Estrategias purificacao analises proteínas

Fundamentos de Proteínas
Aula 3 – Estratégias de Purificação e
Análises de Proteínas
BCM13042

Principais componentes moleculares da bactériaPrincipais componentes moleculares da bactéria E. coliE. coli
Componentes Nº de moléculas diferentesComponentes Nº de moléculas diferentes % peso total% peso total
H2O 1 70
Proteínas 3.000 15
Ac. Nucléico 1 - DNA e 1000-RNA 7
Carbohidratos 50 3
Lipídeos 40 2
Outros Íons - 12 3
Mol. Monoméricas - 500
O isolamento ou purificação de uma proteína é uma etapa que precede
os estudos de suas características físico-químicas, de sua estrutura 3D
e a compreensão de suas propriedades biológicas.
Inicialmente, a estratégia de purificação de uma proteína é empírica, ou
seja, baseada em tentativa-erro, e deve ser desenhada para cada
proteína individualmente. Não há como prever quais métodos serão os
mais eficientes para se purificar uma proteína pela primeira vez.

Métodos baseados em características físico-químicas das biomoléculas:
1. Tamanho – Massa – Densidade (ex: centrifuação, diálise, gel-filtração)
2. Carga elétrica (ex: cromatografia de troca iônica, eletroforese)
3. Solubilidade ou hidrofobicidade (ex: cromatografia em papel, fase reversa)
Métodos baseados em afinidade biológica, que exploram a interação entre duas
moléculas:
4. Cromatografia de afinidade (pressupõe que uma das moléculas do par que
interage é um “reagente” de fácil obtenção, disponível comercialmente)
Métodos de Isolamento de BiomoléculasMétodos de Isolamento de Biomoléculas
Existe uma grande variedade de métodos visando a separação de biomoléculas.
Como na maioria das vezes o que se pretende purificar é uma proteína, o grupo
de moléculas com maior diversidade, as metodologias de separação de proteínas
tiveram um grande desenvolvimento, com muitas opções disponíveis.
Os métodos de separação de biomoléculas são agrupados em duas categorias:

ORGANELAS
LisossomosLisossomos
MitocôndriaMitocôndria
GolgiGolgi
NúcleoNúcleo
SOBRENADANTE
F1 F2
F3
F4
F2 .1
F2 .2 F2 .3
F2 .3.1
F2 .3.2 . . . . . . F 2. 3.N
Precipitação comSal/Solvente
Precipitação com Sal/Solvente
Cromatografia Troca Iônica
(pH ou resina diferente)
F2 .3.N.X
1 Proteína apenas
(0.001g) - 0.1 a 0.5% total
Gel Filtração
MATERIAL BIOLÓGICO DE PARTIDA: (100g)
O fluxograma ao lado representa a
“marcha” de purificação de uma proteína,
mostrando as etapas sucessivas, cada
uma consistindo de método, que levam ao
isolamento de uma proteína presente
numa mistura complexa.
Observe a quantidade de proteínas
(100g) presente no material inicial e
quanto da proteína purificada se obtém no
final (0,001g). Esses números são típicos
para a purificação da maioria das
proteínas, em especial enzimas.
Em cada etapa, a proteína de interesse é
separada das demais com base em uma
propriedade diferente. Consequente-
mente, as proteínas ainda misturadas com
aquela que está sendo isolada são cada
vez mais semelhantes em suas
características físico-químicas, exigindo
métodos cada mais sensíveis, capazes
de explorar pequenas diferenças, para se
chegar à proteína pura.

• Medida da atividade biológica
- particular para cada proteína
- deve ser quantitativa, para estimar quanto
da proteína de interesse há em cada fração.
• Medidas do conteúdo proteico (diversos)
- absorbância de luz UV de 280 nm
- métodos colorimétricos
(ex: Lowry, Bradford, BCA, etc)
Além dos métodos de purificação, análises
complementares devem ser feitas ao longo da
purificação, para verificar se o processo de
separação está sendo eficiente.
A medida da atividade biológica da proteína
de interesse e do conteúdo de proteínas de
cada fração resultante do processo de
separação devem ser feitas a cada passo.
Assim, apenas a fração que contém a
proteína de interesse, marcada com um
círculo vermelho no fluxograma, é submetida
à próxima etapa de purificação.
ORGANELAS
GolgiGolgi
NúcleoNúcleo
SOBRENADANTE
F1 F2
F3
F4
F2 .1
F2 .2 F2 .3
F2 .3.1
F2 .3.2 . . . . . . F 2. 3.N
F2 .3.N.X
1 Proteína apenas
(0.001g) - 0.1 a 0.5% total
Gel Filtração
MATERIAL BIOLÓGICO DE PARTIDA: (100g)

Métodos para medida do conteúdo de proteína:
A absorbância de uma solução de proteínas a 280 nm é diretamente proporcional ao seu conteúdo
proteico, desde que essas contenham esses aminoácidos aromáticos na sua composição,
especialmente triptofano.
A vantagem desse método é que ele não é destrutivo para a proteína. Em geral, considera-se que uma
leitura de 1,0 A280 equivale a uma concentração de 1 mg/mL.
Ácidos nucleicos também absorvem luz UV – máxomo 260 nm. Proteína: razão A280/A260 > 1
Comprimento de onda
Absortividademolar,ε

BCA = ácido 2,2'-Bicinchonínico ou
4,4'-Dicarboxy-2,2'-biquinoline
Reagente Bradford
= Coomassie
Brilliant Blue G-250
Método baseado em uma mudança espectral do
reagente, em que dá absorção máxinma a 595 nm (cor
azul), quando interage com proteínas.
Interação com proteínas se dá através de
forças de Van der Waals e ligações iônicas,
especialmente com arginina, mas também com
resíduos de histidina, lisina, tirosina, triptofano e
fenlialanina.
Ìons Cu2+
reduzidos a Cu+
em presença de
proteínas reagem fortemente com o BCA
formando um composto azul,
Reagente de Biureto: sulfato de Cu2+
em tartarato
Cu2+
reage com as ligações peptídicas e produz um
complexo púrpura com absorção máxima em 540 nm
1. Cu2+
é chelado pela proteína
[Cu2+
-proteina]
2. Reação redox
Cu2+
+ (ligações peptídicas) —> [Cu+
-proteína]
Ìons Cu2+
reduzidos a Cu+
em presença de
proteínas e cadeias laterais de aminoácidos
aromáticos, Tyr e Trp, e de Cys, reduzem o
reagente de Folin-Ciocalteu (ácido fosfo-
mobidênio-tungstênio), dando um composto
de cor azul.
Método de Lowry
Métodos para medida do conteúdo de proteína:

Para iniciar a purificação, inicialmente é necessário extrair a proteína de interesse
para um meio líquido, exceto se ela já estiver naturalmente presente em um meio
líquido (sangue, suor, água do mar, meio de cultura, seiva de planta, etc).
tecidos
células
Homogeneização
(para romper tecidos e células)
por pressão
(prensa francesa)
liquefação
(Potter)
Homogenado
ou
Extrato bruto
Material
de
partida
Material na
fonte
por ultra-som com
detergente
Vários métodos são
possíveis para transformar
células, órgãos, tecidos em
um homogenado, ou extrato
bruto, como mostra a figura.

Sendo a proteína de interesse
uma proteína de membrana, é
necessário solubilizá-la. Para
esse fim são utilizados
detergentes, que dissolvem a
membrana plasmática e
formando complexos solúveis
com as proteínas.
Proteínas
integrais da
membrana
detergente micelas
Complexos
não micelares
Dependendo da concentração
Detergentes podem ser
iônicos e não iônicos
Detergentes
não iônicos
Triton X-100
(polyoxyethylene (9,5) p-t-octylphenol)
SDS
Dodecil sulfato de
sódio
Cetab
Cetyltrimethylammonium
bromide
Deoxicolato de sódio
Detergentes iônicos
Octilglicosídeo
(octyl-b-D-glucopyranoside)

sangue centrifugado: separação de plasma e células
A centrifugação frequentemente é uma das primeiras
etapas de purificação aplicado a um extrato bruto. Através
do movimento de rotação do rotor da centrífuga, uma força
centrífuga é aplicada à amostra, separando seus compo-
nentes através de suas massas e/ou densidade, conforme
a técnica.
Através de sucessivas etapas de centrifução com
velocidades (rotações por minuto, rpm) crescentes, pode-
se obter diferentes frações de um homogenado de células
ou tecidos.
centrifugação diferencial
homogenado
células intactas
pedaços de membrana
núcleos
mitocôndrias
lisossomos
ribossomos
fração
citoplasmática
A centrífuga
Câmara blindada
Amostra
sedimentando
refrigeração vácuo
rotor
ângulo
fixo

R$ 3.000 US$ 70,000
Centrífuga
Clínica
Ultracentrífuga
Força centrífuga
1,200g por 15 minutos
separa plasma de
células sanguíneas
200,000 g por 24
horas para separar
organelas menores
ou complexos
proteicos
(necessitam vácuo
para evitar atrito do ar,
além de refrigeração)
Relação entre o raio do rotor, velocidade angular (rpm) e a força centrífuga (g)
Preço aproximado
Existem centrífugas para diferentes tipos de aplicações,
dependendo da força centrífuga que são capazes de gerar.

Centrifugação em gradiente de densidade
Solucões de sacarose com
densidades diferentss são
colocadas no tubo, uma
sobre a outra Amostra é colocada no
topo do gradiente
5% sacarose
20% sacarose
centrifugação
Baixa densidade
Média densidade
Alta densidade
A centrifugação em um
meio com gradiente de
densidade melhora a
eficiência da separação. As
partículas se deslocarão
através do gradiente até
encontrarem uma região
com densidade equivalente
a sua, quando param de se
mover, formando “bandas”.
Gradientes podem ser
utilizados para separar
diferentes tipos de células,
organelas, ácidos
nucléicos, complexos
proteicos, etc.
Gradiente separação de:
Ficoll-Hypaque leucócitos
Sacarose mitocôndrias
Cloreto de césio ácidos nucléicos

As mais potentes ultracentrífugas atuais ainda não são capazes de sedimentar proteínas.
Processos que diminuem a solubilidade e provocam a precipitação fracionada de proteínas
são utilizados como etapas preliminares de purificação. Uma das vantagens desses métodos
é o baixo custo e capacidade de processar grandes volumes/massas.
A precipitação de proteínas pode ser induzida por:
- adição de sais (Precipitação salina)
- adição de solventes
- variação de pH (Precipitação isoelétrica)
Solubilidadedahemoglobina(S/S’)
KCl
NaCl
MgSO4
(NH4)2SO4
K2SO4
Concentração do Sal,, Molar
Salting-in X Salting-out
O gráfico ao lado ilustra o efeito de
diferentes sais sobre a solubilidade
da hemoglobina.
Em baixa concentração salina, a
solubilidade das proteínas aumenta,
pois os íons do sal ajudam a reforçar
a camada de solvatação.
Em alta concentração salina, a
solubilidade das proteínas diminue
pois os íons do sal competem pelas
moléculas de água disponíveis para
formar a sua própria camada de
solvatação.
Sais com ânions divalentes são mais
eficientes do que os monovalentes
na precipitação de proteínas.

Solubilidade,log
Fibrinogênio
Pseudoglobulina
MioglobinaAlbumina
Hemoglobina
Concentração do Sal (NH4)2SO4,, Molar
Sais se dissociam em solucão aquosa e competem com as proteínas pela água de solvatação.
Considere uma solução com fibrinogênio,
albumina, hemoglobina, pseudoglobulina e
mioglobina e observe o gráfico.
Usando o sal sulfato de amônio (NH4)2SO4,
pode-se purificar completamente o
fibrinogênio a partir de uma mistura das 5
proteínas, pois este precipita totalmente em
uma saturação de 2,8 M do sal.
Neste ponto, centrifuga-se a solução e o
fibrinogênio é coletado como um precipitado.
Numa próxima etapa, adicionando-se mais
sal à solução até uma saturação de 7 M,
pode-se obter um novo precipitado contendo
albumina, hemoglobina e pseudoglobulina.
E teremos também purificada a mioglobina,
ainda em solúvel na presença de 7M do sal,
e que ficou sozinha no sobrenadante.
Proteínas apresentam diferente sensibilidade
para a precipitação salina.
- precipitam primeiro:
proteínas maiores
proteínas mais hidrofóbicas
possuem camadas de solvatação maiores
ou menos organizadas, mais fáceis de pertubar.

Solventes miscíveis com a água diminuem a constante
dielétrica do meio e desorganizam a camada de solvatação
das proteínas.
Os mais utilizados são etanol e acetona.
Proteínas também podem ser precipitadas com adição de solventes ao meio ou
quando colocadas em meio com pH próximo ao seu ponto isoelétrico.
Água
Dimetilformamida
Metanol
Etanol
Acetona
Clorofórmio
Benzeno
78.5 1.85
48.9 3.96
32.6 1.66
24.3 1.68
20.7 2.72
4.8 1.15
2.3 0.00
Solvente Constante
Dielétrica
Momento
Dipolar
Proteína P.I.
Pepsina <1,0
Ovalbumina galinha 4,6
Albumina sérica humana 4,9
Tropomiosina 5,1
Insulina bovina 5,4
Fibrinogênio humano 5,8
Gama-globulina 6,6
Colágeno 6,6
Mioglobina equina 7,0
Hemoglobina humana 7,1
Ribonuclease A bovina 7,8
Citocromo C equino 10,6
Histona bovina 10,8
Lisozima, galinha 11,0
Salmina, salmão 12,1
Ponto Isoelétrico de algumas Proteínas
Proteínas colocadas em meio com pH igual ao seu PI
tendem a precipitar, pois tendo carga neutra,
apresentam a camada de solvatação menos organizada.

Para remover o excesso de sal ou do solvente no precipitado, utiliza-se a diálise.
-amostra é colocada dentro de um saco feito com uma membrana de celofane com poros
tratados, que permite a passagem de moléculas até 10,000 d.
- o saco contendo a amostra é imerso em um recipiente contendo o solvente que se deseja
- excesso de sal ou de solvente se difunde para o solvente
- após várias trocas de solvente, todo o excesso de sal/solvente terá sido retirado.
Para obter as proteínas precipitadas em solução novamente, é
necessário reverter as condições que levaram à precipitação.
Membrana
de celofane
solvente
solução a
ser dialisada
Aos precipitados obtidos com sal ou
solvente, adiciona-se água.
Ao precipitado obtido com variação
de pH, retornar ao pH original.
início final
∆t

ORGANELAS
GolgiGolgi
NúcleoNúcleo
SOBRENADANTE
F1 F2
F3
F4
F2 .1
F2 .2 F2 .3
F2 .3.1
F2 .3.2 . . . . . . F 2. 3.N
F2 .3.N.X
1 Proteína apenas
(0.001g) - 0.1 a 0.5% total
Gel Filtração
MATERIAL BIOLÓGICO DE PARTIDA: (100g) Até o momento, exploramos as
etapas iniciais de purificação de
proteínas, como a centrifugação
diferencial e precipitação
fracionada.
Esses métodos, apesar de terem
baixo poder de resolução (exploram
diferenças grosseiras entre as
proteínas), permitem processar
grandes volumes ou massas, típicos
das etapas iniciais de isolamento.
Quando já houve redução significa-
tiva dos montantes de proteínas a
serem processados, iniciam-se as
cromatografias, que irão explorar as
diferenças mais sutis entre as
moléculas.
Não esquecer que todas as frações
obtidas devem ter o conteúdo de
proteínas e de atividade biológica
medidos, para se decidir qual/quais
deverão passar para o passo
seguinte da purificação.

Que características devem ter as resina cromatográficas para possibilitar
separações de moléculas baseadas em diferentes propriedades ?
Cromatografia de permeação em gel ou gel-filtração:
separação de moléculas pela massa molecular
géis são porosos, funcionando como peneiras ou filtros
Cromatografia de troca iônica:
separação de moléculas pela carga elétrica
géis apresentam grupos carregados positiva- ou negativamente
Cromatografia de partição (fase reversa ou hidrofóbica):
separação de moléculas pela solubilidade relativa em meio aquoso
géis possuem carácter hidrofóbico
Cromatografia de afinidade:
separação de moléculas pela capacidade de interagir com um ligante
géis possuem ligante específico ligado covalente à resina

Como se avalia se o processo de purificação de uma proteína foi eficiente ?
Três parâmetros permitem avaliar a eficiência do processo de purificação de uma proteína:
- Atividade específica (AE): é a razão entre a quantidade da proteína de interesse, medida
através de sua atividade biológica, e a quantidade total de proteínas presentes
em cada etapa de purificação. Esse índice aumenta ao longo da purificação.
- Índice de purificação: indica quantas vezes em relação ao material de partida a proteína
de interesse foi “concentrada”. Calcula-se como a razão entre as atividades
específicas inicial (material de partida) e final (proteína pura).
- Rendimento: indica quanto (em %) da proteína de interesse ativa presente no material de
partida foi recuperado ao final da purificação. Um certo grau de perda é
inerente do processo de purificação (em cada etapa só devem ser proces-
sadas as frações mais ricas em atividade biológica, desprezando-se aquelas
que apresentam pouca atividade).
Também podem ocorrer perdas por desnaturação das proteínas devido às
diferentes condições (pH, sais, etc) a que são submetidas nas diferentes
etapas de purificação. Espera-se recuperar o máximo possível da proteína de
interesse.

Purificação da Glicoquinase hepática de Rato
EtapaEtapa AtividadeAtividadeEspecíficaEspecíficabb
( U( U.mg-1
).. - a
Rendimentoc
( % )( % )
0.17 100 1
2.0 85 12
23 45 140
44 33 260
80 15 480
Marcha A: somente cromatografias convencionais
1. Sobrenadantede pâncreas
2. (NH4)2SO4, precipitado 25 -55%
3. troca iônica, coluna DEAE-Sephadex, pH 7.0, eluição KCl
4. troca iônica, colunaCM-cellulose, pH 5.5, eluiçãoNaCl
6. interação hidrofóbica, colunaButyl~Sepharose
7. gel-filtração, colunaSephacryl S-300 130 15 780
Marcha B: com cromatografia de afinidade
1. Sobrenadantede pâncreas 0.09 100 1
2. troca iônica, coluna DEAE- Sephadex, pH 7.0, eluição KCl 18 84 195
3. Afinidade cromatográfica (benzamidina~agarose) 420 83 4.500
ÍndiceÍndicebb
PurificaçãoPurificação
a Unidade de enzima (1 unidade de atividade enzimática é definida como a quantidade de enzima que cataliza
a transformação de 1 micromol de substrato em produto, em condições pre-estabelecidas
bAtividade específica: medida da atividade biológica (em U) expressa por miligramas de proteína
c Rendimento: percentual da atividade biológica inicial (100%) recuperada em cada etapa de purificação
d Índice de Purificação : razão entre a atividade específica inicial e aquela determinada em cada etapa.

Concentração
Tempo ou volume
Coletor de
frações
Funcionamento Básico de uma Coluna Cromatográfica
Uma coluna é um tubo cilindríco aberto nas duas extremidades e preenchido com a resina ou
matriz ou gel cromatográfico. A coluna é constantemente alimentada com líquido (tampão),
banhando a resina e forçando o contacto desta e as moléculas que estão sendo analisadas.
Abaixo está representado o esquema geral de uma cromatografia:
Tempo 1
Mais tampão é
colocado na
coluna,
forçando os
componentes
da amostra a
interagirem
com a resina
Componentes da
amostra se
separam e saem
da coluna com
diferentes
volumes de
tampão
Tempo 2 Tempo n
Líquido
que sae
da coluna
é
recolhido
em tubos
de um
coletor de
frações
Os componentes da mistura são
separados por interação diferenciada
com a resina, com base em
propriedades moleculares como:
• massa molecular
• carga elétrica
• solubilidade
• afinidade
Amostra com
diferentes
componentes
Resina
embebida
em
tampão
Tempo zero
Um cromatograma, como o
gráfico ao lado, é a maneira
usual de se representar o
resultado de uma
cromatografia.

Cromatografia de gel filtração ou peneira molecularCromatografia de gel filtração ou peneira molecular
grãos (beads) da
resina com poros
grão da resina poroso
proteína grande
proteína pequena
Tampão
“empurra”
moléculas
através da
resina
tubos
Na gel-filtração, as proteínas que penetram nos poros da resina precisam diferentes
volumes de tampão para saírem da coluna, conforme suas massas moleculares, percorrendo os
canais internos dos grãos. Quanto maior o número de grãos que cada molécula entrar durante o
percurso através da coluna, maior o volume necessário para sua saída.
Proteínas maiores que o diâmetro dos poros não são separadas e saem da coluna com
pouco tampão, correspondente apenas ao volume da coluna externo aos grãos, também chamado de
volume morto (Vo).
Proteínas menoresProteínas menores que o diâmetro dos poros não são separadasnão são separadas e saem da coluna com um
volume de tampão correspondente ao volume interno (Vi, volume total menos o volume do próprio gel).
Moléculas com massas diferentes
Fluxo do tampão

Absorbânciaa280nm
volume
Medidadaativ.biológica
Moléculas
maiores
Moléculas
menores
Kav
Massamolecular(kD)
20 40 60 80 100 120 mL
25 50 75 100 125 mL
volume de eluição
A cromatografia de gel-filtração possibilita estimar a massa molecular de
uma proteína em seu estado nativo
Além de purificar, por ser realizada em condições de pH, força iônica
e temperatura que preservam a atividade biológica da proteína, a
gel-filtração fornece a Mr do seu estado nativo.
Para isso, é necessário “calibrar” a coluna com proteínas de massa
molecular conhecida, construindo-se uma curva de calibração.
O volume de saída (eluição) de uma proteína numa coluna de gel-
filtração é proporcional ao logaritmo de sua massa molecular.
Curva de calibração
traçado da medida de atividade
biológica nas frações
Medir o volume de eluição
da fração mais ativa.
Transportar para a curva de
calibraçao.
Ler a massa
correspondente
Observa
r a
escala
log

Resinas para Gel-Filtração
Sephadex G-10 Dextrana 0.05 - 0.70
Sephadex G-25 Dextrana 1 - 5
Bio-Gel P- 2 Policrilamida 0.1 - 1.8
Bio-Gel P- 6 Policrilamida 1 - 6
Bio-Gel P- 10 Policrilamida 1.5 - 20
Bio-Gel P- 30 Policrilamida 2.4 - 40
Bio-Gel P-100 Policrilamida 5 - 100
Bio-Gel P-300 Policrilamida 60 - 400
Sepharose 6B Agarose 10 - 4.000
NOME TIPO FAIXA DE RESOLUÇÃO
(kD)
*Sephadex e Sepharose: Amersham Pharmacia Biotech; Bio -Gel: Bio -Rad Laboratories
Moléculas pequenas
Moléculas pequenas
Proteínas
Proteínas
Células, partículas sub-celulares
Existem diferentes tipos de resinas para gel-filtração, conforme o tipo
de moléculas ou partículas a serem separadas
indica quais os tamanhos
das partículas que podem
entrar nos poros da resina e
serem fracionados. Acima ou
abaixo da faixa, não há
separação.

Para comparar calibrações com a mesma resina cromatográfica em colunas de
dimensões diferentes utiliza-se o Kav, que é proporcional ao log de Mr.
Kav = Ve-Vo
Vt-Vo
Ve – volume de eluição de uma certa proteína
Vt – volume total da coluna
Vo – volume morto da coluna, em que saem moléculas com
onde:
O gel nessa coluna é o
Sephadex G-200, cuja
faixa de resolução de
proteínas é de 5.000 a
600.000 d.
Observe como proteínas
nos extremos da faixa
de resolução tendem a
“sair” da parte linear da
curva.
Esta é uma outra forma de representar a calibração de uma coluna de
gel-filtração.

Cromatografia de troca iônicaCromatografia de troca iônica
A resina para cromatografia de troca iônica apresenta carga elétrica, positiva ou
negativa, em uma ampla faixa de pH.
Trocadora de ânions Trocadora de cátions
DEAE CM
Existem dois tipos básicos: resinas trocadoras de ânions (possuem carga positiva),
como o dietilaminoetil (DEAE)-celulose e resinas trocadoras de cátions (possuem
carga negativa), como o carboxi-metil (CM)-celulose

--
-
----
DEAE-celulose - pH < 10
CM-celulose - pH > 4
Cromatografia de troca iônicaCromatografia de troca iônica
Proteína P.I.
Pepsina <1,0
Ovalbumina galinha 4,6
Albumina sérica humana 4,9
Tropomiosina 5,1
Insulina bovina 5,4
Fibrinogênio humano 5,8
Gama-globulina 6,6
Colágeno 6,6
Mioglobina equina 7,0
Hemoglobina humana 7,1
Ribonuclease A bovina 7,8
Citocromo C equino 10,6
Histona bovina 10,8
Lisozima, galinha 11,0
Salmina, salmão 12,1
PIácido
+
básico
-neutro
Ponto Isoelétrico de algumas Proteínas

Como funciona a Cromatografia de Troca IônicaComo funciona a Cromatografia de Troca Iônica
Adsorção
Eluição
+
+
+
+
+
+
+
+
Moléculas com a mesma carga,
ou sem carga, não interagem com a resina,
sendo as primeiras a sair da coluna
Adição de sal ao tampão resulta em
competição entre os íons em solução
e as moléculas adsorvidas na resina.
Na+
Cl-
+
A cromatografia de troca iônica compreende duas etapas:
1) adsorção das proteínas com carga contrária à
resina, e saída da coluna das proteínas com a
mesma carga;
2) eluição das proteínas adsorvidas.
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+ +
No exemplo ao lado, como funciona uma resina catiônica ou
trocadora de ânions, como o DEAE-celulose):
Para a eluição, as condições de adsorção da coluna
(pH ou força iônica) são alteradas para neutralizar a
interação entre as proteínas e a resina.
Mais frequentemente utiliza-se um aumento da
concentração do sal no tampão, pois alterações de pH
podem desnaturar proteínas, levando-as a precipitar
dentro da coluna.

Carboximetil~celulose
(trocadora de cátions)
Dietilaminoetil~celulose
(trocadora de ânions)
Duas Modalidades de Cromatografia de Troca IônicaDuas Modalidades de Cromatografia de Troca Iônica
Gradientes de sal podem fracionar as proteínas adsorvidas na resina de acordo
com a intensidade de suas cargas, que é dada pela diferença entre seus PIs e o pH do
tampão de eluição.
As proteínas não retidas (com a mesma carga da resina) não são separadas,
sendo simplesmente “arrastadas” pelo tampão (ou seja, não são repelidas pela resina).
_
=
=
_
+
++
++
(+)
(+)
(+)
(+)
0. 10 M
0. 15 M
0. 20 M
Eluição NaCl
Não retidas
DEAEDEAE
++
0. 10 M
0. 15 M
0. 20 M
Eluição NaCl
+
(-)
(-)
(-)
+
++
_ =
=
_
(-)
Não retidas
CMCM

Tipos de Resina de troca Iônica
Tipos de Resina de troca iônica
NOME TIPO GRUPO IONIZÁVEL OBSERVAÇÕES
Dowex 1 Fortemente básica Ø - CH2N+
(CH3)3 Troca aniônica
resina de polistireno
Dowex 50 Fortemente básica Ø - SO3
-
H Troca Catiônica
resina de polistireno
DEAE-celulose Básica Dietilaminoetil Fracionamento de proteínas
- CH2CH2N+
(C2H5)2 ácidas e neutras
CM-celulose Ácida Carboximetil Fracionamento de proteínas
- CH2COOH básicas e neutras
Q-Sepharose Gel de dextrano Combinação de gel filtração
básico e troca iônica de proteínas
ácidas e neutras
SP -Sepharose Gel de dextrano Combinação de gel filtração
ácido e troca iônica de proteínas
básicas e neutras
* Dowex: Dow Chemical Co.; Sepharose e Source: GE LifeSciences Bio- Gel: Bio Rad Laboratories
Existem vários tipos de resinas de troca iônica disponíveis no mercado.
−Ο−CH2CHOHCH2OCH2CHOHCH2N+
(CH3)3
—CH2-SO3
-

Cromatografia de afinidade:
Eluição: condições que interferem na ligação da proteína ao
ligante, como mudanças no pH e/ou força iônica, ou
por competição com o ligante livre
Desprezar
proteínas não
retidas
Lavagem
Eluição
pH 2,0 ou sal
Antígeno A
puro
Anti-A
interage
apenas
com a
proteína A
-
Mistura de proteínas
Coluna
empacotada
com ess gel
Partículas de
gel recobertas
de anticorpos
anti-A
Adsorção
Complexo
Ag-AC é
desfeito
Um dos métodos mais
eficientes para a
purificação de proteínas,
possibilitando um alto
rendimento com número
reduzido de etapas.
A separação de
moléculas tem como
base a interação
específica do analito
(molécula-alvo) com um
ligante imobilizado na
matriz. Forças
envolvidas nessa
interação podem ser não
covalentes
(eletrostáticas,
hidrofóbica, pontes de H)
ou covalentes (p.e.,
ponte dissulfeto).
Ex: cromatografia de imunoafinidade

Ligante
grupo-específico
Especificidade
Proteína A Região Fc de IgG
Proteína G Região Fc de IgG
Concanavalina A Grupos glicosil- ou manosil-
Cibacron Blue Várias enzimas, albumina
lisina Plasminogênio, RNA ribossomal
arginina proteinases tipo tripsina
benzamidina proteinases tipo tripsina
calmodulina Proteínas reguladas por calmodulina
heparina Fatores de coagulação, lipases,
hormônios, receptores estoróides, etc
Metais de transição Proteínas e peptídeos com resíduos
de His expostos
1. Mono-específicos - ligação específica da molécula-alvo
- análogos de substratos ou inibidores de enzimas
- agonistas ou antagonistas de receptores
- haptenos ou determinantes antigênicos de anticorpos
- ligantes com “tag” ou “marcação”
- glutationa-S-transferase
- poli-Histidina
2. Grupo-específico: ligantes para separação de grupos:
Tipo de ligantes em cromatografia de afinidade
8-AEA-cAMP
8-(2-aminoethyl)aminoadenosine-3',5'-cyclic
monophosphate
(ligante para proteínas com afinidade por cAMP
ou cGMP)
Sítios de ligação das
proteínas A, G e L à
imunoglobulina, que permitem
a purificação de anticorpos por
cromatografia de afinidade

Para ligantes pequenos (Mr < 1.000) há o risco de impedimento
estérico entre a matriz e a molécula-alvo, que causa dificuldade
ou impede sua ligação à resina.
A introdução de um braço espaçador diminue esse risco.
Estratégias para acoplamento de ligantes à resina
Reagente Alvo no ligante
Braço espaçador covalente entre
a resina e o ligante
Ligação reversível não covalente
ligante
Molécula-alvo (analito)
Preparo da resina de afinidade:
Passo 1. Ativação da resina
Passo 2. Acoplar
o ligante

Papel
ou placa
de sílica
Amostra
na origem
tempo 0 t 1 t2 tn
direção do
fluxo do
solvente
Compostos
separados
Cuba com solvente (fluxo por capilaridade)
Cromatografia de Partição
Princípio: Explora diferenças de solubilidade dos compostos em solventes com grau de hidrofobicidade
diferentes, um polar e outro apolar.
Aplicável especialmente á moléculas pequenas, como compostos orgânicos, aminoácidos, peptídeos,
açúcares, lipídeos, etc.
Apresenta limitações para uso com proteínas acima de 20-30kda, que são desnaturadas em presença
de solvente orgânico.
Fase estacionária
(suporte sólido) X
Fase móvel
(líquido ou gás)
Consiste de 2 sistemas:
CROMATOGRAFIA DE FASE REVERSA
Fase Estacionária: sílica (mineral apolar)
Fase Móvel: Solvente aquoso ou água
Suporte: SÍLICA (camada delgada ou TLC)
Suporte: PAPEL
Fase Estacionária: Aquosa (H20 na celulose)
Fase Móvel: Solvente orgânico (hidrofóbico)
CROMATOGRAFIA EM PAPEL
distância de migração da substância
distância de migração do solvente
Rf =

HPLC: high performance (pressure) liquid chromatography
Inicialmente desenvolvida para cromatografia de fase reversa em coluna, hoje em dia
abrange aplicações para todos os tipos de cromatografias.
Característica diferencial da cromatografia convencional:
• partículas de resina com diâmetro muito pequeno (poucos microns)
• aumento da eficiência da separação em função do número maior de partículas
de resina em um mesmo volume da coluna
• fase móvel - necessita bomba de alta pressão para ter fluxo através da coluna
Desenho básico de um HPLC
bombas Injetor de
amostra
Coluna e
forno
Coletor de
frações
Detector
Controle e
análise dos
dados
Duas bombas permitem eluição em gradiente
Detector: índice de refração, absorbância UV
ou Vis, fluorescência, etc.
Coluna pode ser aquecida para melhorar a
eluição diferencial na fase reversa

CN Fenil NH2 C4 C8 C18
Retenção na coluna: aumenta com o tamanho da cadeia
Condição de equilíbrio: em meio ácido
(0.1% de ácido trifluoroacético) para
aumentar hidrofobicidade (protonar as
carboxilas)
Eluição com gradiente crescente de solvente
orgânico miscível com água
- acetonitrila, metanol, propanol
Fase reversa: resinas de sílica derivatizadas com hidrocarbonetos de 2 C a 18 C
Fase estacionária Função
C18 –Si (CH3)2 C18 H37
C8 –Si (CH3)2 C8 H17
tC2 –Si C2 H5
Aminopropyl –Si (CH2)3 NH2
Cyanopropyl –Si (CH3)2 (CH2)3CN
Diol –Si (CH2)3 OCH2CH(OH)CH2OH
Absorbânciaa214nm
Tempo ou volume de retenção
%deacetonitrila
100
Moléculas
não retidas
Moléculas
retidas
Cromatograma de uma coluna de fase reversa, com eluição por um gradiente de acetonitrila

aminoácido
Para determinar a estrutura primária de uma proteína,
é necessário primeiro conhecer a composição (número
e tipos) de seus aminoácidos.
A posição do pico no cromatograma identifica o aminoácido.
A área do pico quantifica o aminoácido.
A proteína pura é tratada com
HCl 6N fervente para quebrar
(hidrólise) as ligações peptídicas.
A mistura resultante é submetida
a métodos cromatográficos (fase
reversa, troca iônica) para separar
os diferentes aminoácidos. Tempo de retenção (min)
fluorescência

Existem vários métodos para se determinar a sequência de aminoácidos de
uma proteína. Aqui veremos como funcionam os dois métodos
atualmente mais utilizados:
a) Método de Edman: reação do aminoácido N-terminal da proteína com
fenil-isotiocianato . A proteína modificada é submetida a
hidrólise ácida liberando o aminoácido N-terminal modificado, e este é
identificado por cromatografia. Segue-se novo ciclo de reação com o
próximo aminoácido na proteína, que se tornou o novo N-terminal.
b) Espectrometria de massa: determinação das massas de fragmentos
correspondendo a aminoácidos, retirados sequencialmente da proteína.
Veremos mais sobre esse método na aula sobre eletroforese e
proteômica.

Método de Edman -
sequenciamento de proteínas com
PITCPITC (fenil-isotiocianato)
ciclo 1
ciclo 2
hidrólise com ácido
trifluoroacético
hidrólise ácida
vai para novo ciclo
análise cromatográfica (troca iônica ou fase reversa)
(1)
(2)
(3)
acoplamento
acoplamento
Cada ciclo de reação compreende 3 etapas:
1. Reação da proteína com PITC, que se
acopla ao grupo amino NH2- livre do
aminoácido 1 (no exemplo, uma lisina, K);
2. Hidrólise ácida da proteína conjugada
com PITC libera a feniltiohidantoína (PTH)
do aminoácido 1 e o restante da proteína,
tornando o aminoácido 2 o novo resíduo
N-terminal (no exemplo uma serina, S);
3. Análise cromatrográfica do PTH-
aminoácido e novo ciclo de reação com o
novo N-terminal da proteína.
Sequenciadores automatizados fazem
todas as etapas, com capacidade
para realizar 30 ciclos por dia, a partir
de 100-200 picomoles de proteína.

Quando uma proteína possui mais de 20-30 resíduos de aminoácidos, não
é possível sequenciá-la diretamente pelo método de Edman.
Para obter a sequência completa de uma proteína, é necessário sequenciar vários peptídeos
da mesma proteína, obtidos por diferentes tipos de quebra da cadeia, até haver sobreposição
de suas sequências.
Proteína
Total 150 a.a
sequência obtida a partir da proteína intacta
30 aa
Diferentes métodos são utilizados para obter-se diferentes peptídeos da proteína: A) enzimas
proteolíticas, como tripsina (quebra em resíduos de Lys ou Arg) e quimotripsina (quebra em
resíduos de Phe); B) tratamento com brometo de cianogênio (quebra em Met); e outros.
proteína
inteira
peptídeos
método A
peptídeos
método B

Sequenciamento de novo de proteínas por espectrometria de
Para sequenciar
proteínas é preciso
obter o espectro MS/MS
de seus peptídeos.
Isso significa 2 etapas
de MS acopladas.
Depois de fazer o MS
da molécula inteira,
esta é fragmentada
dentro do aparelho por
colisão com gases.
Os fragmentos são
então separados e
analisados por MS.
hélio ou argônio
A ligação peptídica se quebra formando fragmentos típicos, como os
íons b e y mostrados na figura acima, que terão massas diferentes de
acordo com o radical R de cada aminoácido.

Espectro MS/MS do peptídeo
tríptico
GLSDGEWQQVLNVWGK.
AA Codes Mono. AA Codes Mono.
Gly G 57.021464 Asp D 115.02694
Ala A 71.037114 Gln Q 128.05858
Ser S 87.032029 Lys K 128.09496
Pro P 97.052764 Glu E 129.04259
Val V 99.068414 Met M 131.04048
Thr T 101.04768 His H 137.05891
Cys C 103.00919 Phe F 147.06841
Leu L 113.08406 Arg R 156.10111
Ile I 113.08406 CMC 161.01467
Asn N 114.04293 Tyr Y 163.06333
- - - Trp W 186.07931
Analiza-se o espectro
buscando diferenças de
m/z equivalentes a um
resíduo de aminoácido,
que permitem conhecer
a seqüência do
peptídeos

Síntese de peptídeos Quim. Nova, Vol. 27, No. 5, 781-789, 2004
COOH
bloq
H2N
bloq
1. DNA recombinante
1. Química: uso de reagente químico para
ativar o ácido carboxílico de um Nα-acil-
aminoácido, o qual sofre o ataque nucleofílico
do grupo α- amino de outro aminoácido
- indicado para sequências de até 20 aa.
- estereo-isômeros, purificação dos produtos
3. Biocatálise: reversão da proteólise
- diminuição da atividade da água no meio
reacional reverte a ação de enzimas
proteolíticas
- termolisina, pepsina, subtilisina, tripsina, etc
- vantagens:, não forma misturas racêmicas e
sub-produtos, condições brandas

Síntese de peptídeos
Fmoc (9-fluorenilmetoxicarbonila) - protetor do grupo α- amino dos doadores de acila,
estável ao ácido trifluoroacético (TFA) e lábil a bases orgânicas – todas as outras
carboxilas são protegidas por reagentes lábeis ao TFA e estáveis a bases orgânicas
Boc (t-butiloxicarbonila) - protetor do grupo α- amino dos doadores de acila lábil ao
(TFA) – todas as outras carboxilas são protegidas por reagentes estáveis a este ácido e
lábeis a ácidos inorgânicos fortes ou hidrogenólise.

Síntese de peptídeos
Robert B. Merrifield – Prêmio Nobel em Química em 1984

ELETROFORESEELETROFORESE
1. pH / tampão
2. Suporte
- papel : corrente alta (calor)
uso para peptídeos e aminoácidos
- agarose: ácidos nucléicos
Imunoeletroforese
Proteínas nativas
- poliacrilamida: proteínas
ac. nucleicos
não desnaturante ou nativa
desnaturantee redutor
peso molecular
composição de subunidades
focalização isoelétrica: PI
bidimensional
CONDIÇÕES QUE DETERMINAM A SEPARAÇÃO
SUPORTE X pH MEIO
++
++
++
++
∆ Τ∆ Τ

+
_
Reação de eletrólise da água
• Uso de tampão concentrado
• Uso de indicador de pH como
marcador de corrida:
azul de bromofenol

Eletroforese em Gel de Poliacrilamida (PAGE)
polyacrylamide
persulfate
+
• 7 a 15% [acrilamida] – maioria das proteínas
• [ ] mais baixas – gel muito mole –
suporte com agarose
• Gradiente de acrilamida – aumenta poder de
resolução
cuba vertical para mini-gel (10 X 8 cm)

ProteínaProteína Ponto Isoelétrico
Pepsina < 1.0
Ovalbumina (galinha) 4.6
Albumina Sérica (humana) 4.9
Tropomiosina 5.1
Insulina (bovina) 5.4
Fibrinogênio (humano) 5.8
γ −Globulina 6.6
Colágeno 6.6
Mioglobina (cavalo) 7.0
Hemoglobina (humana) 7.1
Ribonuclease A (bovina) 7.8
Citocromoc (cavalo) 10.6
Histona (bovina) 10.8
Lisozima (galinha) 11.0
Salmina(salmon) 12.1
155.000
330.000
18.000
64.000
Separação na
eletroforese nativa é
influenciada pela carga,
massa e forma da
molécula

A B
C
C
C
A
A
B
B
SDS (dodecil sulfato de sódio
+
2-mercaptoetanol
Efeitos do SDS
• desnaturação uniformiza a forma
das proteínas;
• mascara a carga natural das
proteínas no pH da corrida, fazendo
com que todas moléculas migrem
para o anôdo;
• facilita o efeito de redutores

SDS-PAGE
Salmonella tiphymurium

Determinação da massa molecular de proteínas
Curva de calibração de SDS-PAGE a 15%
Mobilidade relativa (Rf)
Massamolecular(kD)
Mobilidade relativa =
distância percorrida pela banda X
distância percorrida pelo marcador da corrida
97.4
87.0
45.0
29.0
21.0
12.5
6.5
(-)
(+)

• migração através de um gradiente de pH
• proteínas “focalizam” nos seus P.I.
Anfólitos: Misturas de compostos poliaminados/policarboxilados (patenteados)
Gel não tamponado polimerizado com anfólitos
1ª corrida: anfólitos criam gradiente
2ª corrida: amostras são aplicadas
Após a corrida: pedaços do gel são
analisados quanto ao seu pH.
3.0
4.0
5.0
6.0 pH
pH
+
Marcadores de P.I. conhecidos
_
Aplicações:
-Determinação do PI
-Isoformas da mesma proteína:
- glicosilação
- fosforilação
- mutações pontuais
Eletroforese – focalização isoelétrica

1a.dimensão: focalização isoelétrica
2a.dimensão: SDS-PAGE (perpendicular a 1a.)
PM x 103
Eletroforese Bidimensional
-
P IP I
+
3
3.5
4
4.5
5
5.5
Origem
5 4 3 2678910

PROTEOMA:
• análise simultânea de até 5.000 proteínas
• permite comparação de todas as proteínas expressas
por uma célula em dois momentos diferentes:
• análise do efeito de hormônios,
• análise do efeito de drogas;
• estados fisiológicos (desenvolvimento);
• condições patológicas diversas (vírus,
bactérias,etc.)
Eletroforese 2D de proteínas totais
(proteoma) de Escherichia coli
Proteínas com mesmo pI
Proteínas com a
mesma massa

sem fervura das amostras
pode ter SDS no gel de separação
•Conformação nativa, oligomerização
•Zimogramas: estudos de enzimas, afinidade
• Gel copolimerizado (gelatina, amido, etc)
• Gel overlay (gel de agarose)
• Proteínas nativas ou renaturadas no gel por
remoção lenta do SDS por troca com detergente
não iônico
Gel nativo:

Antígeno B do Echinococcus granulosus
Multímeros de subunidades de 8 kDa
15% SDS-PAGE
Monteiro et al., 2011
PLoS Neglected Tropical Diseases
Urease de Canavalia ensiformis
(hexâmero de 90 kDa)
3% PAGE
Efeito de Cu2+
- precipitação
Follmer & Carlini, 2005
Arch. Biochem. Biophys.
Ni2+
Cu2+
Zn2+
Hg2+
Rhipicephalus microplus Cys-endopeptidase
12% SDS-PAGE- copolimerizado com 0.1 % hemoglobina
- após corrida, retirada do SDS troca por Triton X-100 (3h)
- incubação a pH 4,0, 18h/37o
C.
Estrela et al, 2010
Comp. Biochem. Physiol
Tolfo Bittencourt et al., 2004 Res. Microbiol
8.5% non-denaturing gels
- atividade das SODs revelada Inibição da redução do NBT em
presença de TEMED e riboflavina
Superoxide dismutases from Metarhizium. anisopliae

Métodos imunoquímicos aplicados a proteínas
 estrutura e propriedades de imunoglobulinas
 anticorpos policlonais e monoclonais: produção e purificação
 imunodiagnóstico: aglutinação X lise
 imunoprecipitação: difusão em gel, imunoeletroforese
 ELISA, Western blot
 imunohistoquímica e imunofluorescência

Anticorpos são imunoglobulinas.
Cadeia H (pesada) – 50.000 d
Cadeia L (leve) – 25.000 d
Porção N-terminal das cadeias L e H
~ 120 aminoácidos variáveis
restante da cadeia é constante
Cadeia H Cadeia L
Imunoglobulina
classe Sub-classe
γ1 κ ou λ IgG IgG1
γ2 κ ou λ IgG2
γ2 κ ou λ IgG3
γ4 κ ou λ IgG4
α1 κ ou λ IgA IgA1
α2 κ ou λ IgA2
µ κ ou λ IgM
δ κ ou λ IgD
ε κ ou λ IgE
Função Estrutura
anticorpo
antígeno
Complexo antígeno-anticorpo

Mecanismos
através dos quais
os anticorpos
executam as
funções de defesa:
- Neutralização (Ag solúveis)
- Opsonização (Ag particulados)
- Imunecomplexo (todos Ags)

Produção de Anticorpos: imunização ativa
Propagação clonal de linfócitos B ou plasmócitos
Um linfócito B sempre produzirá
imunoglobulinas para o mesmo
antígeno, mas poderá variar a
classe de anticorpos produzidos

Anticorpos policlonais versus Anticorpos monoclonais
Há vários determinante antigênico ou epitopo em uma proteína
- tamanho: 5 a 6 aminoácidos
- podem ser sequenciais ou conformacionais

 Reconhecimento de
apenas um determinante
antigênico
 tipo único de
imunoglobulina
 Vantagens e desvantagens
Produção de
Anticorpos
Monoclonais

Imunoprecipitação
Complexos Ag-Ac insolúveis
- Precipitado é máximo na
Zona de equivalência
- Excesso de Ag ou de Ac
Fazem complexos solúveis

Imunoprecipitação em gel de agarose

Imunodifusão dupla
Permite comparar antígenos e detectar determinantes
antigênicos em comum
Identidade
total
Identidade
parcial
Ausência de
identidade

Recombinant
Protein L
Native
Protein A
Recombinant
Protein A
Recombinant
Protein G
Protein
A/G
Source Peptostreptococci Staphylococcus
aureus
Bacillus Streptococci Bacillus
Molecular Weight 35,800 42,000 44,600 22,000 50,449
Number of Binding
Sites for IgG
4 4 5 2 4
Albumin Binding Site no no no no no
Optimal Binding pH 7.5 8.2 8.2 5 5-8.2
Binds to VLκ Fc Fc Fc Fc
Proteínas bacterianas com afinidade por Imunoglobulinas
- Servem como ligantes em matrix de afinidade
- Servem como 2º.ligantes em testes imunoenzimáticos
bead

Imunobeads: adsorção complexo Ag:Ac

Ensaios Imunoenzimáticos ou ELISA
+ 1º.Ac + Ag
placa
Ag
Ac 1º.
Ac 2º.
ES
cor
ELISA
sandwich + 2º.Ac + S cor
Padronização do ELISA
Concentração do Ag ou Ac
Abs(intensida

ELISA Competitivo é adequado para identificação e
quantificação tanto do antígeno como do anticorpo.
Para a determinação de Ag, o Ag presente na amostra
compete com Ag marcado com uma enzima, para se ligar ao
Ac imobilizado. A cor desenvolvida na revelação é
indiretamente proporcional à concentração de Ag na
amostra.
O Radioimunoensaio (RIA) baseia-se no mesmo
princípio, utilizando Ag marcado com um radioisótopo para
competir com o Ag frio presente na amostra.
(1)
(2)
- Quanto maior a concentração do antígeno a ser medido, maior será
o deslocamento do antígeno marcado, permitindo a quantificação.
Variante para
pesquisa do Ac

Western blot
Anticorpo secundário marcado com:
- enzima
- radioativo
- fluorescente

MAP2-(neurons) and GFAP-(astrocytes) positive
cells in hippocampal cell culture
GluR1 clusters in hippocampal cultured neurons
Presynaptic terminals showned by immunostainig of
specifically presynaptic protein Synapsin in cultured
hippocampal neuron
Imunofluorescência:
-anticorpos marcados com diferentes fluoróforos
vermelho (rodamina), verde (fluoresceína)

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