O documento discute espectrofotometria e métodos de purificação e caracterização de proteínas, incluindo a lei de Lambert-Beer, espectrometria de absorção atômica, diálise, cromatografia em coluna, cromatografia de troca iônica, cromatografia de afinidade, HPLC e eletroforese. Vários métodos geralmente precisam ser usados sequencialmente para purificar completamente uma proteína com base em diferentes propriedades.

1. 1
Espectofotometria,
purificação e
caracterização de
proteínas
2014

2. • Ampla variedade de biomoléculas absorve luz em comprimentos de onda
característicos;
• A medição da luz absorvida por uma biomolécula através do
espectrofotômetro é usada para detectar, identificar e quantificar moléculas
num determinado material biológico;
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• A medida de espectrofotômetro é utilizada para detectar e identificar
moléculas e para medir suas concentrações em solução;
• Ex.: o triptofano absorve luz em 280 nm;
• Para tanto deve-se levar em consideração a Lei de Lambert-Beer.
Absorção de luz por
moléculas: a Lei de
Lambert-Beer

3. Espectrometria de absorção atômica
Definição: Consiste na medida da absorção da energia luminosa
por átomos no estado fundamental nas regiões do visível a
ultravioleta.
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4. A= a.b.c = Log
Io/I
A: absorbância ; a: absortividade; b: percurso ótico; c: concentração molar
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Relação entre radiação e concentração
Lei de Beer
Espectrometria de
absorção atômica

5. • Quanto maior a concentração (c) ou maior o caminho óptico (b)
maior será a absorbância da amostra, por isso geralmente o b é
padronizado em 1 cm.
• Exemplo:
– com base na lei de Lambert-Beer, calcule a absorbância de uma
solução com concentração 0,002 mol L-1 de uma substância com
absortividade molar de 313 L mol-1 cm-1, determinada em uma
célula com 2,00 cm de caminho óptico.
A = a.b.c
A= 313 L mol-1 . 2,00 cm . 0,002 mol L-1
A= 1,252
Lei de Lambert-Beer 5

6. • Toda biomolécula apresenta um comprimento de onda
específico onde a absorção de luz é máxima.
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Pico máximo de
absorção de luz

7.  Proteínas devem ser purificadas para ser caracterizada
quanto as suas propriedades e atividades.
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 Para se estudar uma proteína detalhadamente deve-se
separá-la de outras proteínas em sua forma pura;
Hemoglobina
Trabalhando com
proteínas

8.  Necessário fonte de proteínas (tecido ou células);
 Romper estas células, liberando suas proteínas em uma
solução (extrato bruto);
 Centrifugar se necessário para preparar frações
subcelulares;
 Uma vez com o extrato pronto, diversos métodos estão
disponíveis para a purificação. Exemplos: Diálise,
Fracionamento (cromatografia em coluna,
cromatografia de troca iônica, cromatografia de troca
catiônica, cromatografia de afinidade e cromatografia
líquida de alta eficiência -HPLC).
Purificação de proteínas 8

9.  É um processo que separa proteínas de pequenos solutos
se aproveitando do maior tamanho das proteínas;
 O extrato parcialmente purificado é colocado em um saco
ou tubo feito de uma membrana semi-permeável;
 Ele é suspenso em um volume muito maior de solução
tampão de força iônica apropriada, a membrana permite a
troca de sal e tampão, mas não de proteínas.
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Método de Diálise:
Purificação de
proteínas

10.  É utilizado diferenças na solubilidade proteica, onde a
mesma é reduzida em elevadas concentrações salinas, um
efeito denominado salting out de proteínas;
 As proteínas que então precipitam são removidas
daquelas que permanecem em solução por centrifugação
em baixa velocidade.
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Método de Fracionamento:
Purificação de
proteínas

11.  Tem como base diferenças no tamanho,carga, afinidade
de ligação e outras propriedades;
 Um material sólido poroso com propriedades químicas
apropriadas é mantido em uma coluna, pela qual é
percolada uma solução tampão;
 A solução contendo a proteína depositada no topo da
coluna percola o material sólido poroso dentro da solução
tampão.
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Cromatografia em coluna:
Purificação de
proteínas

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13. Cromatografia de troca iônica:
 Explora as diferenças no sinal e na magnitude da carga
elétrica líquida de proteínas em um dado pH.
 A matriz da coluna é polímero sintético (resina) contendo
grupos carregados ligados (trocadores de cátions ou
trocadoras de ânions);
 A afinidade de cada proteína pelos grupos carregados na
coluna é afetada pelo pH e pela concentração de íons de
sais livres.
 Enquanto a solução contendo proteínas permanece na
coluna, frações deste efluente são coletadas em tubos
teste (cada fração pode ser testada para a presença de
proteína de interesse)
Purificação de proteínas 13

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15. Cromatografia de afinidade:
 Tem como base a afinidade de ligação;
 Os grânulos da coluna possuem um grupo químico
covalentemente ligado (ligante);
 Quando uma mistura de proteinas é adicionada a coluna,
qualquer proteína com afinidade por este ligante se liga
aos grânulos e sua migração através da matriz é retardada;
 As proteínas que não se ligam são lavadas na coluna, e a
proteína ligada é eluida com a solução contendo uma
concentração elevada de sal quanto do ligante livre.
Purificação de proteínas 15

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17. Cromatografia líquida de alta eficiência (HPLC,
high perfomance liquid chromatography):
 Utiliza bombas de alta pressão que aceleram o
movimento das moléculas de proteína através da coluna;
 Ao reduzir o tempo de trânsito na coluna, a HPLC pode
limitar o espalhamento difusional das bandas de proteína
e assim aumentar significativamente a resolução (Ver
cromatografia em coluna).
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Purificação de
proteínas

18.  Baseado em migração de proteínas carregadas em um
campo elétrico;
 A eletrofoese permite a determinação de propriedades
críticas (ponto isoelétrico e massa molecular estimada);
 Para eletroforese de proteínas é utilizado géis de
poliacrilamida (peneira molecular), retardando a
migração de proteínas na proporção de sua relação carga-massa;
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Caracterização por eletroforese:
Caracterização de
proteínas

19.  Um método eletroforético utilizado faz uso do detergente
dodecil sulfato de sódio (SDS, sodium dodecyl sulfate);
 O SDS se liga a grande maioria das proteínas onde
contribui com uma grande carga negativa e conferindo
para cada proteína uma carga-massa semelhante;
 As proteínas são visualizadas pela adição de corantes
(azul de Coomassie) que liga-se as proteínas e não ao
gel.
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 Na eletroforese o SDS separa as proteínas quase
exclusivamente com base na massa molecular;
Caracterização de
proteínas - eletroforese

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21.  Na maioria dos casos vários métodos precisam ser
utilizados sequencialmente para purificar uma proteína
por completo pois cada método separa as proteínas com
base em diferentes propriedades;
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 Diversas estratégias podem ser tentadas até que seja
encontrada a mais eficiente;
 Protocolos de purificação publicados estão disponíveis
para muitos milhares de proteínas;
 Métodos de baixo custo devem ser utilizados primeiro
( volume e número de contaminantes e maior);
 Métodos cromatográficos são impraticáveis nos estágios
iniciais já que a quantidade de meio cromatográfico
cresce com o tamanho da amostra;

22.  Conforme casa passo de purificação é completado, o
tamanho da amostra se torna menor, tornando acessível o
uso de procedimentos cromatográficos.
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Referência
 NELSON, D. L.; COX, M.M. Princípios de Bioquímica
de Lehninger. - 5. ed. -Porto Alegre: Artmed, 2011.