de cultivo destinados para o isolamento de Neisseria sp; Contém em sua fórmula antibióticos; Inibem o crescimento de outras bactérias, quando em amostras colhidas de sítios contaminados;

Meios para crescimento e isolamento ÁGAR SALMONELLA-SHIGELLA (SS) Possue componentes (sais de bile, verde brilhante e citrato de sódio) que inibem microrganismos Gram positivos; Lactose ao meio  se o m.o é lactose positiva; Tissulfato de sódio e o citrato férrico permitem a detecção de H²S evidenciado por formação de colônias de cor negra no centro. FUNÇÃO Selecionar e isolar espécies de Salmonella sp e Shigella sp , em amostras de fezes, alimentos e água.

Meios para crescimento e isolamento CALDO SELENITO Inibem coliformes e outras espécies da flora intestinal como estreptococos; FUNÇÃO Isolamento de Salmonella spp. e Shigella spp. em amostras de fezes, urina e alimentos...

Meios para crescimento e isolamento CALDO TETRATIONATO Os sais de bile contidos no meio de tetrationato inibem microrganismos Gram positivos e a adição da solução de iodo inibe a flora intestinal normal de espécies fecais; FUNÇÃO Meio de enriquecimento para Salmonella spp.

Meios para crescimento e isolamento ÁGAR MAC CONKEY O cristal violeta inibe o crescimento de microrganismos Gram positivos especialmente enterococos e estafilococos; A concentração de sais de bile é relativamente baixa em comparação com outros meios; Não é tão seletivo para Gram negativos como, por exemplo, o ágar SS; FUNÇÃO BGN (enterobactérias e não fermentadores) e verificar a fermentação ou não da lactose;

Meios para crescimento e isolamento ÁGAR SANGUE Base rica; Ótimas condições de crescimento; Formação de halos de hemólise nítidos, úteis para a diferenciação de Streptococcus spp. E Staphylococcus spp; FUNÇÃO Usado para o isolamento de microrganismos não fastidiosos; Verificação de hemólise dos Streptococcus spp. e Staphylococcus spp;

Meios para crescimento e isolamento ÁGAR CLED – CYSTINE LACTOSE ELECTROLYTE DEFICIENT Microrganismos presentes em amostras urina; A deficiência de eletrólitos inibe o véu de cepas de Proteus sp; FUNÇÃO Isolar e quantificar microrganismos Gram positivos, Gram negativos e leveduras;

Meios para crescimento e isolamento CALDO BHI – BRAIN HEART INFUSION Nutrientes de cérebro e coração, peptona e dextrose; A peptona e a infusão são fontes de nitrogênio, carbono, enxofre e vitaminas; A dextose é um carboidrato que os microrganismos utilizam para fermentação; Função Cultivo de estreptococcos, pneumococos, meningococos, enterobactérias, não fermentadores, leveduras e fungos; Pode ser utilizado na preparação do inóculo para teste de susceptibilidade aos antimicrobianos; Realização de teste de coagulase em tubo; Teste de crescimento bacteriano a 42 e 44°C;

Meios para crescimento e isolamento LÖWENSTEIN JENSEN A base do meio é constituída por ovos integrais, o que permite amplo crescimento das Micobactérias; FUNÇÃO Isolamento primário das micobactérias;

MEIOS PARA PROVAS DE IDENTIFICAÇÃO ÁGAR CITRATO SIMMONS Verifica a capacidade da bactéria de utilizar o citrato de sódio como única fonte de carbono; Sais de amônia  alcalinizando o meio; FUNÇÃO Diferenciar gêneros e espécies de Enterobactérias e não fermentadores.

MEIOS PARA PROVAS DE IDENTIFICAÇÃO ÁGAR BÍLE-ESCULINA Capacidade de bactérias hidrolisarem esculina na presença  bile; A esculina é um derivado glicosídico da cumarina; A esculina é incorporada em um meio contendo 4% de sais biliares; As bactérias Bile-Esculina POSITIVAS  crescem  presença de sais biliares;. A hidrólise da esculina no meio resulta na formação de glicose e esculetina; A esculetina reage com íons férricos (fornecidos pelo composto inorgânico do meio - o citrato férrico), formando um complexo negro; FUNÇÃO Identificação dos Enterococcus spp. , que são Bile-Esculina positiva;

MEIOS PARA PROVAS DE IDENTIFICAÇÃO ÁGAR FENILALANINA Verifica a capacidade da bactéria de produzir ácido fenilpirúvico a partir da fenilalanina por ação enzimática; FUNÇÃO Diferenciar gêneros e espécies de enterobactérias;

MEIOS PARA PROVAS DE IDENTIFICAÇÃO ÁGAR TSI – TRIPLO AÇÚCAR FERRO Este meio contém três açúcares: 0,1%glicose, 1,0% lactose, 1,0% sacarose, vermelho de fenol para detecção da fermentação de carboidratos e sulfato de ferro para detecção da produção de sulfato de hidrogênio (indicado pela cor preta na base do tubo); A fermentação é indicada pela mudança da cor do indicador de pH de vermelho para amarelo. O ágar fundido é deixado solidificar, formando uma superfície inclinada; Essa configuração origina duas câmaras de reação dentro do mesmo tubo; A porção inclinada ou bico, exposta em toda sua superfície ao oxigênio atmosférico, é aeróbia. A porção inferior, denominada profundidade ou fundo, está protegida do ar e é relativamente anaeróbia; FUNÇÃO Diferenciar bacilos Gram negativos com base na fermentação de carboidratos, produção de sulfato de hidrogênio e gás.

MEIOS PARA PROVAS DE IDENTIFICAÇÃO TSI - LEITURA Reações ápice/base: Púrpura/amarelo = fermentação apenas da glicose (lactose e sacarose negativos); Amarelo/amarelo = fermentação da glicose + lactose e/ou sacarose (2 ou 3 açucares); Presença de gás (CO²) = bolhas ou meio fragmentado; H²S positivo = presença de precipitado negro;

MEIOS PARA PROVAS DE IDENTIFICAÇÃO ÁGAR BASE URÉIA (CHRISTENSEN) Determinar a habilidade do microrganismo de degradar a uréia em duas moléculas de amônia pela ação da enzima urease; Positivo  na alcalinização do meio; Função BGN fermentadores e não fermentadores  Staphylococcus e Haemophilus.

MEIOS PARA PROVAS DE IDENTIFICAÇÃO PARA PROVA DE GELATINASE Determina a habilidade do microrganismo de produzir enzimas proteolíticas (gelatinases) que liquefaz/hidrolisa gelatina; FUNÇÃO Identificar e classificar bactérias fermentadoras, não fermentadoras e bacilos Gram positivos esporulados.

MEIOS PARA PROVAS DE IDENTIFICAÇÃO PARA PROVA DE OXIDASE O teste de oxidase é baseado na produção intracelular da enzima oxidase pela bactéria; FUNÇÃO Ajuda caracterizar espécies de Neisseria , distingui não fermentadores (oxidase positiva) de enterobactérias (oxidase negativa); Diferencia algumas bactérias fermentadoras oxidase positiva entre elas Plesiomonas shigelloides, Aeromonas spp. e Vibrio spp .

Interpretação Oxidase positiva: roxo, bactéria não fermentadora; Oxidase negativa: fermentadora, fazer testes bioquímicos (enterobactérias);

MEIOS PARA PROVAS DE IDENTIFICAÇÃO PARA TESTE DE MOTILIDADE A bactéria é móvel  flagelo; Flagelos ocorrem nos bacilos Gram negativos, poucas formas de cocos são móveis; FUNÇÃO Determinar se o microrganismo é o não móvel; Meios associados a outros testes: Meios SIM (Sulfato, Indol, Motilidade); MILI (Motilidade, Indol, Lisina); MIO (Motilidade, Indol, Ornitina) utilizados para testes enterobactérias;

MEIOS PARA PROVAS DE IDENTIFICAÇÃO PARA PROVA DE TOLERÂNCIA AO NaCl 6,5% A tolerância ao NaCl a 6,5% é uma prova utilizada para verificar a capacidade de alguns microrganismos crescerem em presença do sal; Meio base utilizado é o BHI caldo, que é um meio nutritivo de uso geral, empregado para o cultivo de muitas bactérias; FUNÇÃO Separa Enterococcus spp. , que são NaCl 6,5 % positivo dos demais Streptococcus spp., que são NaCl 6,5% negativos; Na identificação de bacilos Gram negativos não fermentadores.

MEIOS PARA PROVAS DE IDENTIFICAÇÃO ÁGAR MUELLER HINTON Ágar padronizado por Kirby e Bauer e pelo NCCLS que oferece condições de crescimento das principais bactérias; FUNÇÃO Meio utilizado para a realização do teste de avaliação da resistência aos antimicrobianos pelos métodos de difusão em disco e E-test para enterobactérias; Não fermentadores, Staphylococcus sp e Enterococcus sp .

Intepretação de entebactérias Identificação das enterobactérias Meios IAL ou Rugai Ápice LTD: reação positiva = verde garrafa; Sacarose fermentação: reação positiva = amarelo. Base Glicose fermentação: reação positiva = amarelo; Produção de gás: reação positiva = formação de bolhas; Hidrólise da uréia: ração positiva = azul intenso; H2S (gás sulfidríco): reação positiva = negra. Fundo Lisina: reação positiva = qualquer cor diferente de amarelo; Reação negativa = amarelo; Mobilidade: reação positiva = turvação do meio e ou qualquer crescimento além da picada ou arrebentamento do meio. Tampa Indol: reação positiva = rosa ou vermelha após a adição do reagente de Kovacs.

MEIOS PARA PROVAS DE IDENTIFICAÇÃO Kit EPM-MILI Tubo EPM: após o inóculo, a tampa deve fica um pouco frouxa. Provas Glicose: prova positiva = base do tubo amarela; H2S: prova positiva = cor negra. Tubo MILI: após o inóculo, sua tampa deve ser bem fechada. Provas Mobilidade: reação positiva = crescimento para todos os lados; Indol: reação positiva = negra; Lisina: as enterobactérias capazes de descarboxilar a lisina presente no meio, primeiro descarboxila a glicose, onde reação positiva = qualquer cor diferente do amarelo; Reação negativo = amarelo claro. Uréia: reação positiva = alcaliniza a base do tubo provocando viragem do indicador para azul.

MEIOS PARA PROVAS DE IDENTIFICAÇÃO Prova do VM: testa a capacidade da bactéria em produzir ácidos orgânicos a partir da fermentação da glicose. Leitura 48 – 72 horas. VM: reação positiva = coloração avermelhada. Prova do VP: as bactérias utilizam à glicose presente no meio liberando um produto que é a acetoína. VP: reação positiva: turvação.

MEIOS PARA PROVAS DE IDENTIFICAÇÃO TSI Verifica se a bactéria degrada carboidratos específicos incorporados ao meiocom ou sem produção de gás. Gás: positivo = formação de bolhas; H2S: positivo = negra. Resultados Vermelho o ápice: fermentação apenas da glicose, lactose e sacarose negativa a base é amarela. Amarelo o ápice: fermentação da glicose, lactose e ou sacarose a base é amarela.

MEIOS PARA PROVAS DE IDENTIFICAÇÃO Caldo indol-uréia Esse caldo tem por finalidade diferenciar as enterobactérias com base na capacidade de produção de indol e de hidrólse da uréia. Interpretação dos resultados Uréia positiva: reação alcalina = vermelha; Uréia negativa = amarelo. Indol: reação positiva = anel avermelhado; Indol negativo = ausência de cor avermelhada.

Testes necessários para a identificação de rotina dos BNFs Tubo de OFglicose (com vaselina); Oxidase; PYR; Lisina; Arginina; TSB para motilidade em lâmina; Indol; Esculina; Disco de polimixina; Tubo com TSI; Placa de Mac Conkey; Tubo com gelatina; DNAse; Tubo com caldo NaCl 6,5%

Colorações diferenciais Reage de modo distinto em diferentes bactérias; Servem para diferenciar as bactérias; Ex.: Gram e BAAR;

BAAR BACILOS ÁLCOOL-ÁCIDO-RESISTENTES; Coram fracamente pelo gram; Ácido micólico de parede; Circundados por uma parede celular hidrofóbica; Resistem a descoloração; Misturas de álcool-ácido usadas na identificação;

Coloração para cápsula Chamada coloração negativa; Método difícil; Durante o procedimento  lavagem retira cápsula;

Coloração para cápsula Cápsulas geralmente não aceitam corantes biológicos; Tinta nanquim;

Coloração de esporos Verde malaquita  corante primário; Lavagem; Safranina  cora o restante da bactéria; Bactéria  verde e rosa;

Coloração dos flagelos Estruturas muitos pequenas; Procedimento delicado para coloração; Usa-se mordente e carbolfucsina; Aumenta o diâmetro dos flagelos  visível ao microscópio óptico;

Recomendações Toda amostra é potencialmente contaminada; Manipulação de material biológico  EPI; Procedimento com risco com respingos  cabine de segurança; Não pipetar com a boca;

Recomendações Não reencapar agulhas; Descartar em recipiente adequado; Material contaminado deve ser descontaminado antes do descarte; Determinar área limpa e contaminada;

Recomendações Limpar e desinfetar todas as áreas de trabalho; Manter bancadas organizadas; Não estocar material contaminado; Tirar jaleco quando sair do setor;

Recomendações Lavar as mãos sempre; Separar materiais em sacos de lixo; Todos os reagentes identificados;

Recomendações Ter manual de procedimento; Estocar inflamáveis  local adequado;

Acidentes Sempre pedir ajuda; Não omitir fatos; Material biológico  superfície  hipoclorito 2%;

Acidentes Material biológico  pele  sabão e álcool 70%; Material biológico no jaleco  lavagem;

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