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1ª Aula Prática de citologia



                    Identificação de proteínas e glicídios

   O amido quando tratado com Lugol, modifica sua coloração, pois o amido reage
com o iodo na presença de iodeto, formando um complexo de cor azul intensa,
sendo visivel em concentraçoes minimas de iodo.

       Após o tratamento com Lugol, pode-se observar os granulos do amido no
microscópio óptico, para a detecção se existe uma alteração no alimento composto
de amido, deve-se verificar os granulos e compará-los, se estiverem diferentes,
existe grande possibilidade de adição de outros compostos.

      O amido é uma mistura de dois polissacarídeos estruturalmente diferentes:
amilose e amilopectina. A composição do amido é α-amilose, uma cadeia linear de
resíduos de glicose unidos por ligações glicosídicas α-1,4 (que conferem a molécula
uma estrutura helicoidal) e de amilopectina (proteína menos hidrossolúvel que a
amilose), de cadeia principal idêntica a amilose, além disso contém ramificações
formadas, como no glicogênio, por ligações glicosidicas α-1,6. Na amilopectina
estas ramificações ocorrem a cada 30 ou 20 resíduos de glicose, enquanto no
glicogênio , a freqüência é, em média, de uma ramificação a cada 10 resíduos.

MATERIAIS


Açúcar;
Farinha;
Maizena;
Arroz;
Leite em pó;
Água destilada;
Lugol;
Tubos de ensaio;
Pistilo e gral;
Bastão de vidro;
Pipeta pasteur;
      Lâminas;
      Microscópio óptico;
      Estante.

      PROCEDIMENTO

           Colocou-se em cada tubo, um alimento diferente, menos o arroz, estes alimentos
      foram dissolvidos em água destilada e anotada a coloração inicial. O arroz foi
      colocado no gral e amassado, com água destilada e o líquido encontrado colocou-se
      em outro tubo de ensaio.

      Em cada tubo de ensaio adicionou-se 2 gotas de lugol e foi homogenizado e
      novamente anotou-se a coloração.




      5 RESULTADOS


Açúcar:
      Coloração inicial: transparente;
      Coloração final: amarelo.


Farinha:
      Coloração inicial: branco translúcido;
      Coloração final: roxo escuro.


Maizena:
      Coloração inicial: branco opaco;
      Coloração final: roxo claro.


Arroz:
      Coloração inicial: branco leitoso;


Coloração final: roxo claro.
Leite em pó:
      Coloração inicial: branco;
      Coloração final: amarelo.


Água destilada:
      Coloração inicial: transparente;
      Coloração final: amarelo cítrico.


Coloração final: roxo claro.


Leite em pó:
      Coloração inicial: branco;
      Coloração final: amarelo.


Água destilada:
      Coloração inicial: transparente;
      Coloração final: amarelo cítrico.



      6 CONCLUSÃO

            Através deste experimento concluímos que apenas a maizena, o arroz e a
      farinha são amido, no final do mesmo, podemos encontrar estes grânulos no
      microscópio

                       Propriedades gerais das proteínas



      Objetivos

         -   reconhecer as proteínas como moléculas eletricamente carregadas
         -   analisar a influência do pH sobre essas cargas
         -   reconhecer os grupamentos responsáveis pela solubilidade das proteínas em
      água
         -   identificar os agentes que podem alterar essa solubilidade
Introdução

    Vimos no experimento anterior que a solubilidade das proteínas em meio
aquoso deve-se, em grande parte, à distribuição das cargas elétricas ao longo da
molécula. Nesse sentido, se a interação proteína-proteína é grande e a interação
proteína - água é pequena, a proteína tenderá a ser insolúvel.
Uma das maneiras de promover a precipitação de uma proteína é atingir seu ponto
isoelétrico. Porém, existem outros fatores que influem de maneira importante nessa
propriedade física das proteínas, como a ação de ácidos, bases, sais e solventes
orgânicos. Além disso, podemos incluir a temperatura como um agente que pode
ser utilizado para diminuir a solubilidade de uma proteína.
    Vamos lá:

3. Princípios teóricos e procedimento experimental

a) Precipitação de proteínas por adição de sais neutros (efeito da força iônica)

     Quando adicionamos sais neutros a uma solução, ocorre um aumento da força
iônica do sistema. Assim, quando adicionamos pequenas quantidades de sal a uma
solução contendo proteínas, as cargas provenientes da dissociação do sal passam a
interagir com as moléculas protéicas, diminuindo a interação entre elas.
Conseqüentemente, temos um aumento da solubilidade da proteína no meio
aquoso. as interações proteína - proteína, favorecendo a solubilidade das mesmas.
A esse fenômeno dá-se o nome de "salting-in". Esse efeito, porém, não se estende
indefinidamente. Em condições de elevada força iônica, decorrente da adição de
grandes quantidades de sal, temos o efeito contrário. O que acontece?
     Imagine uma solução aquosa de proteína à qual foi adicionada uma certa
quantidade de sal neutro. A água, que apresenta um grande poder de solvatação,
passa a interagir com as duas espécies: as proteínas e os íons provenientes da
dissociação do sal. Porém, as moléculas de água apresentam maior tendência de
solvatação de partículas menores (nesse caso, os íons). As moléculas de água,
ocupadas em sua interação com os íons, "abandonam" a estrutura protéica. Como
conseqüência, temos: maior interação proteína-proteína, diminuição da solubilidade
em meio aquoso e, conseqüentemente, precipitação da proteína. A esse fenômeno
de insolubilização da proteína em decorrência de um considerável aumento da força
iônica do meio dá-se o nome de "salting-out".
     A precipitação de proteínas pela alta concentração de sais é um processo muito
importante para a separação de misturas complexas de proteínas, uma vez que a
concentração de sal necessária para precipitação é diferente para cada proteína.

     a.1. Material


     a) Reagentes e soluções                                              b) Vidraria e instrumental

    - solução de clara de ovo (pode ser utilizada outra solução           - 01 tubo de ensaio
de proteína)*                                                             - pipetas (vidro ou plástica)
    - solução saturada de sulfato de amônio [(NH4)2SO4]**
    - solução de NaCl
    - água destilada


     * Preparo da solução de clara de ovo: 1 volume de clara + 4 volumes de NaCl
1%
** Preparo da solução saturada de (NH4)2SO4:7,7g do sal em 10 ml de água
destilada

    a.2. Procedimento

   1. Em um tubo de ensaio, colocar 2
ml da solução de proteínas;
   2. adicionar, deixando escorrer
pelas paredes do tubo, 2 ml da solução
de sulfato de amônio;
   3. observe.                                      Veja as fotos desse experimento
   4. Misture o conteúdo do tubo (por
inversão) e anote os resultados.
   5. Repita as etapas anteriores
usando NaCl ao invés de (NH4)2SO4. O
que você observou?

b) Precipitação por sais de metais pesados e por ácidos fortes

     Os cátions de metais pesados como Hg2+, Pb2+, Cu2+, Fe2+, Cd2+ e Zn2+ formam
precipitados insolúveis de proteínas, denominados de acordo com o elemento
formador (exemplo: proteinato de mercúrio, proteinato de chumbo, etc.). Essa
precipitação é mais intensa quando o pH está acima do ponto isoelétrico (pI). Isso
porque, acima do pI, a carga líquida sobre a proteína é negativa (ver determinação
do ponto isoelétrico da caseína), favorecendo a interação com os cátions
provenientes do sal.
     Então não é possível promover a precipitação de uma proteína abaixo do ponto
isoelétrico?
     A resposta correta seria: não com sais... A precipitação abaixo do ponto
isoelétrico pode ser feita, sim, mas através da adição de ácidos fortes.
     Comparando com o mecanismo anterior: quando a proteína está abaixo do seu
pI, a carga líquida total da molécula é positiva. Isso facilita a interação da molécula
com os ânions provenientes de ácidos como o tunguístico, o fosfotunguístico e
pírico.
     Nas duas situações o precipitado pode ser ressolubilizado através de alterações
do pH.

    b.1. Material


    a) Reagentes e soluções                                              b) Vidraria e instrumental

    -   solução de proteínas preparada acima                             - 01 tubo de ensaio
    -   solução de (CH3COO)2Pb.3H2O (acetato de chumbo) a 20%            - pipetas (vidro ou plásticas)
    -   solução de ácido tricloroacético (CCl 3COOH) 10%
    -   água destilada


        b.2. Procedimento


     a) Precipitação por sais de metais
pesados
                                                    Veja as fotos desse experimento
    1. Em um tubo de ensaio, colocar
1ml da solução de proteínas;
2. adicionar 0,5 ml da solução de
acetato de chumbo
    3. adicionar 5 ml de água
destilada;
    4. observe e interprete os
resultados.

    b) Precipitação por ácidos

    Repita o procedimento anterior, substituindo a solução de acetato de chumbo
pela solução de ácido tricloroacético a 10%.

c) Precipitação por ação do calor (desnaturação)

    As proteínas possuem uma estrutura tridimensional (conformação) bem
definida, da qual dependem fundamentalmente suas propriedades físicas, químicas
e biológicas. Essa estrutura é relativamente sensível à ação do calor, que causa
desorganização das cadeias peptídicas, com conseqüente alteração conformacional.
Esse fenômeno recebe o nome de desnaturação, e altera as estruturas
quaternária, terciária e secundária da proteína sem afetar sua estrutura primária.
    A desnaturação promove alterações que diminuem a solubilidade da proteína,
levando à sua precipitação. Essa precipitação é máxima no ponto isoelétrico da
proteína e pode sofrer alterações pela adição de sais.

    c.1. Material


                                                             b) Vidraria e instrumental
   a) Reagentes e soluções

                                                             - 01 tubos de ensaio
   - solução de proteínas
                                                             - pipeta (vidro ou plástica)

    c.2. Procedimento

     1. Colocar 5 ml da solução de
proteínas em um tubo de ensaio;
    2. deixar o tubo em banho-maria
fervente por 5 minutos (o tubo
                                                        Veja as fotos desse experimento
também pode ser aquecido direto na
chama de um bico de Bunsen);
    3. retire o tubo do banho, observe
e anote os resultados.

d) Precipitação das proteínas por solventes orgânicos

     A solubilidade das proteínas em solventes orgânicos é menor do que em água.
Isso acontece porque a capacidade de interação com as partículas de soluto é
diferente para cada solvente. A grandeza que mede a capacidade de interação do
solvente com o soluto é denominada constante dielétrica. A água apresenta
constante dielétrica bastante elevada (aproximadamente 80). Mas o que isso quer
dizer?
     Vamos utilizar novamente a imaginação. Numa solução contendo,
exclusivamente, água e moléculas protéicas temos: interação água - proteína e
interação proteína-proteína. Nesse caso, podemos afirmar com certeza que o
primeiro tipo de interação prevalecerá sobre o segundo porque a água possui
grande capacidade de separação das partículas do soluto (constante dielétrica
elevada).
Para os solventes orgânicos a situação é um pouco diferente... Como esse tipo de
solvente apresenta valor de constante dielétrica bem inferior à da água, a interação
proteína-proteína "vence" o poder de solvatação da água (interação água-proteína).
A proteína precipita.
    A precipitação por solventes orgânicos depende muito da temperatura. Os
solventes orgânicos, quando utilizados a temperaturas baixas, são bastante úteis
na separação de misturas de proteínas. A temperaturas mais elevadas esses
solventes podem levar à desnaturação por rompimento das pontes de hidrogênio e
estabelecimento de interações apolares, importantes na manutenção da
conformação protéica.

    c.1. Material


   a) Reagentes e soluções                                             b) Vidraria e instrumental

   -   solução de proteínas                                            - 04 tubos de ensaio
   -   etanol (CH3CH2OH) 95% gelado                                    - pipetas (vidro ou plásticas)
   -   acetona (CH3COCH3) gelada
   -   cloreto de sódio (NaCl) sólido
   -   água destilada


       c.2. Procedimento

    OBS: trabalhar a baixa temperatura

     1. Tome dois tubos de ensaio e
coloque, em cada um, 2 ml da solução
de proteínas;
     2. adicionar 4 ml de etanol gelado
a cada tubo;
     3. agite;
     4. em um dos tubos, coloque uma
pequena quantidade de NaCl sólido,
sob agitação;                                     Veja as fotos desse experimento
     5. observe e responda: qual o
efeito do álcool sobre a proteína na
presença e na ausência do eletrólito?
     6. Adicione 6 ml de água destilada
e observe.
     7. Repita as etapas anteriores
substituindo o etanol pela acetona;
     8. compare os resultados.

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1ª aula prática proteínas

  • 1. 1ª Aula Prática de citologia Identificação de proteínas e glicídios O amido quando tratado com Lugol, modifica sua coloração, pois o amido reage com o iodo na presença de iodeto, formando um complexo de cor azul intensa, sendo visivel em concentraçoes minimas de iodo. Após o tratamento com Lugol, pode-se observar os granulos do amido no microscópio óptico, para a detecção se existe uma alteração no alimento composto de amido, deve-se verificar os granulos e compará-los, se estiverem diferentes, existe grande possibilidade de adição de outros compostos. O amido é uma mistura de dois polissacarídeos estruturalmente diferentes: amilose e amilopectina. A composição do amido é α-amilose, uma cadeia linear de resíduos de glicose unidos por ligações glicosídicas α-1,4 (que conferem a molécula uma estrutura helicoidal) e de amilopectina (proteína menos hidrossolúvel que a amilose), de cadeia principal idêntica a amilose, além disso contém ramificações formadas, como no glicogênio, por ligações glicosidicas α-1,6. Na amilopectina estas ramificações ocorrem a cada 30 ou 20 resíduos de glicose, enquanto no glicogênio , a freqüência é, em média, de uma ramificação a cada 10 resíduos. MATERIAIS Açúcar; Farinha; Maizena; Arroz; Leite em pó; Água destilada; Lugol; Tubos de ensaio; Pistilo e gral; Bastão de vidro;
  • 2. Pipeta pasteur; Lâminas; Microscópio óptico; Estante. PROCEDIMENTO Colocou-se em cada tubo, um alimento diferente, menos o arroz, estes alimentos foram dissolvidos em água destilada e anotada a coloração inicial. O arroz foi colocado no gral e amassado, com água destilada e o líquido encontrado colocou-se em outro tubo de ensaio. Em cada tubo de ensaio adicionou-se 2 gotas de lugol e foi homogenizado e novamente anotou-se a coloração. 5 RESULTADOS Açúcar: Coloração inicial: transparente; Coloração final: amarelo. Farinha: Coloração inicial: branco translúcido; Coloração final: roxo escuro. Maizena: Coloração inicial: branco opaco; Coloração final: roxo claro. Arroz: Coloração inicial: branco leitoso; Coloração final: roxo claro.
  • 3. Leite em pó: Coloração inicial: branco; Coloração final: amarelo. Água destilada: Coloração inicial: transparente; Coloração final: amarelo cítrico. Coloração final: roxo claro. Leite em pó: Coloração inicial: branco; Coloração final: amarelo. Água destilada: Coloração inicial: transparente; Coloração final: amarelo cítrico. 6 CONCLUSÃO Através deste experimento concluímos que apenas a maizena, o arroz e a farinha são amido, no final do mesmo, podemos encontrar estes grânulos no microscópio Propriedades gerais das proteínas Objetivos - reconhecer as proteínas como moléculas eletricamente carregadas - analisar a influência do pH sobre essas cargas - reconhecer os grupamentos responsáveis pela solubilidade das proteínas em água - identificar os agentes que podem alterar essa solubilidade
  • 4. Introdução Vimos no experimento anterior que a solubilidade das proteínas em meio aquoso deve-se, em grande parte, à distribuição das cargas elétricas ao longo da molécula. Nesse sentido, se a interação proteína-proteína é grande e a interação proteína - água é pequena, a proteína tenderá a ser insolúvel. Uma das maneiras de promover a precipitação de uma proteína é atingir seu ponto isoelétrico. Porém, existem outros fatores que influem de maneira importante nessa propriedade física das proteínas, como a ação de ácidos, bases, sais e solventes orgânicos. Além disso, podemos incluir a temperatura como um agente que pode ser utilizado para diminuir a solubilidade de uma proteína. Vamos lá: 3. Princípios teóricos e procedimento experimental a) Precipitação de proteínas por adição de sais neutros (efeito da força iônica) Quando adicionamos sais neutros a uma solução, ocorre um aumento da força iônica do sistema. Assim, quando adicionamos pequenas quantidades de sal a uma solução contendo proteínas, as cargas provenientes da dissociação do sal passam a interagir com as moléculas protéicas, diminuindo a interação entre elas. Conseqüentemente, temos um aumento da solubilidade da proteína no meio aquoso. as interações proteína - proteína, favorecendo a solubilidade das mesmas. A esse fenômeno dá-se o nome de "salting-in". Esse efeito, porém, não se estende indefinidamente. Em condições de elevada força iônica, decorrente da adição de grandes quantidades de sal, temos o efeito contrário. O que acontece? Imagine uma solução aquosa de proteína à qual foi adicionada uma certa quantidade de sal neutro. A água, que apresenta um grande poder de solvatação, passa a interagir com as duas espécies: as proteínas e os íons provenientes da dissociação do sal. Porém, as moléculas de água apresentam maior tendência de solvatação de partículas menores (nesse caso, os íons). As moléculas de água, ocupadas em sua interação com os íons, "abandonam" a estrutura protéica. Como conseqüência, temos: maior interação proteína-proteína, diminuição da solubilidade em meio aquoso e, conseqüentemente, precipitação da proteína. A esse fenômeno de insolubilização da proteína em decorrência de um considerável aumento da força iônica do meio dá-se o nome de "salting-out". A precipitação de proteínas pela alta concentração de sais é um processo muito importante para a separação de misturas complexas de proteínas, uma vez que a concentração de sal necessária para precipitação é diferente para cada proteína. a.1. Material a) Reagentes e soluções b) Vidraria e instrumental - solução de clara de ovo (pode ser utilizada outra solução - 01 tubo de ensaio de proteína)* - pipetas (vidro ou plástica) - solução saturada de sulfato de amônio [(NH4)2SO4]** - solução de NaCl - água destilada * Preparo da solução de clara de ovo: 1 volume de clara + 4 volumes de NaCl 1%
  • 5. ** Preparo da solução saturada de (NH4)2SO4:7,7g do sal em 10 ml de água destilada a.2. Procedimento 1. Em um tubo de ensaio, colocar 2 ml da solução de proteínas; 2. adicionar, deixando escorrer pelas paredes do tubo, 2 ml da solução de sulfato de amônio; 3. observe. Veja as fotos desse experimento 4. Misture o conteúdo do tubo (por inversão) e anote os resultados. 5. Repita as etapas anteriores usando NaCl ao invés de (NH4)2SO4. O que você observou? b) Precipitação por sais de metais pesados e por ácidos fortes Os cátions de metais pesados como Hg2+, Pb2+, Cu2+, Fe2+, Cd2+ e Zn2+ formam precipitados insolúveis de proteínas, denominados de acordo com o elemento formador (exemplo: proteinato de mercúrio, proteinato de chumbo, etc.). Essa precipitação é mais intensa quando o pH está acima do ponto isoelétrico (pI). Isso porque, acima do pI, a carga líquida sobre a proteína é negativa (ver determinação do ponto isoelétrico da caseína), favorecendo a interação com os cátions provenientes do sal. Então não é possível promover a precipitação de uma proteína abaixo do ponto isoelétrico? A resposta correta seria: não com sais... A precipitação abaixo do ponto isoelétrico pode ser feita, sim, mas através da adição de ácidos fortes. Comparando com o mecanismo anterior: quando a proteína está abaixo do seu pI, a carga líquida total da molécula é positiva. Isso facilita a interação da molécula com os ânions provenientes de ácidos como o tunguístico, o fosfotunguístico e pírico. Nas duas situações o precipitado pode ser ressolubilizado através de alterações do pH. b.1. Material a) Reagentes e soluções b) Vidraria e instrumental - solução de proteínas preparada acima - 01 tubo de ensaio - solução de (CH3COO)2Pb.3H2O (acetato de chumbo) a 20% - pipetas (vidro ou plásticas) - solução de ácido tricloroacético (CCl 3COOH) 10% - água destilada b.2. Procedimento a) Precipitação por sais de metais pesados Veja as fotos desse experimento 1. Em um tubo de ensaio, colocar 1ml da solução de proteínas;
  • 6. 2. adicionar 0,5 ml da solução de acetato de chumbo 3. adicionar 5 ml de água destilada; 4. observe e interprete os resultados. b) Precipitação por ácidos Repita o procedimento anterior, substituindo a solução de acetato de chumbo pela solução de ácido tricloroacético a 10%. c) Precipitação por ação do calor (desnaturação) As proteínas possuem uma estrutura tridimensional (conformação) bem definida, da qual dependem fundamentalmente suas propriedades físicas, químicas e biológicas. Essa estrutura é relativamente sensível à ação do calor, que causa desorganização das cadeias peptídicas, com conseqüente alteração conformacional. Esse fenômeno recebe o nome de desnaturação, e altera as estruturas quaternária, terciária e secundária da proteína sem afetar sua estrutura primária. A desnaturação promove alterações que diminuem a solubilidade da proteína, levando à sua precipitação. Essa precipitação é máxima no ponto isoelétrico da proteína e pode sofrer alterações pela adição de sais. c.1. Material b) Vidraria e instrumental a) Reagentes e soluções - 01 tubos de ensaio - solução de proteínas - pipeta (vidro ou plástica) c.2. Procedimento 1. Colocar 5 ml da solução de proteínas em um tubo de ensaio; 2. deixar o tubo em banho-maria fervente por 5 minutos (o tubo Veja as fotos desse experimento também pode ser aquecido direto na chama de um bico de Bunsen); 3. retire o tubo do banho, observe e anote os resultados. d) Precipitação das proteínas por solventes orgânicos A solubilidade das proteínas em solventes orgânicos é menor do que em água. Isso acontece porque a capacidade de interação com as partículas de soluto é diferente para cada solvente. A grandeza que mede a capacidade de interação do solvente com o soluto é denominada constante dielétrica. A água apresenta constante dielétrica bastante elevada (aproximadamente 80). Mas o que isso quer dizer? Vamos utilizar novamente a imaginação. Numa solução contendo, exclusivamente, água e moléculas protéicas temos: interação água - proteína e interação proteína-proteína. Nesse caso, podemos afirmar com certeza que o primeiro tipo de interação prevalecerá sobre o segundo porque a água possui
  • 7. grande capacidade de separação das partículas do soluto (constante dielétrica elevada). Para os solventes orgânicos a situação é um pouco diferente... Como esse tipo de solvente apresenta valor de constante dielétrica bem inferior à da água, a interação proteína-proteína "vence" o poder de solvatação da água (interação água-proteína). A proteína precipita. A precipitação por solventes orgânicos depende muito da temperatura. Os solventes orgânicos, quando utilizados a temperaturas baixas, são bastante úteis na separação de misturas de proteínas. A temperaturas mais elevadas esses solventes podem levar à desnaturação por rompimento das pontes de hidrogênio e estabelecimento de interações apolares, importantes na manutenção da conformação protéica. c.1. Material a) Reagentes e soluções b) Vidraria e instrumental - solução de proteínas - 04 tubos de ensaio - etanol (CH3CH2OH) 95% gelado - pipetas (vidro ou plásticas) - acetona (CH3COCH3) gelada - cloreto de sódio (NaCl) sólido - água destilada c.2. Procedimento OBS: trabalhar a baixa temperatura 1. Tome dois tubos de ensaio e coloque, em cada um, 2 ml da solução de proteínas; 2. adicionar 4 ml de etanol gelado a cada tubo; 3. agite; 4. em um dos tubos, coloque uma pequena quantidade de NaCl sólido, sob agitação; Veja as fotos desse experimento 5. observe e responda: qual o efeito do álcool sobre a proteína na presença e na ausência do eletrólito? 6. Adicione 6 ml de água destilada e observe. 7. Repita as etapas anteriores substituindo o etanol pela acetona; 8. compare os resultados.