Aula curta e bem objetiva com aula prática sobre uso da cromatografia na purificação de proteínas recombinantes.

1. PURIFICAÇÃO DE PROTEÍNAS
RECOMBINANTES POR
CROMATOGRAFIA DE TROCA-IÔNICA
KÁTIA SANCHES FRANÇOSO
Farmacêutica e Bioquímica
Mestre em Farmácia – Análises Clínicas
Especialista de Laboratório
Laboratório de Parasitologia Clínica
katiafrancoso@gmail.com

2. CROMATOGRAFIA
Técnica de separação de misturas, baseada na passagem da
mistura através de duas fases: uma estacionária (fixa) e
outra móvel.
A separação depende da diferença de interação dos analitos
entre a fase móvel e a fase estacionária.
Propriedades Metodologia
Tamanho Gel filtração
Carga Cromatografia de troca-iônica
Hidrofobicidade Cromatografia de fase reversa
Capacidade de interação com
metais
Cromatografia de afinidade com
metal imobilizado
Reconhecimento específico Cromatografia de afinidade

3. TÉCNICAS CROMATOGRÁFICAS
Gel-filtração Interação
hidrofóbica
Troca-iônica Afinidade

4. GEL-FILTRAÇÃO
Promove a separação das proteínas de
acordo com o tamanho molecular
TIPOS DE INTERAÇÃO:
Não há interação
VANTAGENS:
Pode ser usada com qualquer tampão;;
Não há interferência de pH, força-iônica ou
temperatura;
DESVANTAGENS:
Pequenos volumes de amostra;
Diluição da amostra.

5. INTERAÇÃO HIDROFÓBICA
Interação entre a proteína alvo (analito) e uma matriz hidrofóbica (fase
estacionária).
TIPO DE INTERAÇÃO:
Hidrofobicidade
ELUIÇÃO:
Alteração de pH, força iônica ou polaridade
Adição de detergentes

6. CROMATOGRAFIA DE AFINIDADE
Interação entre a proteína alvo (analito) e um ligante específico
imobilizado na matriz cromatográfica (fase estacionária).
TIPOS DE INTERAÇÃO:
Antígeno – anticorpo
Hormônio – Receptor
Afinidade por íons metálicos (histidina)
VANTAGENS:
Elevada sensibilidade
Elevada resolução
Elevada capacidade de purificação
ELUIÇÃO:
Ligante competitivo
Alteração de pH, força iônica ou polaridade

7. CROMATOGRAFIA DE TROCA-IÔNICA
Interação entre a proteína alvo (analito) e um imobilizado na matriz
cromatográfica (fase estacionária), através de interação por carga.
INTERAÇÃO DEPENDE DA CARGA DA PROTEÍNA
Não interage
pH ácido pH básico
Interage com resinas
negativas (trocadores
catiônicos)
Interage com resinas
positivas (trocadores
aniônicos)
ELUIÇÃO:Elevação na concentração de sal ou alteração de pH

8. PURIFICAÇÃO DE PROTEÍNAS
RECOMBINANTES
AULA PRÁTICA

9. Quais as diferenças entre as
proteínas?
CARACTERÍSTICAS DA PROTEÍNA ALVO
Qual estratégia utilizar?
Proteína recombinante expressa em levedura e secretada no meio
Peso molecular: 53kDa e pI: 6,53
Possui cauda de histidina

10. LAVAGEM ELUIÇÃO
Cromatografia de
troca-iônica
IMIDAZOL
CROMATOGRAFIA DE AFINIDADE

11. -
-
--
--
--
---
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
++
++
++
++
++
-
-
--
--
--
---
+
+
+
+
+
+
++
++
++
++
++
LAVAGEM ELUIÇÃO
NaCL
CROMATOGRAFIA DE TROCA-IÔNICA

12. SISTEMA ÄKTA-PRIME
COLUNA
COLETOR
DETECTOR
UV
BOMBA
GE HEALTHCARE
Injeção da amostra

13. Coluna HiTrap QFF
Trocador aniônico
SISTEMA ÄKTA-PRIME
Solução A (equilíbrio) – Tris-HCl 20mM; pH=8.0
Solução B (eluição) – Tris-HCl 20mM + NaCl 1M; pH=8.0
Proteína dialisada em solução de equilíbrio

14. SDS-Page
116.0
66.2
45.0
35.0
25.0
18.4
14

15. www.labacademy.com.br