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PROTEÔMICA 13/11/2007
O que é Proteômica? ,[object Object]
A nomenclatura ômica… Genômica DNA (Gene) Genômica Funcional Transcriptômica RNA Proteômica PROTEÍNA Metabolômica METABOLITE Transcrição Tradução Reação  enzimática
 
Lições sobre os Projetos genômicos ,[object Object],[object Object],[object Object],[object Object],[object Object],[object Object],[object Object]
Por que estudar a expressão de proteínas? DNA Transcrito de RNA Primário mRNA mRNA proteína Proteína Controle Transcricional Controle do Proces De RNA Controle Transport RNA mRNA inativo Controle  Degradação RNA Controle de Tradução Controle Pós-Transducional
 
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Background experimental ,[object Object],[object Object],[object Object],[object Object],[object Object],[object Object],[object Object]
A primeira dimensão   (separação por ponto isoelétrico) - Gel com um gradiente de pH imobilizado - Corrente elétrica leva aproteínas carregadas a mover até alcançar o ponto isoelétrico  2D-SDS PAGE gel
Ponto Isoelétrico (pI) ,[object Object],Alto pH: Proteína carregada - Baixo pH: Proteína Carregada + No ponto isoelétrico, a proteína não tem carga e portanto não migra mais no campo elétrico. 4 5 6 7 8 9 10 Gradiente de pH estável
A segunda dimensão   (separação por massa) -pH gel strip e colocado em um gel SDS -SDS desnatura a proteína (movimento somente devido a massa) e elimina carga. 2D-SDS PAGE gel A primeira dimensão   (separação por ponto isoelétrico) - Gel com um gradiente de pH imobilizado - Corrente elétrica leva aproteínas carregadas a mover até alcançar o ponto isoelétrico
2D-SDS PAGE gel
Exemplo de técnica de 2D-gel
Vantagens  vs  Desvantagens ,[object Object],[object Object],[object Object],[object Object],[object Object],[object Object]
Background Experimental Espectometria de Massas
O que é Mass Spec? ,[object Object],[object Object],[object Object],[object Object],[object Object]
Que tipo de informação é gerada? ,[object Object],[object Object],[object Object],[object Object],[object Object]
Como funciona um espectômetro? ,[object Object],[object Object],[object Object],[object Object],[object Object]
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Detecção dos Íons ,[object Object],[object Object]
Espectometria de massas é uma metodologia poderosa para analisar a estrutura de compostos orgânicos, mas tem algumas limitações: Nada pode ser caracterisado se não estiver em uma solução DEVIDAMENTE LIMPA A técnica não tem abilidade de apresentar uma análise seletiva de uma mistura complexa Para moléculas grandes, resultados são difíceis de interpretar.
Tandem MS ou MS/MS  tem 2 mass spec em série: O primeiro (MS1)  é usado para selecionar, de uma fonte primária de íons, aqueles que possuem um  m/z  particular, o qual passa para a região de fragmentação, onde ocorrerá a dissociação. No segundo  (MS2), haverá a análise dos íons gerados.  DE verdade,  MS1 é uma fonte de íons para MS2.  MS2 MS1
Sequenciamento de peptídeos ,[object Object],[object Object],[object Object],[object Object],[object Object]
 
Identificação de proteínas por MS Database of sequences (i.e. SwissProt) Spectrum of fragments generated MATCH Library Artificial spectra built Artificially trypsinated Spot removed from gel Fragmented using trypsin
Como funciona o sequenciamento de proteínas ,[object Object],[object Object],[object Object],[object Object],Ser-Glu-Leu-Ile-Arg-Trp Collision Cell Ser-Glu-Leu-Ile-Arg Ser-Glu-Leu Ser-Glu-Leu-Ile Etc…
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Após a proteômica….. Genômica funcional  ProteinChip TM .
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Espectometria de Massas

  • 2.
  • 3. A nomenclatura ômica… Genômica DNA (Gene) Genômica Funcional Transcriptômica RNA Proteômica PROTEÍNA Metabolômica METABOLITE Transcrição Tradução Reação enzimática
  • 4.  
  • 5.
  • 6. Por que estudar a expressão de proteínas? DNA Transcrito de RNA Primário mRNA mRNA proteína Proteína Controle Transcricional Controle do Proces De RNA Controle Transport RNA mRNA inativo Controle Degradação RNA Controle de Tradução Controle Pós-Transducional
  • 7.  
  • 8.
  • 9.  
  • 10.
  • 11. A primeira dimensão (separação por ponto isoelétrico) - Gel com um gradiente de pH imobilizado - Corrente elétrica leva aproteínas carregadas a mover até alcançar o ponto isoelétrico 2D-SDS PAGE gel
  • 12.
  • 13. A segunda dimensão (separação por massa) -pH gel strip e colocado em um gel SDS -SDS desnatura a proteína (movimento somente devido a massa) e elimina carga. 2D-SDS PAGE gel A primeira dimensão (separação por ponto isoelétrico) - Gel com um gradiente de pH imobilizado - Corrente elétrica leva aproteínas carregadas a mover até alcançar o ponto isoelétrico
  • 15. Exemplo de técnica de 2D-gel
  • 16.
  • 18.
  • 19.
  • 20.
  • 21.
  • 22.  
  • 23. Esquema típico de um TOF-MS
  • 24.
  • 25.
  • 26.
  • 27. Espectometria de massas é uma metodologia poderosa para analisar a estrutura de compostos orgânicos, mas tem algumas limitações: Nada pode ser caracterisado se não estiver em uma solução DEVIDAMENTE LIMPA A técnica não tem abilidade de apresentar uma análise seletiva de uma mistura complexa Para moléculas grandes, resultados são difíceis de interpretar.
  • 28. Tandem MS ou MS/MS tem 2 mass spec em série: O primeiro (MS1) é usado para selecionar, de uma fonte primária de íons, aqueles que possuem um m/z particular, o qual passa para a região de fragmentação, onde ocorrerá a dissociação. No segundo (MS2), haverá a análise dos íons gerados. DE verdade, MS1 é uma fonte de íons para MS2. MS2 MS1
  • 29.
  • 30.  
  • 31. Identificação de proteínas por MS Database of sequences (i.e. SwissProt) Spectrum of fragments generated MATCH Library Artificial spectra built Artificially trypsinated Spot removed from gel Fragmented using trypsin
  • 32.
  • 33.
  • 34. Após a proteômica….. Genômica funcional ProteinChip TM .
  • 35.
  • 36.
  • 37.
  • 38.
  • 39.
  • 40.
  • 41.
  • 42.