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Universidade Federal do Pará
Instituto de Ciências da Saúde
Faculdade de Farmácia
Química Farmacêutica Experimental II

Amanda de Almeida
Cíntia Quaresma
Eunice Oliveira
Juliana Hernandez
Tammy Reymão
Thiago Paixão
Introdução
Cromatografia:

É um método físico-químico de separação dos
componentes de uma mistura, realizada através da
distribuição desses componentes em duas fases.
Uma das fases permanece estacionária, enquanto
outra se move através dela.

Durante a passagem da fase móvel sobre a estacionária,
os componentes da mistura são distribuídos pelas duas
fase de tal forma que cada um deles é seletivamente
retido pela fase estacionária, resultando em migrações
diferenciais desses compostos.

Thiago
Introdução
Cromatografia:
Chrom = cor + graphe = escrever

O processo não é totalmente dependente da cor, mas
em alguns casos pode basear a identificação dos
constituintes separados.

Separação

Identificação

Quantificação
Thiago
Introdução
Cromatografia – Breve Histórico
O botânico russo Mikhael Tswett em 1906 utilizou o
termo cromatografia pela primeira vez, para
descrever a separação de um extrato vegetal,
utilizando colunas de vidro recheadas com
partículas sólidas, arrastando os componentes
com éter de petróleo.

A época moderna da cromatografia iniciou em
1930, quando Kuhn e Lederer, aperfeiçoaram as
experiências do botânico russo, separando e
identificando as xantófitas da gema do ovo,
usando coluna preenchida com carbonato de
cálcio pulverizado com fase estacionária e éter
de petróleo com fase móvel.
Thiago
Introdução
Cromatografia – Breve Histórico

1938 – Izmailov e Schraiber reintroduziram a CCD em análises de
produtos farmacêuticos, contudo permaneceu subutilizada, até o
desenvolvimento do método de aderir sólido ao suporte, atribuido a
Kirchner, e do método de preparar placas, descrito por Stahl.
1941 - Martin e Synge desenvolveram a cromatografia por partição
(líquido-líquido), que fundamentou o surgimento da CLAE e CG. Eles
receberam em 1962 prêmio Nobel de química pelo método
desenvolvido.

1941 – Hesse e colaboradores desenvolveram a cromatografia gássólido, a partir da separação de dois ácidos graxos sob valor de 100
°C, arrastando sobre a sílica com dióxido de carbono.
Thiago
Introdução
Cromatografia – Breve Histórico

1952- Martin e James descreveram a cromatografia gás líquido;

1954 – Ray desenvolve o detector por condutividade térmica;

1958 – Pretorius e colaborares, juntamente com McWilliams e Dewar,
desenvolveram o detector de ionização em chama;

1958 – Golay introdiziu as colunas capilares em análises por cromatografia
de alta eficiência;
“Estes avanços ampliaram o poder analítico da cromatografia, tornando-a
o método analítico de separação e determinação mais usado do mundo”
Thiago
Introdução
Classificações da Cromatografia:
1. Quanto a forma física:

1.1. Fase estacionária depositada em uma superfície
planar
1.2.1 Cromatografia planar

1.2. Fase estacionária depositada em um tubo
cilíndrico
1.1.1. Cromatografia em coluna
Tipos

Tamanho

Preparativa

6-50 mm

Analíticas

2-6 mm

Microdiâmetro

1-2 mm

Capilares

< 1 mm

Thiago
Introdução
Classificações da Cromatografia:
2. Quanto a fase móvel:
2.1. Gás inerte: cromatografia gasosa
2.2. Líquido: cromatografia líquida
2.3. Vapor pressurizado: cromatografia supercrítica

2.2.1. Cromatográfica líquida em coluna


Clássica: em colunas de vidro, onde a fase móvel e
deslocada sobre a fase estacionaria pela força da
gravidade;



Alta eficiência: em colunas metálicas, onde a fase
móvel é deslocada por pressões elevadas, obtidas
com auxilio de uma bomba de alta pressão.
Thiago
Introdução
Classificações da Cromatografia:

3. Quanto a polaridade das fases:
3.1. Cromatografia gasosa: fase móvel inerte, separação
ocorre devido às interações das molécula da amostra
com a fase estacionária;

3.2. Cromatografia líquida (planar e coluna);
3.2.1. Cromatografia de fase normal: fase estacionária
é mais polar do que a fase móvel

3.2.2. Cromatografia de fase reversa: fase móvel é mais
polar do que a fase estacionária.

Thiago
Introdução
Mecanismo de interação:
Adsorção: CDD, CGS, CLS, CSS

Interação entre o sólido e fase móvel, devido a presença de grupos
ativos em sua superfície. A dessorção do soluto ocorre por
volatilidade (CG) ou solubilidade na fase móvel (CL ou CSS)

Thiago
Introdução
Mecanismo de interação:
Absorção: CP, CGL, CLL

Fase estacionária é um líquido ocorre por absorção ou partição e
baseia-se nas diferentes solubilidades dos componente da amostra
na fase estacionária. A volta dos componentes a fase móvel
depende de sua volatilidade (fase móvel gasosa) ou de sua
solubilidade (fase móvel líquida)
Thiago
Introdução
Mecanismo de interação:
Troca iônica:

A fase estacionária é constituída por um suporte onde são
adicionados grupos ionizáveis: Grupos carregados positivamente,
retendo ânions e grupos carregados negativamente retendo
cátion. A fase móvel é uma solução iônica com propriedades
tamponantes compatível.

Thiago
Introdução
Mecanismo de interação:
Bioafinidade:
Grupos com especificidade
biológica,
quimicamente
ligados ao suporte. Podem ser
antígenos,
substratos
ou
lectinas, que retiram da fase
móvel
somente
os
componente complementares,
os anticorpos, enzimas ou
açúcares, respectivamente.

Thiago
Introdução
Mecanismo de interação:
Exclusão:

Thiago
Cintia
Cromatografia de Papel
 Técnica

simples;

 Pequena

 Boa

quantidade de amostra;

capacidade de resolução,

 Separação

e identificação de compostos polares,
como antibióticos hidrossolúveis, ácidos orgânicos e
íons metálicos.

Cintia
Cromatografia de Papel
É

classificada como de partição líquido-líquido;

Separação

e distribuição depende da
solubilidade;

Geralmente

água é utilizada como fase móvel
e papel (celulose) como fase estacionária.

Cintia
Cromatografia de Papel


A forma mais simples de CP é a cromatografia
ascendente (por capilaridade).

Cintia
Cromatografia de Papel

Cintia
Cromatografia de Papel
Mistura

de componentes coloridos;

Misturas

incolores.

Cintia
Cromatografia de Papel


Procedimento

Cintia
Cromatografia de Papel


A análise qualitativa de uma substância realizase através da cor da mancha e de seu fator de
retardamento, Rf, determinado através da
expressão:
Rf = da/ds

Rf= fator de retenção;
da= distância (cm, mm) percorrida pela
substância;

ds= distância (cm, mm) percorrida pela fase
móvel.
Cintia
Tammy
Cromatografia em Camada Delgada -CCD
Histórico
 1889, Beyerinck - sólidos em camada delgada sobre

vidro;





1938, Izmailov e Schraiber - análise de produtos
farmacêuticos;
1956, Stahl – preparação de placas com

reprodutibilidade.

Definição:
Método físico-químico de separação dos componentes de
uma mistura através da distribuição destes entre duas fases

(móvel e estacionária).
Tammy
Cromatografia em Camada Delgada -CCD



Fase estacionária sólida e fase móvel líquida;
A fase estacionária é constituída de sílica G (fase normal) ou
sílica C18 (fase reversa);
Fase Normal: polaridade
da FE > FM
Fase Reversa: polaridade
da FE< FM



Tammy

A fase móvel é constituída de solventes polares, apolares ou
mistura de ambos (ex: água, etanol, metanol, clorofórmio,
diclorometano, hexano, etc.)
Cromatografia em Camada Delgada -CCD


As placas utilizadas podem ser de folha de alumínio
(manufaturadas na indústria) ou de vidro (preparadas no
próprio laboratório);

Vantagens:
• Uniformes e
homogêneas;
• Promovem
melhor
separação dos
componentes.


Vantagens:
• Baixo custo;
• Fácil preparo.

É necessário ativá-las em estufa antes da aplicação, afim de
remover água e interferentes.
Tammy
Cromatografia em Camada Delgada -CCD
Como ocorre:


Durante a corrida, os componentes da mistura são distribuídos entre
a FM e a FE e cada um deles é retido seletivamente pela FE,
conforme a velocidade com que passam pela mesma. Isso resulta
em alturas diferentes para cada componente.



A cuba deve estar saturada com vapores da fase móvel, para que
ocorra boa migração dos componentes da mistura.
Tammy
Cromatografia em Camada Delgada -CCD
Fator de retenção (Rf):
 Partindo do princípio de que um composto percorre sempre
a mesma distância em relação a frente do solvente, o fator
de retenção é a razão entre estes deslocamentos.


É utilizado para auxiliar a identificação de substâncias,
comparando o Rf obtido com o Rf padrão.

Tammy
Cromatografia em Camada Delgada -CCD
Revelação do cromatograma:
É

necessário proceder esta etapa quando os componentes
migrados são incolores. Para tal, utiliza-se alguns reagentes
para torná-los visíveis.



Podem ser
biológicos.

Físicos:
Luz UV

utilizados

reveladores

Químicos:
Dragendorff
(alcalóides)
NP-PEG
(flavonóides)
FeCL3 (comp
fenólicos)
Rev. Universal
(vapor de iodo)

físicos,

químicos

ou

Biológicos:
Enzimas,
Antibióticos e
Substratos.

Tammy
Cromatografia em Camada Delgada -CCD
Exemplos:

Tammy
Cromatografia em Camada Delgada -CCD
Aplicações:
 Estudos

preliminares
orgânico;

dos

componentes

de

um

extrato

 Investigação

de casos de envenenamento e ingestão de
estimulantes por atletas;

 Estudos

de reações químicas
intermediários estáveis;

 Análise
 Análise

quanto

à presença

de

da pureza de compostos;

da eficiência
cristalização.

de

processos

de

destilação

e

Tammy
Cromatografia em Camada Delgada -CCD
Vantagens:


Fácil execução;



Rapidez;



Menor trajeto da fase móvel ;



Baixo custo;



Versatilidade.

Desvantagens:


Difícil reprodutibilidade;



Difícil determinação precisa do Rf.
Tammy
Eunice
Cromatografia em coluna
•

Citada como o mais
antigo procedimento
cromatográfico

•

Utilizada para
Isolamento de
produtos naturais

•

Purificação de
produtos de reações
químicas

•

Fundamenta-se
basicamente na
polaridade relativa
das moléculas
envolvidas.
Cromatografia líquida clássica
•

Consiste em uma coluna de
vidro, metal ou plástico, de
diâmetros variados;

•

possuem uma torneira em sua
extremidade inferior.

•

Esses cilindros são preenchidos
por um adsorvente

•

colocado na coluna
diretamente ou suspendido em
um solvente adequado.
Adsorventes mais utilizados
Sílica e alumina

Suporte para fase estacionária
líquida
Líquida: separação por adsorção
Sólida: separação por partição
Cromatografia em Coluna
•

A fase estacionária é
mantida em um tubo
estreito e a fase móvel,
forçada através do tubo
sob
pressão
ou
por
gravidade.

•

A
substância
a
ser
separada ou analisada é
colocada na coluna parte
superior e o eluente é
vertido após.

•

A adição de sílica deve ser
feita com a torneira semiaberta.

•

O adsorvente é adicionado
lentamente à coluna fixada
na posição vertical de
modo a se obter uma
compactação uniforme.
Cromatografia de Coluna
•

A velocidade na qual
um composto passa
pela coluna depende
da polaridade da fase
estacionária

•

solvente utilizado como
eluente.

•

Se o composto é mais
atraído pela fase
estacionária do que
pelo solvente, ele
migrará mais lentamente
da coluna.

•

composto tiver maior
afinidade pelo solvente
ele migrará mais
rapidamente da coluna
O êxito da cromatografia de
coluna
•

solvente adequado

•

É possível visualizar a
separação dos
componentes de uma
mistura observando o
desenvolvimento de
manchas diferentes na
coluna

•

Através da luz
ultravioleta

•

necessário o
acompanhamento da
separação dos
componentes pela
técnica de
cromatografia em
coluna delgada (CCD).
Amanda
Cromatografia Gasosa

Aplicabilidade
Quais misturas podem ser separadas por CG?

Para uma substância qualquer poder ser “arrastada” por
um fluxo de um gás ela deve ser dissolver pelo menos
parcialmente nesse gás.

Misturas cujos volumes sejam voláteis e termicamente
estável.
Amanda
Cromatografia Gasosa

Cromatógrafo a gás

Amanda
Cromatografia Gasosa
Instrumentação
Gás de arraste

Fase Móvel em CG: NÃO interage com a amostra apenas a
carrega através da coluna.
Requisitos:
INERTE - Não deve reagir com a amostra, fase estacionária ou
superfícies do instrumento.
PURO - Deve ser isento de impurezas que possam degradar a
fase estacionária.
Impurezas típicas em gases e seus efeitos:
 H2O,

DCE)

O2 (oxida / hidrolisa algumas FE; incompatíveis com

 Hidrocarbonetos

(ruído no sinal de DIC)

Amanda
Cromatografia Gasosa
Instrumentação
Injetores
 Parte

do cromatógrafo a gás onde a amostra é introduzida

―

Vaporiza amostra (solvente + compostos alvo)

―

Mistura vapor com fase móvel (gás de arraste)

―

Transfere vapor para dentro da coluna

 Dispositivos

de Injeção

―

Injetores para colunas empacotadas

―

Injetores capilares

―

Válvulas de amostragem de gás
Amanda
Cromatografia Gasosa

Instrumentação
Injetores
1.

Septo (silicone)

2.

Alimentação de gás de arraste

3.

Bloco metálico aquecido

4.

Ponta da coluna cromatográfica

Amanda
Cromatografia Gasosa

Colunas: Definições básicas
A

coluna é a essência do sistema cromatográfico,

pois

é

nela

que

ocorrerá

a

separação

dos

componentes da amostra.
 Fase

estacionária (suporte sólido e fase líquida)

 Tubo

(material, comprimento e diâmetro)

 Colunas

empacotadas e capilares
Amanda
Cromatografia Gasosa
Colunas: Definições básicas

Amanda
Cromatografia Gasosa
Colunas: Definições básicas
Vantagens

Desvantagens

• Mais econômica

• Se o material de enchimento
não for colocado na coluna de
forma compacta e uniforme, os
espaços
vazios
resultantes
funcionarão como câmaras de
diluição da amostra.

Empacotadas

• Maior capacidade de carga
• Maior quantidade de amostra

• Menor eficiência
• Análise mais lenta

Capilares

• Maior comprimento => maior eficiência • Capacidade de processamento
da
amostra
inferior.
Satura
• Separação de misturas complexas
rapidamente.
• Análise mais rápida

• Menor quantidade de amostra

• Maior separação

Amanda
Cromatografia Gasosa
Temperatura da coluna
Analises isotérmicas
 Amostras

com PE elevado não eluem

 Primeiros

picos: agudos, pouco resolvidos

 Posteriores:

baixos, largos, muito resolvidos

Amanda
Cromatografia Gasosa
Temperatura da coluna
Analises com Programação de Temperatura


Determinação das condições de analise, inclusive isotérmicas



Tempo de analise reduzido



Limite de detecção e precisão da medida do pico são melhorados



Velocidade de injeção não precisa ser tão rápida



Transformações químicas dos componentes instáveis são minimizadas

Amanda
Cromatografia Gasosa
Principais detectores utilizados em CG
1.

Detector de condutividade térmica (TCD): universal
Medida baseada na condutividade térmica de um filamento de W

―

Não é destrutivo

―

Não compatível com gases oxidantes

―

Menos sensível

―

Importante para substâncias que não geram sinal em outros

detectores, como CO2

Amanda
Cromatografia Gasosa
Principais detectores utilizados em CG
2.

Detector por ionização em chama (FID): seletivo – universal
Medida baseada na variação de uma corrente devido à influência de
íons e elétrons formados numa chama de H2/ar

―

Destrutivo

―

Resposta apenas a compostos orgânicos
Amanda
Cromatografia Gasosa
Principais detectores utilizados em CG
3.

Detector de captura eletrônica (ECD): seletivo

―

Não destrutivo

―

Medida baseada na variação de uma corrente de “elétrons
lentos” devido à afinidade dos organohalogenados por elétrons.
Provenientes da interação de uma fonte radioativa com o gás
carregador (3H ou 63Ni)
Elétrons são capturados pelos sítios halogenados

- APLICAÇÃO IMPORTANTE: determinação de resíduos de pesticidas

Amanda
Cromatografia Gasosa
Análise Qualitativa
Identificação individual das
espécies contidas na amostra

Aplicações qualitativas
Determinação da identidade
da amostra propriamente dita

Fontes de Informações Qualitativas


Retenção – uso de dados de retenção para sua
identificação

 Detecção

– detectores que fornecem informações
estruturais sobre as substâncias eluidas.
Amanda
Cromatografia Gasosa
CG: Considerações
CG - TÉCNICA RELATIVAMENTE SIMPLES MAS:
•

Exige escolha cuidadosa da configuração instrumental (injetor,
coluna, detector);

•

Condições instrumentais devem ser otimizadas (vazão do gás,
temperatura, ...).

USANDO DETECTORES NÃO DESTRUTIVOS:
•

O eluato ainda pode ser reanalisado

•

acopla-se à saída do detector um outro instrumento

•

Ex: GC-MS (Espectrômetro de massas como “detector”)

•

Medida baseada na razão massa-carga das substâncias que
saem da coluna → confirmação de resultados e aumento da
sensibilidade.

Amanda
Cromatografia Líquida de
Alta Eficiência (CLAE)
O que é?
É uma técnica utilizada para separar e determinar espécies em uma
grande variedade de materiais orgânicos, inorgânicos e biológicos.

Como funciona?
É um tipo de cromatografia líquida que emprega pequenas colunas,
recheadas de materiais especialmente preparados e uma fase móvel
(solvente) que é eluída sobre altas pressões.

“Ela tem a capacidade de realizar separações e análises quantitativas
de uma grande quantidade de compostos presentes em vários tipos de
amostras, com alta resolução, eficiência e sensibilidade”.

Juliana
Cromatografia Líquida de
Alta Eficiência (CLAE)
Química Forense
(metabólitos de drogas)

Bioquímica (proteínas,
aminoácidos, esteroides)
Ciências ambientais
Alimentos (corantes artificiais,
aflatoxicinas, aditivos,
antioxidantes)
Farmacologia (fármacos)
Toxicologia (pesticidas)
Juliana
Cromatografia Líquida de
Alta Eficiência (CLAE)
Mecanismo

Juliana

Requer somente que
a amostra seja solúvel
na F.M.

F.E. é constituída de partículas sólidas empacotadas em uma
coluna, a qual é atravessada pela fase móvel por alta pressão.
Cromatografia Líquida de
Alta Eficiência (CLAE)

Esquema do CLAE

FASE MÓVEL
F.E

Juliana
Cromatografia Líquida de
Alta Eficiência (CLAE)
Coluna (Fase estacionária)
-Aço inoxidável 316 tratado;
-O comprimento das colunas
variam de 10-30 cm;

-Na CLAE emprega-se um
coluna fechada, reaproveitável;
portanto, até centenas de
separações individuais podem
ser realizadas com a mesma
coluna.

Colunas curtas e com paredes espessas a
fim de evitar deformidades com a alta P

F. E. (poder de retenção): sílica > amino > diol > ciano
Juliana
Cromatografia Líquida de
Alta Eficiência (CLAE)
Coluna (Fase estacionária)
Classificação pela polaridade:

Cromatografia
em
FASE NORMAL:

Cromatografia
em
FASE REVERSA:

A fase estacionária é
muito polar.

A fase estacionária é
de baixa polaridade

Sílica gel

Sílica ligada a C18
Juliana
Cromatografia Líquida de
Alta Eficiência (CLAE)
Cromatografia em FASE NORMAL:

Polaridade

Juliana
Juliana

Cromatografia Líquida de
Alta Eficiência (CLAE)
Pré-coluna (Guard column)
Instalada entre o injetor e a coluna;
(Devem ser substituídas regularmente)
Função:
-Remover partículas;

-Remover substâncias que teriam forte interação com a
coluna;
-Remover substâncias que possam precipitar quando em
contato com a F.M. e F.E.;
De forma geral, AUMENTAM A VIDA ÚTIL DAS COLUNAS.
Cromatografia Líquida de
Alta Eficiência (CLAE)
Cuidados com a coluna (F.E.)
 Manter a coluna sempre tampada;
Evitar choques de pressão, térmicos e mecânicos;
 Usar pré-coluna (guard column);
 Usar solventes ultrafiltrados;

 Pré-tratamento das amostras deve considerar eliminação
de partículas e impurezas que possam ser adsorvidos;
 Obedecer faixa de pH em que a F.E. é estável;
 Eliminar sais, tampões e aditivos de F.M. antes de
armazenar a coluna.
Juliana
Juliana

Cromatografia Líquida de
Alta Eficiência (CLAE)

Bombas de alta pressão
Permitem vencer a resistência à passagem da
F.M. exercida pelas partículas da F.E.
‐ Função: proporcionar fluxo constante e reprodutível
de F.M. a todo o sistema.
CARACTERÍSTICAS DESEJÁVEIS:
‐ Fluxo precisos e exatos, vazão contínua e livre de pulsações;
‐ Resposta rápida a alterações no fluxo e composição da F.M.
‐ Pressão máxima: 700 atm (6.000 psi - libras/polegadas quadradas)
‐ Maior parte construída em aço inox 316; outros materiais: titânio, peek,
teflon
‐ Inércia química a solventes comuns, resistência a corrosão;
‐ manutenção simples.
Cromatografia Líquida de
Alta Eficiência (CLAE)
Solventes (Fase móvel)

Juliana
Cromatografia Líquida de
Alta Eficiência (CLAE)
 Eluição
Isocrática:

Mesma composição de fase móvel durante a eluição. Único solvente
na F.M.

Ex: Metanol/água 80:20 (v/v)

Gradiente:

Composição da fase móvel varia durante a eluição. É uma mistura de
solventes ou a mudança de solvente com o tempo.
Utilizado na separação de misturas complexas com diferentes funções
químicas ou na padronização.

Juliana
Cromatografia Líquida de
Alta Eficiência (CLAE)
Sistemas de Introdução de Amostras (INJETORES)
O método mais empregado de introdução da amostra em
cromatografia líquida é baseado em um sistema com alça de
amostragem.
Frequentemente as alças intercambiáveis estão disponíveis para
permitir a escolha do volume da amostra de 5 a 500 µL.

válvula de 6 pórticos (orifícios)
Juliana
Cromatografia Líquida de
Alta Eficiência (CLAE)
Detectores
Função do detector: identificar a presença de substâncias de interesse que
estejam eluindo da coluna cromatográfica, proporcionando uma
identificação e quantificação continua dos componentes da amostra.
Característica desejáveis:
O detector deve ser
pequeno e compatível
com a vazão de
líquido.
O detector a ser
empregado vai
depender da natureza
da amostra.

Juliana

- alta sensibilidade e baixo limite de
detecção
- ampla faixa de linearidade
- confiável e reprodutível
-fácil de operar e manter
-informação qualitativa e quantitativa
-não destruição do soluto
-insensibilidade a mudanças na FM e de T
- resposta rápida e cte a alterações das [ ]
dos solutos
-baixo nível de ruído
Juliana

Cromatografia Líquida de
Alta Eficiência (CLAE)
Tipos de detectores

-Detectores baseados na absorção de luz UV/VIS (mais amplamente
empregados - radiação ultravioleta (190 - 400 nm) ou visível (400 - 800
nm);
-Detector no UV/VIS com arranjo de fotodiodos (DAD) (a bsorbância de
uma amostra pode ser determinada em todos os λ de modo Simultâneo)
-Detectores baseados na fluorescência (> sensibilidade UV )
-Detectores baseados no espalhamento da luz
-Detectores baseados no índice de refração

-Detectores eletroquímicos (+utilizado para fluídos corpóreos e produtos
naturais)
-Espectrômetro de massas (HPLC‐MS/MS)
Cromatografia Líquida de
Alta Eficiência (CLAE)
Tipos de CLAE
 Cromatografia de alta eficiência por partição (a fase estacionária
é um segundo líquido que é imiscível com o líquido da fase móvel)
Cromatografia líquida com fase ligada
Retido por meio de ligações químicas
Cromatografia líquido-líquido
O líquido é imobilizado por adsorção física

 Cromatografia de alta eficiência por adsorção
A fase estacionária, nesse caso, é a superfície de um sólido polar
finamente dividido.

Juliana
Cromatografia Líquida de
Alta Eficiência (CLAE)
Tipos de CLAE
Cromatografia por troca iônica
Cromatografia por exclusão e por tamanho
Cromatografia por afinidade

Cromatografia quiral

Juliana
Cromatografia Líquida de
Alta Eficiência (CLAE)
Vantagens x Desvantagens
F.E. é utilizada várias vezes

Alto Custo do equipamento

Versatilidade

Alto custo de manutenção do

Tempo reduzido de análise

equipamento

Alta resolução

Necessita de experiência do

Análise qualitativa

operador

Resultados quantitativos
Detectabilidade
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Juliana

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MÉTODOS CROMATOGRÁFICOS (Cromatografia de papel, Cromatografia de camada delgada, Cromatografia de coluna, Cromatografia gasosa, Cromatografia líquida de alta eficiência CLAE (HPLC)

  • 1. Universidade Federal do Pará Instituto de Ciências da Saúde Faculdade de Farmácia Química Farmacêutica Experimental II Amanda de Almeida Cíntia Quaresma Eunice Oliveira Juliana Hernandez Tammy Reymão Thiago Paixão
  • 2. Introdução Cromatografia: É um método físico-químico de separação dos componentes de uma mistura, realizada através da distribuição desses componentes em duas fases. Uma das fases permanece estacionária, enquanto outra se move através dela. Durante a passagem da fase móvel sobre a estacionária, os componentes da mistura são distribuídos pelas duas fase de tal forma que cada um deles é seletivamente retido pela fase estacionária, resultando em migrações diferenciais desses compostos. Thiago
  • 3. Introdução Cromatografia: Chrom = cor + graphe = escrever O processo não é totalmente dependente da cor, mas em alguns casos pode basear a identificação dos constituintes separados. Separação Identificação Quantificação Thiago
  • 4. Introdução Cromatografia – Breve Histórico O botânico russo Mikhael Tswett em 1906 utilizou o termo cromatografia pela primeira vez, para descrever a separação de um extrato vegetal, utilizando colunas de vidro recheadas com partículas sólidas, arrastando os componentes com éter de petróleo. A época moderna da cromatografia iniciou em 1930, quando Kuhn e Lederer, aperfeiçoaram as experiências do botânico russo, separando e identificando as xantófitas da gema do ovo, usando coluna preenchida com carbonato de cálcio pulverizado com fase estacionária e éter de petróleo com fase móvel. Thiago
  • 5. Introdução Cromatografia – Breve Histórico 1938 – Izmailov e Schraiber reintroduziram a CCD em análises de produtos farmacêuticos, contudo permaneceu subutilizada, até o desenvolvimento do método de aderir sólido ao suporte, atribuido a Kirchner, e do método de preparar placas, descrito por Stahl. 1941 - Martin e Synge desenvolveram a cromatografia por partição (líquido-líquido), que fundamentou o surgimento da CLAE e CG. Eles receberam em 1962 prêmio Nobel de química pelo método desenvolvido. 1941 – Hesse e colaboradores desenvolveram a cromatografia gássólido, a partir da separação de dois ácidos graxos sob valor de 100 °C, arrastando sobre a sílica com dióxido de carbono. Thiago
  • 6. Introdução Cromatografia – Breve Histórico 1952- Martin e James descreveram a cromatografia gás líquido; 1954 – Ray desenvolve o detector por condutividade térmica; 1958 – Pretorius e colaborares, juntamente com McWilliams e Dewar, desenvolveram o detector de ionização em chama; 1958 – Golay introdiziu as colunas capilares em análises por cromatografia de alta eficiência; “Estes avanços ampliaram o poder analítico da cromatografia, tornando-a o método analítico de separação e determinação mais usado do mundo” Thiago
  • 7. Introdução Classificações da Cromatografia: 1. Quanto a forma física: 1.1. Fase estacionária depositada em uma superfície planar 1.2.1 Cromatografia planar 1.2. Fase estacionária depositada em um tubo cilíndrico 1.1.1. Cromatografia em coluna Tipos Tamanho Preparativa 6-50 mm Analíticas 2-6 mm Microdiâmetro 1-2 mm Capilares < 1 mm Thiago
  • 8. Introdução Classificações da Cromatografia: 2. Quanto a fase móvel: 2.1. Gás inerte: cromatografia gasosa 2.2. Líquido: cromatografia líquida 2.3. Vapor pressurizado: cromatografia supercrítica 2.2.1. Cromatográfica líquida em coluna  Clássica: em colunas de vidro, onde a fase móvel e deslocada sobre a fase estacionaria pela força da gravidade;  Alta eficiência: em colunas metálicas, onde a fase móvel é deslocada por pressões elevadas, obtidas com auxilio de uma bomba de alta pressão. Thiago
  • 9. Introdução Classificações da Cromatografia: 3. Quanto a polaridade das fases: 3.1. Cromatografia gasosa: fase móvel inerte, separação ocorre devido às interações das molécula da amostra com a fase estacionária; 3.2. Cromatografia líquida (planar e coluna); 3.2.1. Cromatografia de fase normal: fase estacionária é mais polar do que a fase móvel 3.2.2. Cromatografia de fase reversa: fase móvel é mais polar do que a fase estacionária. Thiago
  • 10.
  • 11. Introdução Mecanismo de interação: Adsorção: CDD, CGS, CLS, CSS Interação entre o sólido e fase móvel, devido a presença de grupos ativos em sua superfície. A dessorção do soluto ocorre por volatilidade (CG) ou solubilidade na fase móvel (CL ou CSS) Thiago
  • 12. Introdução Mecanismo de interação: Absorção: CP, CGL, CLL Fase estacionária é um líquido ocorre por absorção ou partição e baseia-se nas diferentes solubilidades dos componente da amostra na fase estacionária. A volta dos componentes a fase móvel depende de sua volatilidade (fase móvel gasosa) ou de sua solubilidade (fase móvel líquida) Thiago
  • 13. Introdução Mecanismo de interação: Troca iônica: A fase estacionária é constituída por um suporte onde são adicionados grupos ionizáveis: Grupos carregados positivamente, retendo ânions e grupos carregados negativamente retendo cátion. A fase móvel é uma solução iônica com propriedades tamponantes compatível. Thiago
  • 14. Introdução Mecanismo de interação: Bioafinidade: Grupos com especificidade biológica, quimicamente ligados ao suporte. Podem ser antígenos, substratos ou lectinas, que retiram da fase móvel somente os componente complementares, os anticorpos, enzimas ou açúcares, respectivamente. Thiago
  • 17. Cromatografia de Papel  Técnica simples;  Pequena  Boa quantidade de amostra; capacidade de resolução,  Separação e identificação de compostos polares, como antibióticos hidrossolúveis, ácidos orgânicos e íons metálicos. Cintia
  • 18. Cromatografia de Papel É classificada como de partição líquido-líquido; Separação e distribuição depende da solubilidade; Geralmente água é utilizada como fase móvel e papel (celulose) como fase estacionária. Cintia
  • 19. Cromatografia de Papel  A forma mais simples de CP é a cromatografia ascendente (por capilaridade). Cintia
  • 21. Cromatografia de Papel Mistura de componentes coloridos; Misturas incolores. Cintia
  • 23. Cromatografia de Papel  A análise qualitativa de uma substância realizase através da cor da mancha e de seu fator de retardamento, Rf, determinado através da expressão: Rf = da/ds Rf= fator de retenção; da= distância (cm, mm) percorrida pela substância; ds= distância (cm, mm) percorrida pela fase móvel. Cintia
  • 24. Tammy
  • 25. Cromatografia em Camada Delgada -CCD Histórico  1889, Beyerinck - sólidos em camada delgada sobre vidro;   1938, Izmailov e Schraiber - análise de produtos farmacêuticos; 1956, Stahl – preparação de placas com reprodutibilidade. Definição: Método físico-químico de separação dos componentes de uma mistura através da distribuição destes entre duas fases (móvel e estacionária). Tammy
  • 26. Cromatografia em Camada Delgada -CCD   Fase estacionária sólida e fase móvel líquida; A fase estacionária é constituída de sílica G (fase normal) ou sílica C18 (fase reversa); Fase Normal: polaridade da FE > FM Fase Reversa: polaridade da FE< FM  Tammy A fase móvel é constituída de solventes polares, apolares ou mistura de ambos (ex: água, etanol, metanol, clorofórmio, diclorometano, hexano, etc.)
  • 27. Cromatografia em Camada Delgada -CCD  As placas utilizadas podem ser de folha de alumínio (manufaturadas na indústria) ou de vidro (preparadas no próprio laboratório); Vantagens: • Uniformes e homogêneas; • Promovem melhor separação dos componentes.  Vantagens: • Baixo custo; • Fácil preparo. É necessário ativá-las em estufa antes da aplicação, afim de remover água e interferentes. Tammy
  • 28. Cromatografia em Camada Delgada -CCD Como ocorre:  Durante a corrida, os componentes da mistura são distribuídos entre a FM e a FE e cada um deles é retido seletivamente pela FE, conforme a velocidade com que passam pela mesma. Isso resulta em alturas diferentes para cada componente.  A cuba deve estar saturada com vapores da fase móvel, para que ocorra boa migração dos componentes da mistura. Tammy
  • 29. Cromatografia em Camada Delgada -CCD Fator de retenção (Rf):  Partindo do princípio de que um composto percorre sempre a mesma distância em relação a frente do solvente, o fator de retenção é a razão entre estes deslocamentos.  É utilizado para auxiliar a identificação de substâncias, comparando o Rf obtido com o Rf padrão. Tammy
  • 30. Cromatografia em Camada Delgada -CCD Revelação do cromatograma: É necessário proceder esta etapa quando os componentes migrados são incolores. Para tal, utiliza-se alguns reagentes para torná-los visíveis.  Podem ser biológicos. Físicos: Luz UV utilizados reveladores Químicos: Dragendorff (alcalóides) NP-PEG (flavonóides) FeCL3 (comp fenólicos) Rev. Universal (vapor de iodo) físicos, químicos ou Biológicos: Enzimas, Antibióticos e Substratos. Tammy
  • 31. Cromatografia em Camada Delgada -CCD Exemplos: Tammy
  • 32. Cromatografia em Camada Delgada -CCD Aplicações:  Estudos preliminares orgânico; dos componentes de um extrato  Investigação de casos de envenenamento e ingestão de estimulantes por atletas;  Estudos de reações químicas intermediários estáveis;  Análise  Análise quanto à presença de da pureza de compostos; da eficiência cristalização. de processos de destilação e Tammy
  • 33. Cromatografia em Camada Delgada -CCD Vantagens:  Fácil execução;  Rapidez;  Menor trajeto da fase móvel ;  Baixo custo;  Versatilidade. Desvantagens:  Difícil reprodutibilidade;  Difícil determinação precisa do Rf. Tammy
  • 35. Cromatografia em coluna • Citada como o mais antigo procedimento cromatográfico • Utilizada para Isolamento de produtos naturais • Purificação de produtos de reações químicas • Fundamenta-se basicamente na polaridade relativa das moléculas envolvidas.
  • 36. Cromatografia líquida clássica • Consiste em uma coluna de vidro, metal ou plástico, de diâmetros variados; • possuem uma torneira em sua extremidade inferior. • Esses cilindros são preenchidos por um adsorvente • colocado na coluna diretamente ou suspendido em um solvente adequado.
  • 37. Adsorventes mais utilizados Sílica e alumina Suporte para fase estacionária líquida Líquida: separação por adsorção Sólida: separação por partição
  • 38. Cromatografia em Coluna • A fase estacionária é mantida em um tubo estreito e a fase móvel, forçada através do tubo sob pressão ou por gravidade. • A substância a ser separada ou analisada é colocada na coluna parte superior e o eluente é vertido após. • A adição de sílica deve ser feita com a torneira semiaberta. • O adsorvente é adicionado lentamente à coluna fixada na posição vertical de modo a se obter uma compactação uniforme.
  • 39. Cromatografia de Coluna • A velocidade na qual um composto passa pela coluna depende da polaridade da fase estacionária • solvente utilizado como eluente. • Se o composto é mais atraído pela fase estacionária do que pelo solvente, ele migrará mais lentamente da coluna. • composto tiver maior afinidade pelo solvente ele migrará mais rapidamente da coluna
  • 40. O êxito da cromatografia de coluna • solvente adequado • É possível visualizar a separação dos componentes de uma mistura observando o desenvolvimento de manchas diferentes na coluna • Através da luz ultravioleta • necessário o acompanhamento da separação dos componentes pela técnica de cromatografia em coluna delgada (CCD).
  • 42. Cromatografia Gasosa Aplicabilidade Quais misturas podem ser separadas por CG? Para uma substância qualquer poder ser “arrastada” por um fluxo de um gás ela deve ser dissolver pelo menos parcialmente nesse gás. Misturas cujos volumes sejam voláteis e termicamente estável. Amanda
  • 44. Cromatografia Gasosa Instrumentação Gás de arraste Fase Móvel em CG: NÃO interage com a amostra apenas a carrega através da coluna. Requisitos: INERTE - Não deve reagir com a amostra, fase estacionária ou superfícies do instrumento. PURO - Deve ser isento de impurezas que possam degradar a fase estacionária. Impurezas típicas em gases e seus efeitos:  H2O, DCE) O2 (oxida / hidrolisa algumas FE; incompatíveis com  Hidrocarbonetos (ruído no sinal de DIC) Amanda
  • 45. Cromatografia Gasosa Instrumentação Injetores  Parte do cromatógrafo a gás onde a amostra é introduzida ― Vaporiza amostra (solvente + compostos alvo) ― Mistura vapor com fase móvel (gás de arraste) ― Transfere vapor para dentro da coluna  Dispositivos de Injeção ― Injetores para colunas empacotadas ― Injetores capilares ― Válvulas de amostragem de gás Amanda
  • 46. Cromatografia Gasosa Instrumentação Injetores 1. Septo (silicone) 2. Alimentação de gás de arraste 3. Bloco metálico aquecido 4. Ponta da coluna cromatográfica Amanda
  • 47. Cromatografia Gasosa Colunas: Definições básicas A coluna é a essência do sistema cromatográfico, pois é nela que ocorrerá a separação dos componentes da amostra.  Fase estacionária (suporte sólido e fase líquida)  Tubo (material, comprimento e diâmetro)  Colunas empacotadas e capilares Amanda
  • 49. Cromatografia Gasosa Colunas: Definições básicas Vantagens Desvantagens • Mais econômica • Se o material de enchimento não for colocado na coluna de forma compacta e uniforme, os espaços vazios resultantes funcionarão como câmaras de diluição da amostra. Empacotadas • Maior capacidade de carga • Maior quantidade de amostra • Menor eficiência • Análise mais lenta Capilares • Maior comprimento => maior eficiência • Capacidade de processamento da amostra inferior. Satura • Separação de misturas complexas rapidamente. • Análise mais rápida • Menor quantidade de amostra • Maior separação Amanda
  • 50. Cromatografia Gasosa Temperatura da coluna Analises isotérmicas  Amostras com PE elevado não eluem  Primeiros picos: agudos, pouco resolvidos  Posteriores: baixos, largos, muito resolvidos Amanda
  • 51. Cromatografia Gasosa Temperatura da coluna Analises com Programação de Temperatura  Determinação das condições de analise, inclusive isotérmicas  Tempo de analise reduzido  Limite de detecção e precisão da medida do pico são melhorados  Velocidade de injeção não precisa ser tão rápida  Transformações químicas dos componentes instáveis são minimizadas Amanda
  • 52. Cromatografia Gasosa Principais detectores utilizados em CG 1. Detector de condutividade térmica (TCD): universal Medida baseada na condutividade térmica de um filamento de W ― Não é destrutivo ― Não compatível com gases oxidantes ― Menos sensível ― Importante para substâncias que não geram sinal em outros detectores, como CO2 Amanda
  • 53. Cromatografia Gasosa Principais detectores utilizados em CG 2. Detector por ionização em chama (FID): seletivo – universal Medida baseada na variação de uma corrente devido à influência de íons e elétrons formados numa chama de H2/ar ― Destrutivo ― Resposta apenas a compostos orgânicos Amanda
  • 54. Cromatografia Gasosa Principais detectores utilizados em CG 3. Detector de captura eletrônica (ECD): seletivo ― Não destrutivo ― Medida baseada na variação de uma corrente de “elétrons lentos” devido à afinidade dos organohalogenados por elétrons. Provenientes da interação de uma fonte radioativa com o gás carregador (3H ou 63Ni) Elétrons são capturados pelos sítios halogenados - APLICAÇÃO IMPORTANTE: determinação de resíduos de pesticidas Amanda
  • 55. Cromatografia Gasosa Análise Qualitativa Identificação individual das espécies contidas na amostra Aplicações qualitativas Determinação da identidade da amostra propriamente dita Fontes de Informações Qualitativas  Retenção – uso de dados de retenção para sua identificação  Detecção – detectores que fornecem informações estruturais sobre as substâncias eluidas. Amanda
  • 56. Cromatografia Gasosa CG: Considerações CG - TÉCNICA RELATIVAMENTE SIMPLES MAS: • Exige escolha cuidadosa da configuração instrumental (injetor, coluna, detector); • Condições instrumentais devem ser otimizadas (vazão do gás, temperatura, ...). USANDO DETECTORES NÃO DESTRUTIVOS: • O eluato ainda pode ser reanalisado • acopla-se à saída do detector um outro instrumento • Ex: GC-MS (Espectrômetro de massas como “detector”) • Medida baseada na razão massa-carga das substâncias que saem da coluna → confirmação de resultados e aumento da sensibilidade. Amanda
  • 57.
  • 58. Cromatografia Líquida de Alta Eficiência (CLAE) O que é? É uma técnica utilizada para separar e determinar espécies em uma grande variedade de materiais orgânicos, inorgânicos e biológicos. Como funciona? É um tipo de cromatografia líquida que emprega pequenas colunas, recheadas de materiais especialmente preparados e uma fase móvel (solvente) que é eluída sobre altas pressões. “Ela tem a capacidade de realizar separações e análises quantitativas de uma grande quantidade de compostos presentes em vários tipos de amostras, com alta resolução, eficiência e sensibilidade”. Juliana
  • 59. Cromatografia Líquida de Alta Eficiência (CLAE) Química Forense (metabólitos de drogas) Bioquímica (proteínas, aminoácidos, esteroides) Ciências ambientais Alimentos (corantes artificiais, aflatoxicinas, aditivos, antioxidantes) Farmacologia (fármacos) Toxicologia (pesticidas) Juliana
  • 60. Cromatografia Líquida de Alta Eficiência (CLAE) Mecanismo Juliana Requer somente que a amostra seja solúvel na F.M. F.E. é constituída de partículas sólidas empacotadas em uma coluna, a qual é atravessada pela fase móvel por alta pressão.
  • 61. Cromatografia Líquida de Alta Eficiência (CLAE) Esquema do CLAE FASE MÓVEL F.E Juliana
  • 62. Cromatografia Líquida de Alta Eficiência (CLAE) Coluna (Fase estacionária) -Aço inoxidável 316 tratado; -O comprimento das colunas variam de 10-30 cm; -Na CLAE emprega-se um coluna fechada, reaproveitável; portanto, até centenas de separações individuais podem ser realizadas com a mesma coluna. Colunas curtas e com paredes espessas a fim de evitar deformidades com a alta P F. E. (poder de retenção): sílica > amino > diol > ciano Juliana
  • 63. Cromatografia Líquida de Alta Eficiência (CLAE) Coluna (Fase estacionária) Classificação pela polaridade: Cromatografia em FASE NORMAL: Cromatografia em FASE REVERSA: A fase estacionária é muito polar. A fase estacionária é de baixa polaridade Sílica gel Sílica ligada a C18 Juliana
  • 64. Cromatografia Líquida de Alta Eficiência (CLAE) Cromatografia em FASE NORMAL: Polaridade Juliana
  • 65. Juliana Cromatografia Líquida de Alta Eficiência (CLAE) Pré-coluna (Guard column) Instalada entre o injetor e a coluna; (Devem ser substituídas regularmente) Função: -Remover partículas; -Remover substâncias que teriam forte interação com a coluna; -Remover substâncias que possam precipitar quando em contato com a F.M. e F.E.; De forma geral, AUMENTAM A VIDA ÚTIL DAS COLUNAS.
  • 66. Cromatografia Líquida de Alta Eficiência (CLAE) Cuidados com a coluna (F.E.)  Manter a coluna sempre tampada; Evitar choques de pressão, térmicos e mecânicos;  Usar pré-coluna (guard column);  Usar solventes ultrafiltrados;  Pré-tratamento das amostras deve considerar eliminação de partículas e impurezas que possam ser adsorvidos;  Obedecer faixa de pH em que a F.E. é estável;  Eliminar sais, tampões e aditivos de F.M. antes de armazenar a coluna. Juliana
  • 67. Juliana Cromatografia Líquida de Alta Eficiência (CLAE) Bombas de alta pressão Permitem vencer a resistência à passagem da F.M. exercida pelas partículas da F.E. ‐ Função: proporcionar fluxo constante e reprodutível de F.M. a todo o sistema. CARACTERÍSTICAS DESEJÁVEIS: ‐ Fluxo precisos e exatos, vazão contínua e livre de pulsações; ‐ Resposta rápida a alterações no fluxo e composição da F.M. ‐ Pressão máxima: 700 atm (6.000 psi - libras/polegadas quadradas) ‐ Maior parte construída em aço inox 316; outros materiais: titânio, peek, teflon ‐ Inércia química a solventes comuns, resistência a corrosão; ‐ manutenção simples.
  • 68. Cromatografia Líquida de Alta Eficiência (CLAE) Solventes (Fase móvel) Juliana
  • 69. Cromatografia Líquida de Alta Eficiência (CLAE)  Eluição Isocrática: Mesma composição de fase móvel durante a eluição. Único solvente na F.M. Ex: Metanol/água 80:20 (v/v) Gradiente: Composição da fase móvel varia durante a eluição. É uma mistura de solventes ou a mudança de solvente com o tempo. Utilizado na separação de misturas complexas com diferentes funções químicas ou na padronização. Juliana
  • 70. Cromatografia Líquida de Alta Eficiência (CLAE) Sistemas de Introdução de Amostras (INJETORES) O método mais empregado de introdução da amostra em cromatografia líquida é baseado em um sistema com alça de amostragem. Frequentemente as alças intercambiáveis estão disponíveis para permitir a escolha do volume da amostra de 5 a 500 µL. válvula de 6 pórticos (orifícios) Juliana
  • 71. Cromatografia Líquida de Alta Eficiência (CLAE) Detectores Função do detector: identificar a presença de substâncias de interesse que estejam eluindo da coluna cromatográfica, proporcionando uma identificação e quantificação continua dos componentes da amostra. Característica desejáveis: O detector deve ser pequeno e compatível com a vazão de líquido. O detector a ser empregado vai depender da natureza da amostra. Juliana - alta sensibilidade e baixo limite de detecção - ampla faixa de linearidade - confiável e reprodutível -fácil de operar e manter -informação qualitativa e quantitativa -não destruição do soluto -insensibilidade a mudanças na FM e de T - resposta rápida e cte a alterações das [ ] dos solutos -baixo nível de ruído
  • 72. Juliana Cromatografia Líquida de Alta Eficiência (CLAE) Tipos de detectores -Detectores baseados na absorção de luz UV/VIS (mais amplamente empregados - radiação ultravioleta (190 - 400 nm) ou visível (400 - 800 nm); -Detector no UV/VIS com arranjo de fotodiodos (DAD) (a bsorbância de uma amostra pode ser determinada em todos os λ de modo Simultâneo) -Detectores baseados na fluorescência (> sensibilidade UV ) -Detectores baseados no espalhamento da luz -Detectores baseados no índice de refração -Detectores eletroquímicos (+utilizado para fluídos corpóreos e produtos naturais) -Espectrômetro de massas (HPLC‐MS/MS)
  • 73. Cromatografia Líquida de Alta Eficiência (CLAE) Tipos de CLAE  Cromatografia de alta eficiência por partição (a fase estacionária é um segundo líquido que é imiscível com o líquido da fase móvel) Cromatografia líquida com fase ligada Retido por meio de ligações químicas Cromatografia líquido-líquido O líquido é imobilizado por adsorção física  Cromatografia de alta eficiência por adsorção A fase estacionária, nesse caso, é a superfície de um sólido polar finamente dividido. Juliana
  • 74. Cromatografia Líquida de Alta Eficiência (CLAE) Tipos de CLAE Cromatografia por troca iônica Cromatografia por exclusão e por tamanho Cromatografia por afinidade Cromatografia quiral Juliana
  • 75. Cromatografia Líquida de Alta Eficiência (CLAE) Vantagens x Desvantagens F.E. é utilizada várias vezes Alto Custo do equipamento Versatilidade Alto custo de manutenção do Tempo reduzido de análise equipamento Alta resolução Necessita de experiência do Análise qualitativa operador Resultados quantitativos Detectabilidade Automação Juliana