O documento discute diferentes técnicas de cromatografia, incluindo cromatografia de troca iônica, exclusão de tamanho e afinidade. A cromatografia de troca iônica separa moléculas com base em suas cargas elétricas usando resinas carregadas, enquanto a exclusão de tamanho separa moléculas com base em seu tamanho usando géis porosos. A cromatografia de afinidade usa ligantes específicos acoplados a uma matriz para isolar proteínas ou out

1. CROMATOGRAFIA

2. o É um método físico-químico de
separação dos componentes de uma
mistura, realizada através da
distribuição destes componentes
entre duas fases, que estão em
contato íntimo.
Seletividade pela fase estacionária
Fase móvel
Fases estacionária
Migrações diferenciais dos componentes

3. HISTÓRICO
Chrom = cor; graphe = escrever

4. CROMATOGRAFIA DE TROCA
IÔNICA

5. APLICAÇÕES
• Explora as diferenças de sinal e da grandeza
das cargas elétricas líquidas das proteínas em
um certo pH.

6. TEMPO=TUBOS DE ENSAIO
FASE MÓVEL
FASE ESTACIONÁRIA

7. EXTRATO BRUTO
Métodos de
purificação
1 proteína
isolada
Proteínas de uma célula

8. tecidos
células
Homogeneização
(para romper tecidos e células)
por pressão
(prensa francesa)
liquefação
(Potter)
Homogenado
ou
Extrato bruto
Material
de
partida
Material na
fonte
por ultra-som com
detergente
Vários métodos são
possíveis para transformar
células, órgãos, tecidos em
um homogenado, ou extrato
bruto, como mostra a figura.

9. Sendo a proteína de interesse
uma proteína de membrana, é
necessário solubilizá-la. Para
esse fim são utilizados
detergentes, que dissolvem a
membrana plasmática.
Proteínas
integrais da
membrana
detergente micelas
Complexos
não micelares
Dependendo da concentração
Detergentes podem ser
iônicos e não iônicos
Detergentes
não iônicos
Triton X-100
(polyoxyethylene (9,5) p-t-octylphenol)
SDS
Dodecil sulfato de
sódio
Cetab
Cetyltrimethylammonium
bromide
Deoxicolato de sódio
Detergentes iônicos
Octilglicosídeo
(octyl-b-D-glucopyranoside)

10. sangue centrifugado: separação de plasma e células
centrifugação diferencial
homogenado
células intactas
pedaços de membrana
núcleos
mitocôndrias
lisossomos
ribossomos
fração
citoplasmática
A centrífuga
Câmara blindada
Amostra
sedimentando
refrigeração vácuo
rotor
ângulo
fixo

11. MATRIZ
• Constituída de material poroso que pode ser
natural ou sintético;
• Insolúvel em água ou solvente orgânico;
• Apresenta grupos trocadores iônicos ligados
covalentemente à matriz, que pode ser:
• Trocadores aniônicos (+)
• Trocadores catiônicos (-)

12. A resina para cromatografia de troca iônica apresenta carga elétrica, positiva ou
negativa, em uma ampla faixa de pH.
Trocadora de ânions Trocadora de cátions
DEAE CM
Existem dois tipos básicos: resinas trocadoras de ânions (possuem carga positiva),
como o dietilaminoetil (DEAE)-celulose e resinas trocadoras de cátions (possuem
carga negativa), como o carboxi-metil (CM)-celulose
MATRIZ

13. -
-
-
--
--
O gráfico mostra que essas resinas mantém suas cargas em uma ampla
faixa de pH. Assim, o DEAE-celulose pode ser utilizado em pH abaixo de
10, enquanto que o CM-celulose é utilizado em pH acima de 4, condições
em que pelo menos 50% dos grupos dessas resinas estão carregados.
MATRIZ

14. Tipos de Resina de troca Iônica
Tipos de Resina de troca Iônica
NOME TIPO GRUPO IONIZÁVEL OBSERVAÇÕES
Dowex 1 Fortemente básica Ø - CH2N+(CH3)3 Troca aniônica
resina de polistireno
Dowex 50 Fortemente básica Ø - SO3
-H Troca Catiônica
resina de polistireno
DEAE-celulose Básica Dietilaminoetil Fracionamento de proteínas
- CH2CH2N+(C2H5)2 ácidas e neutras
CM-celulose Ácida Carboximetil Fracionamento de proteínas
- CH2COOH básicas e neutras
DEAE -Sephadex Gel de dextrano Dietilaminoetil Combinação de gel filtração
básico - CH2CH2N+(C2H5)2 e troca iônica de proteínas
ácidas e neutras
CM - Sephadex Gel de dextrano Carboximetil Combinação de gel filtração
ácido - CH2COOH e troca iônica de proteínas
básicas e neutras
* Dowex: Dow Chemical Co.; Sephadex: Amersham Pharmacia Biotech; Bio- Gel: Bio Rad Laboratories
Existem vários tipos de resinas de troca iônica disponíveis no mercado.

15. Adsorção
Eluição
+
+
+
+
+
+
+
+
Moléculas com a mesma carga,
ou sem carga, não interagem com a resina,
sendo as primeiras a sair da coluna
Adição de sal ao tampão resulta em
competição entre os íons em solução
e as moléculas adsorvidas na resina.
Na+Cl- +
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+ +
COMO FUNCIONA A CROMATOGRAFIA
POR TROCA IÔNICA

16. Carboximetil~celulose
(trocadora de cátions)
Dietilaminoetil~celulose
(trocadora de ânions)
_
=
=
_
+
++
++
(+)
(+)
(+)
(+)
0. 10 M
0. 15 M
0. 20 M
Eluição NaCl
Não retidas
DEAE
++
0. 10 M
0. 15 M
0. 20 M
Eluição NaCl
+
(-)
(-)
(-)
+
++
_ =
=
_
(-)
Não retidas
CM
MODALIDADES DA CROMATOGRAFIA
POR TROCA IÔNICA

17. CROMATOGRAMA

18. CROMATOGRAMA

19. Cromatografia por exclusão
(Filtração em gel, permeação em gel)

20. Seletiva e dinâmica distribuição das moléculas pela massa
molecular entre duas fases líquidas separadas, e dependentes
de uma estrutura estacionária contendo géis porosos,
funcionando como peneiras ou filtros.

21. Equipamento :
• Coluna Cromatográfica:
Tubo de vidro com diferentes diâmetros internos e/ ou comprimento;
• Controle da vazão da fase móvel:
(Mantêm a pressão de operação constante)
Recipiente fechado na parte superior e com saída na parte inferior que será
conectado à coluna.Um tubo aberto é colocado através do gargalho
fechado do recipiente até um determinada altura;
• Registro das curvas de eluição:
(Absorbância, condutividade).

22. Aplicações
• Remoção de substâncias radioativas de pequena massa
molecular;
• Remoção de produtos, inibidores ou co-fatores da mistura
contendo enzimas;
• Determinação da massa molecular ou tamanho de proteínas
nativas ou desnaturadas;
• Determinação da massa molecular de polímeros naturais ou
sintéticos.
• Determinação de constantes de equilíbrio e separação de
células.

23. grão da resina poroso
proteína grande
proteína pequena
Tampão
“empurra”
moléculas
através da
resina
tubos
Moléculas com massas diferentes
Fluxo do tampão
grãos da resina
com poros
A cromatografia de gel-filtração possibilita estimar a massa molecular de
uma proteína em seu estado nativo

27. Volume morto(Vo) Volume de eluição(Ve)

28. O volume de saída (eluição) de uma proteína numa
coluna de gel-filtração é proporcional ao logaritmo de
sua massa molecular.
Moléculas
maiores
Moléculas
menores
Absorbânciaa280nm
Medidadaativ.biológica
20 40 60 80 100 120 mL
volume
Medir o volume de eluição da fração
mais ativa. Transportar para a curva
de calibração.
traçado da medida de atividade
biológica nas frações

29. Observar
a escala
log
25 50 75 100 125 mL
volume de eluição
Ler a massa
correspondente
Curva de calibração
Massamolecular(kD)
Além de purificar, por ser realizada em condições de pH, força iônica
e temperatura que preservam a atividade biológica da proteína, a gel-
filtração fornece a Mr do seu estado nativo.
Para isso, é necessário “calibrar” a coluna com proteínas de massa
molecular conhecida, construindo-se uma curva de calibração.

31. Fases
• Estacionária:
Gel : estrutura tridimensional cuja estabilidade mecânica é dada
pelo material contendo ligações cruzadas.Os espaços não
ocupados pelo material contem líquido.
Estrutura:
i. Homogênea
ii. Heterogênea

32. i. O gel tem propriedades que indicam uma distribuição
homogênea através do corpo do gel.Estes géis são
usualmente mais moles, e podem perder ou absorver o
liquido e permitem a entrada de moléculas de pequeno
peso molecular.
ii. Apresentam regiões de maior concentração de matriz e
outras quase vazias; esta estrutura com espaços grandes
permitem a entrada de moléculas maiores.

33. Características de um gel
• Inércia Química:
Interações fracas e reversíveis entre o soluto e a matriz originam volumes de
retenção maiores;
• Estabilidade:
Deve manter condições de Ph e temperaturas;
• Baixo teor de íons:
Grupos carregados interferem no rendimento, e produzem picos assimétricos.

34. Natureza química do gel
• Deve permitir variações para o fracionamento em
diferentes intervalos de massa molecular;
• O limite de exclusão* varia de acordo com a massa
molecular;
* Massa molecular da menor molécula que é incapaz de penetrar qualquer dos
poros da matriz.

35. Natureza Física do gel
• Deve conter partículas de tamanho e distribuição controlados:
• Partículas pequenas= melhor resolução.
• Partículas grandes= espalhamento da zona.
• Deve ter rigidez mecânica para não ser deformado .Géis com
pequeno conteúdo de matriz,alto limite de exclusão, tendem
a ser fracos.

36. Existem diferentes tipos de resinas para gel-filtração, conforme o tipo
de moléculas ou partículas a serem separadas
Resinas para Gel-Filtração
Sephadex G-10 Dextrana 0.05 - 0.70
Sephadex G-25 Dextrana 1 - 5
Sephadex G-50 Dextrana 1 - 30
Sephadex G-100 Dextrana 4 - 150
Sephadex G-200 Dextrana 5 - 600
Bio-Gel P- 2 Policrilamida 0.1 - 1.8
Bio-Gel P- 6 Policrilamida 1 - 6
Bio-Gel P- 10 Policrilamida 1.5 - 20
Bio-Gel P- 30 Policrilamida 2.4 - 40
Bio-Gel P-100 Policrilamida 5 - 100
Bio-Gel P-300 Policrilamida 60 - 400
Sepharose 6B Agarose 10 - 4.000
Sepharose 4B Agarose 60 - 20.000
Sepharose 2B Agarose 70 - 40.000
NOME TIPO FAIXA DE RESOLUÇÃO
(kD)
*Sephadex e Sepharose: Amersham Pharmacia Biotech; Bio -Gel: Bio-Rad Laboratories
indica quais os tamanhos das
partículas que podem entrar
nos poros da resina e serem
fracionados. Acima ou abaixo
da faixa, não há separação.
Moléculas pequenas
Proteínas
Moléculas pequenas
Proteínas
Células, partículas sub-celulares

37. Móvel
• A velocidade de passagem do soluto pelo recheio
depende do tempo médio que as moléculas passam
no líquido dentro do gel.

38. Essa técnica tem propriedades desejáveis :
• Simplicidade técnica;
• Insensibilidade a solventes e temperatura;
• Condições amenas e versatilidade.

39. Cromatografia de afinidade

40. • Separar proteínas em base de uma interação reversível entre
uma proteína (ou grupo de proteínas) e um ligante específico
juntou a uma matriz cromatográfica;
• A técnica é ideal para uma captura ou passo de intermediário
em um protocolo de purificação e pode ser usado sempre
que um ligante satisfatório está disponível para o proteína(s)
de interesse.

41. Relações biológicas entre substâncias
• Enzimas: substratos, inibidores competitivos, cofatores;
• Anticorpos: antígenos, células;
•Lectinas: glicoproteínas, polissacarídeos;
• Hormônios e vitaminas: receptores, proteínas transportadoras;
• proteínas nativas com histidina, e/ou de cisteína;
• resíduos de triptofano nas superfícies deles/delas.

42. Aplicações
• Purificar e concentrar uma substância de uma mistura em
uma solução tampão;
• Reduzir a quantidade de uma substância em uma mistura;
• Entender as ligações entre compostos biológicos e
determinadas substâncias,como drogas;
• Purificar e concentrar uma solução enzimática;
• Purificação de antígenos,antibióticos,ácidos nucléicos.

43. Componentes

44. Matriz
• Devem ser mecânica e quimicamente estável sob
condições de acoplamento;
• As variações de Ph,força iônica, temperatura ;
• Presença de agentes desnaturantes(uréia, cloreto de
guanidina e detergentes;
• Uniforme;
• Esféricas;
• Porosa;

45. • Deve interagir fracamente com macromoléculas,
diminuindo a adsorção não especifica das mesmas.
• Grupos químicos que possam ser ativados ou
modificados para permitirem a ligação de uma
variedade de ligantes.

46. Tipos de matriz
• Agarose:
(cadeia linear de polissacarídeos,sem ligações covalentes cruzadas).
• Celulose:
(bipolímero linear de glicose;apresenta estrutura física instável,perda de porosidade e
forma geométrica irregular);
• Dextrano:
(polímero de unidades de glicose;elevado numero de grupos hidroxilas disponíveis; mais
hidrofílica que a agarose)
• Poliacrilamida:
(estabilidade em ph,não contem grupos ionizáveis,são formados por uma estrutura de
hidrocarbonetos).

47. Acoplamento do ligante à matriz
• Meio alcalino ( ph 8-9);
• Tampão: Borato ou bicarbonato:
• Devem apresentar grande força iônica para prevenir
ou minimizar as interações que podem ocorrer entre
moléculas ligantes de alta massa molecular.

49. Passos da purificação

52. ESPECIFICIDADE BIOLÓGICA
FASE ESTACIONÁRIA ELUIÇÃO DAS PROTEÍNAS

53. Fase estacionária
• Nessa fase a proteína de interesse se liga ao
composto contido do tubo;
• Imobilização covalente de ligantes específicos à
matriz ou suporte sólido.

54. Eluição
• Alteração do Ph e /ou força iônica do meio,que
torna o complexo molécula-ligante menos estável;
• Dissociação do mesmo ;
• Maior afinidade pelo ligante do que a molécula
que se deseja purificar.

55. Métodos de eluição

56. Ligações fracas :
• Pontes de hidrogênio;
• Hidrofóbicas;
• Interações eletrostáticas.

57. Ocorre alterações no complexo macromolécula-ligante