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UNIVERSIDADE ESTADUAL DO CENTRO-OESTE
SETOR DE CIÊNCIAS AGRÁRIAS E AMBIENTAIS
      DEPARTAMENTO DE BIOLOGIA
    DANIELLY DE CASTRO SCHUPCHEK
          FELIPE M. BUCO
           SAULO BALLS
      SHARONN M. HARTMANN




     AULA PRÁTICA N° 5
   ESPECTROFOTOMETRIA



                     Relatório apresentado como requisito para
                   obtenção de nota parcial, na disciplina de
                   Bioquímica do curso de Ciências Biológicas da
                   Universidade   Estadual   do   Centro-Oeste   –
                   UNICENTRO.


                   Professora: Franciely Grose Colodi




             GUARAPUAVA
2



2012
3



                                                             SUMÁRIO




1. INTRODUÇÃO........................................................................................................................03

2. OBJETIVOS.............................................................................................................................04

2.1 OBJETIVOS GERAIS...........................................................................................................04
2.2 OBJETIVOS ESPECIFICOS...............................................................................................04

3. MATERIAIS E MÉTODOS....................................................................................................04

3.1 REAGENTES.........................................................................................................................04

3.2 PROCEDIMENTOS..............................................................................................................04

4. RESULTADOS E DISCUSSÃO.............................................................................................06

4.1 CURVA DE ABSORÇÃO.................................................................................................... 06

4.2 CURVA DE REFERÊNCIA OU CURVA DE CALIBRAÇÃO....................................... 07

4.3 DETERMINAÇÃO DA CONCENTRAÇÃO DE PROTEÍNAS NA AMOSTRA
PROBLEMA.................................................................................................................................07

5. CONCLUSÃO..........................................................................................................................09

6. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS...................................................................................10

7. APÊNDICE...............................................................................................................................11
4



           1. INTRODUÇÃO

           O termo medida fotométrica foi definido originalmente como o ato de medir a
intensidade da luz, independente do comprimento de onda (energia). Neste tipo de medida é
utilizada a espectrofotometria que se baseia na absorção da radiação nos comprimentos de onda
entre o ultravioleta e o infravermelho. O aparelho espectrofotômetro faz passar um feixe de luz
monocromática através de uma solução, e mede a quantidade de luz que foi absorvida por essa
solução. Um prisma contido no aparelho separa a luzem feixes com diferentes comprimentos de
onda. Assim é possível passar um feixe de luz monocromática através da amostra. O
equipamento permite saber que quantidade de luz é absorvida a cada comprimento de onda.
           O conjunto das absorbâncias aos vários comprimentos de onda para um composto
chama-se espectro de absorção e varia de substância para substância. Como diferentes
substâncias têm diferentes padrões de absorção, a espectrofotometria permite identificar e
quantificar substâncias com base no seu espectro. A quantificação é realizada com a relação entre
quantidade de luz absorvida e concentração da substância. A absorção da luz é tanto maior
quanto mais concentrada for a solução por ela atravessada e quanto maior for a distância
percorrida pelo feixe luminoso através da amostra. Esses princípios formam a Lei de Lambert –
Beer
           Para   determinação   da   concentração   de   um   soluto   em   uma   amostra   por
espectrofotometria, temos a comparação da absorbância da amostra com uma solução padrão, na
qual já é conhecida a concentração do soluto. Em geral, é utilizada uma solução-padrão com
diferentes concentrações (padrões de referência), que tem sua absorbância determinada. Esses
padrões são preparados diluindo-se a solução-padrão na proporção necessária para a obtenção das
concentrações desejadas.
           Com os valores de absorbância e de concentração conhecidos, pode-se traçar um gráfico
cujo perfil é conhecido como “curva-padrão” ou “curva analítica”. Nesse gráfico, a reta indica a
proporcionalidade entre o aumento da concentração e da absorbância e a porção linear
correspondente ao limite de sensibilidade do método espectrofotométrico para o soluto em
questão.
5



           2 OBJETIVOS


           2.1 OBJETIVO GERAL


           Abordar a espectrofotometria como método analítico na determinação da concentração.


           2.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS


           •    Determinar a curva de absorção do Reagente de Biureto em presença da proteína
albumina;
           •    Elaborar uma curva de calibração para dosagem de proteínas pelo método do
Biureto;
           •    Determinar a concentração de proteína em uma amostra-problema;
           •    Exercitar a prática de diluição na determinação da concentração,
           •    Montar a curva de referência com auxílio do programa EXCEL® no computador.


           3 MATERIAIS E MÉTODOS


           3.1 REAGENTES

           Foram utilizados como reagentes: solução padrão de proteína (albumina) 5 mg/mL,
amostra problema de concentração desconhecida e reagente de Biureto.


           3.2 PROCEDIMENTOS


           Utilizamos seis tubos de ensaio que foram numerados de 1 a 6 para realizar o
experimento.
           Cada tubo foi preparado da seguinte forma:


           1° Tubo: (branco) 1,0 ml de água destilada e 5,0 ml de reagente de biureto;
6



           2° Tubo: 0,2 ml de solução padrão de proteína (5mg/mL), 0,8 ml de água destilada e 5,0
ml de reagente de biureto;
           3° Tubo: 0,4 ml de solução padrão de proteína (5mg/mL), 0,8 ml de água destilada e 5,0
ml de reagente de biureto;
           4° Tubo: 0,6 ml de solução padrão de proteína (5mg/mL), 0,4 ml de água destilada e 5,0
ml de reagente de biureto;
           5° Tubo: 0,8 ml de solução padrão de proteína (5mg/mL), 0,2 ml de água destilada e 5,0
ml de reagente de biureto,
           6° Tubo: 1,0 ml de solução padrão de proteína (5mg/mL) e 5,0 ml de reagente de
biureto.
           Logo após todos os tubos estarem prontos, foram agitados e deixados de repouso por 10
minutos.
           Depois de passado o tempo de repouso, calculou-se a concentração final de cada um,
usando a formula C1 . V1 = C2 . V2, e anotamos os resultados na tabela abaixo:

       TUBOS                 1          2           3           4           5           6
                                    5 . 0,2 =   5 . 0,4 =   5 . 0,6 =   5 . 0,8 =   5 . 1,0 =
     CALCULO                 -
                                      C2.1        C2 . 1      C2 . 1      C2 . 1      C2 . 1
 CONCENTRAÇÃO           BRANCO       1mg/ml      2mg/ml      3mg/ml      4mg/ml      5mg/ml


           Então, dando continuidade ao experimento, utilizou-se o espectrofotômetro para
determinar a curva de absorção do Reagente de Biureto em presença da proteína albumina,
utilizando os tubos 1 e 6 do experimento montado, para determinar:


           a)   Curva de absorção de proteína com Reagente de Biureto;
           b)   Curva de referência para determinar a concentração de uma amostra-problema,
           c)   Concentração de proteínas na amostra-problema.
7



        4. RESULTADOS E DISCUSSÃO


        4.1 CURVA DE ABSORÇÃO


        Para determinar a curva de absorção, foi ligado o espectrofotômetro e colocado o
conteúdo dos tubos 1 e 6 em duas cubetas diferentes que foram inseridas ambas no interior do
equipamento.
        O tubo 1 (branco) foi usado para calibrar/zerar o equipamento nos diferentes
comprimentos de onda (λ) a serem analisados antes da leitura de absorbância do tubo 6.
        Verificou-se a absorbância da solução do tubo 6 em diferentes λ no espectrofotômetro,
anotando os valores de absorbância para cada comprimento de onda utilizado na tabela abaixo:


     ʎ (nm)    Absorbância                          ʎ (nm)     Absorbância
 1   460                                        5   540        0.156
 2   480                                        6   560        0.154
 3   500       0.107                            7   580        0.142
 4   520       0.142                            8   600

        De acordo com os resultados da tabela acima, foi montado um gráfico correlacionando
comprimento de onda com absorbância do tubo 6, e de acordo com o gráfico, o              tubo 5
apresentou o ponto Maximo de absorbância:
8



        4.2 CURVA DE REFERÊNCIA OU CURVA DE CALIBRAÇÃO


        Para calibrar/zerar o espectrofotômetro foi utilizado o tudo 1: 0 de absorbância no
comprimento de onda que apresentou maior absorbância conforme a curva de absorção.


        Anotamos a absorbância das soluções dos tubos 2 a 6 na tabela abaixo:


      TUBOS                   1            2           3            4          5          6
   ABSORBÂNCIA              Branco       0.030       0.059        0.092      0.120      0.156

        4.3 DETERMINAÇÃO DA CONCENTRAÇÃO DE PROTEÍNAS NA AMOSTRA
        PROBLEMA


        Foram separados dois tubos de ensaio e identificados como tubo A (amostra-problema) e
tubo B (amostra-problema diluída), e adicionaram-se os reagentes conforme tabela abaixo:

                                                                Tubos
         Reagentes (ml)
                                               A                             B*
      Amostra problema                        1,0                            0,5
        Água destilada                         -                             0,5
      Reagente de Biureto                     5,0                            5,0

        Depois de preparados, os tubos foram deixados em repouso por 10 minutos.


        Utilizau-se o tubo 1 para calibrar o espectrofotômetro: 0 de absorbância no comprimento
de onda que apresentou maior absorbância conforme a curva de absorção

             Tubos                                 A                           B*
           Absorbância                           0,080                        0,047

       (*Fator de diluição da amostra = ___2_______)


       Resultado do volume total dividido pela amostra que foi colocada. Fator de diluição é
quantas vezes a amostra cabe no volume total após a diluição.
9



           Conforme os valores obtidos na curva de calibração, a concentração de proteínas
(mg/mL) presente nas amostras problema utilizando regra de três. Utilizamos como referencia
qualquer um dos valores obtidos na curva de calibração:


           Amostra problema – absorbância: 0, 047 concentração: x
           Tubo 2 absorbância: 0,03 concentração 1mg/ml
           0, 047 -------------------x   0,03x= 0,047
           0,03---------------------1    x= 0,047 / 0,03          x=1,57mg/ml.


           Utilizando o programa EXCEL®, encontramos a equação da reta referente a curva de
calibração conforme gráfico abaixo:




           Finalmente, para calcular a concentração de proteínas (mg/mL) presente nas amostras
problema utilizando a equação da reta obtida com a curva de calibração, obteve-se os seguintes
resultados:


           Y= a.x + b (excluímos b porque passa no 0)


           Tubo A: Abs = 0,03 . conc                0,08/0,03 = conc.  Conc. = 2,7 mg/ml
concentração original.


           Tubo B: Abs = 0,03 . conc        0,047/0,03 = conc.      Conc. = 1,6 mg/ml amostra
diluída.
10



        5 CONCLUSÃO


        Com o experimento pudemos abordar a espectrofotometria para determinar as
concentrações de algumas amostras e a concentração de proteína na amostra problema,
conseguimos determinar a curva de absorção para o reagente de biureto em presença da proteína
albumina. Também pudemos aplicar conhecimentos do programa EXCEL®, elaborando a curva
de calibração para dosagem de proteína e montamos a curva de referencia agregando novos
conhecimentos ao experimento.
             Então concluímos que os objetivos do experimento foram alcançados com êxito.
11



        6. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS


Universidade federal do rio grande do sul. Espectrofotometria. Disponível em: <
http://www.ufrgs.br/leo/site_espec/espectrodeantipiril.html>. Acesso em 28 de agosto de 2012.

NELSON, D.L.; COX, M.M. Lehninger: Principles of Biochemstry. 3ed. New York: Worth
Publishers, 2000. 1152p.
12



         7. APÊNDICE


         1.    Qual a finalidade e o fundamento da técnica espectrofotométrica?


         A espectrofotometria é o método de análises óptico mais usado nas investigações
biológicas e fisico-químicas. O espectrofotômetro é um instrumento que permite comparar a
radiação absorvida ou transmitida por uma solução que contém uma quantidade desconhecida de
soluto, e uma quantidade conhecida da mesma substância.
         Todas as substâncias podem absorver energia radiante, mesmo o vidro que parece
completamente transparente absorve comprimentos de ondas que pertencem ao espectro visível.
A água absorve fortemente na região do infravermelho.
         A absorção das radiações ultravioletas, visíveis e infravermelhas dependem das
estruturas das moléculas, e é característica para cada substância química.
         Quando a luz atravessa uma substância, parte da energia é absorvida (absorbância): a
energia radiante não pode produzir nenhum efeito sem ser absorvida.
         A cor das substâncias se deve a absorção (transmitância) de certos comprimentos de
ondas da luz branca que incide sobre elas, deixando transmitir aos nossos olhos apenas aqueles
comprimentos de ondas não absorvidos.


         2.    O que significa a linearidade dos métodos colorimétricos e como ela é
determinada?


         Linearidade – corresponde à capacidade do método de fornecer resultados diretamente
proporcionais à concentração da substância em exame (analito).


         3.    Que critério deve ser usado para selecionar determinado comprimento de onda
para uma técnica colorimétrica?


         Deve-se levar em conta a relação entre quantidade de luz absorvida e concentração da
substância. A absorção da luz é tanto maior quanto mais concentrada for a solução por ela
atravessada e quanto maior for a distância percorrida pelo feixe luminoso através da amostra.
13



        4.    Qual o conteúdo e a finalidade do tubo “branco”?


        O tubo 1 (branco) foi usado para calibrar/zerar o equipamento nos diferentes
comprimentos de onda (λ) a serem analisados antes da leitura de absorbância dos outros tubos. O
tubo branco foi preparado com 1,0 ml de água destilada e 5,0 ml de reagente de biureto.


        5.    De acordo com as Leis de Lambert-Beer, se um determinado composto apresenta
um máximo de absorção em 545nm e para uma concentração de 3mg/mL foi obtida uma
absorbância de 0,22, calcule a concentração deste composto correspondente a uma absorbância
de 0,15, sabendo-se que a linearidade do método utilizado é de 0,5 a 5mg/mL.


        0,22-------------------------3   0,22x=0,45   x=0,45/0,22   x= 2,41
        0,15-------------------------x

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Relatorio 5

  • 1. UNIVERSIDADE ESTADUAL DO CENTRO-OESTE SETOR DE CIÊNCIAS AGRÁRIAS E AMBIENTAIS DEPARTAMENTO DE BIOLOGIA DANIELLY DE CASTRO SCHUPCHEK FELIPE M. BUCO SAULO BALLS SHARONN M. HARTMANN AULA PRÁTICA N° 5 ESPECTROFOTOMETRIA Relatório apresentado como requisito para obtenção de nota parcial, na disciplina de Bioquímica do curso de Ciências Biológicas da Universidade Estadual do Centro-Oeste – UNICENTRO. Professora: Franciely Grose Colodi GUARAPUAVA
  • 3. 3 SUMÁRIO 1. INTRODUÇÃO........................................................................................................................03 2. OBJETIVOS.............................................................................................................................04 2.1 OBJETIVOS GERAIS...........................................................................................................04 2.2 OBJETIVOS ESPECIFICOS...............................................................................................04 3. MATERIAIS E MÉTODOS....................................................................................................04 3.1 REAGENTES.........................................................................................................................04 3.2 PROCEDIMENTOS..............................................................................................................04 4. RESULTADOS E DISCUSSÃO.............................................................................................06 4.1 CURVA DE ABSORÇÃO.................................................................................................... 06 4.2 CURVA DE REFERÊNCIA OU CURVA DE CALIBRAÇÃO....................................... 07 4.3 DETERMINAÇÃO DA CONCENTRAÇÃO DE PROTEÍNAS NA AMOSTRA PROBLEMA.................................................................................................................................07 5. CONCLUSÃO..........................................................................................................................09 6. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS...................................................................................10 7. APÊNDICE...............................................................................................................................11
  • 4. 4 1. INTRODUÇÃO O termo medida fotométrica foi definido originalmente como o ato de medir a intensidade da luz, independente do comprimento de onda (energia). Neste tipo de medida é utilizada a espectrofotometria que se baseia na absorção da radiação nos comprimentos de onda entre o ultravioleta e o infravermelho. O aparelho espectrofotômetro faz passar um feixe de luz monocromática através de uma solução, e mede a quantidade de luz que foi absorvida por essa solução. Um prisma contido no aparelho separa a luzem feixes com diferentes comprimentos de onda. Assim é possível passar um feixe de luz monocromática através da amostra. O equipamento permite saber que quantidade de luz é absorvida a cada comprimento de onda. O conjunto das absorbâncias aos vários comprimentos de onda para um composto chama-se espectro de absorção e varia de substância para substância. Como diferentes substâncias têm diferentes padrões de absorção, a espectrofotometria permite identificar e quantificar substâncias com base no seu espectro. A quantificação é realizada com a relação entre quantidade de luz absorvida e concentração da substância. A absorção da luz é tanto maior quanto mais concentrada for a solução por ela atravessada e quanto maior for a distância percorrida pelo feixe luminoso através da amostra. Esses princípios formam a Lei de Lambert – Beer Para determinação da concentração de um soluto em uma amostra por espectrofotometria, temos a comparação da absorbância da amostra com uma solução padrão, na qual já é conhecida a concentração do soluto. Em geral, é utilizada uma solução-padrão com diferentes concentrações (padrões de referência), que tem sua absorbância determinada. Esses padrões são preparados diluindo-se a solução-padrão na proporção necessária para a obtenção das concentrações desejadas. Com os valores de absorbância e de concentração conhecidos, pode-se traçar um gráfico cujo perfil é conhecido como “curva-padrão” ou “curva analítica”. Nesse gráfico, a reta indica a proporcionalidade entre o aumento da concentração e da absorbância e a porção linear correspondente ao limite de sensibilidade do método espectrofotométrico para o soluto em questão.
  • 5. 5 2 OBJETIVOS 2.1 OBJETIVO GERAL Abordar a espectrofotometria como método analítico na determinação da concentração. 2.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS • Determinar a curva de absorção do Reagente de Biureto em presença da proteína albumina; • Elaborar uma curva de calibração para dosagem de proteínas pelo método do Biureto; • Determinar a concentração de proteína em uma amostra-problema; • Exercitar a prática de diluição na determinação da concentração, • Montar a curva de referência com auxílio do programa EXCEL® no computador. 3 MATERIAIS E MÉTODOS 3.1 REAGENTES Foram utilizados como reagentes: solução padrão de proteína (albumina) 5 mg/mL, amostra problema de concentração desconhecida e reagente de Biureto. 3.2 PROCEDIMENTOS Utilizamos seis tubos de ensaio que foram numerados de 1 a 6 para realizar o experimento. Cada tubo foi preparado da seguinte forma: 1° Tubo: (branco) 1,0 ml de água destilada e 5,0 ml de reagente de biureto;
  • 6. 6 2° Tubo: 0,2 ml de solução padrão de proteína (5mg/mL), 0,8 ml de água destilada e 5,0 ml de reagente de biureto; 3° Tubo: 0,4 ml de solução padrão de proteína (5mg/mL), 0,8 ml de água destilada e 5,0 ml de reagente de biureto; 4° Tubo: 0,6 ml de solução padrão de proteína (5mg/mL), 0,4 ml de água destilada e 5,0 ml de reagente de biureto; 5° Tubo: 0,8 ml de solução padrão de proteína (5mg/mL), 0,2 ml de água destilada e 5,0 ml de reagente de biureto, 6° Tubo: 1,0 ml de solução padrão de proteína (5mg/mL) e 5,0 ml de reagente de biureto. Logo após todos os tubos estarem prontos, foram agitados e deixados de repouso por 10 minutos. Depois de passado o tempo de repouso, calculou-se a concentração final de cada um, usando a formula C1 . V1 = C2 . V2, e anotamos os resultados na tabela abaixo: TUBOS 1 2 3 4 5 6 5 . 0,2 = 5 . 0,4 = 5 . 0,6 = 5 . 0,8 = 5 . 1,0 = CALCULO - C2.1 C2 . 1 C2 . 1 C2 . 1 C2 . 1 CONCENTRAÇÃO BRANCO 1mg/ml 2mg/ml 3mg/ml 4mg/ml 5mg/ml Então, dando continuidade ao experimento, utilizou-se o espectrofotômetro para determinar a curva de absorção do Reagente de Biureto em presença da proteína albumina, utilizando os tubos 1 e 6 do experimento montado, para determinar: a) Curva de absorção de proteína com Reagente de Biureto; b) Curva de referência para determinar a concentração de uma amostra-problema, c) Concentração de proteínas na amostra-problema.
  • 7. 7 4. RESULTADOS E DISCUSSÃO 4.1 CURVA DE ABSORÇÃO Para determinar a curva de absorção, foi ligado o espectrofotômetro e colocado o conteúdo dos tubos 1 e 6 em duas cubetas diferentes que foram inseridas ambas no interior do equipamento. O tubo 1 (branco) foi usado para calibrar/zerar o equipamento nos diferentes comprimentos de onda (λ) a serem analisados antes da leitura de absorbância do tubo 6. Verificou-se a absorbância da solução do tubo 6 em diferentes λ no espectrofotômetro, anotando os valores de absorbância para cada comprimento de onda utilizado na tabela abaixo: ʎ (nm) Absorbância ʎ (nm) Absorbância 1 460 5 540 0.156 2 480 6 560 0.154 3 500 0.107 7 580 0.142 4 520 0.142 8 600 De acordo com os resultados da tabela acima, foi montado um gráfico correlacionando comprimento de onda com absorbância do tubo 6, e de acordo com o gráfico, o tubo 5 apresentou o ponto Maximo de absorbância:
  • 8. 8 4.2 CURVA DE REFERÊNCIA OU CURVA DE CALIBRAÇÃO Para calibrar/zerar o espectrofotômetro foi utilizado o tudo 1: 0 de absorbância no comprimento de onda que apresentou maior absorbância conforme a curva de absorção. Anotamos a absorbância das soluções dos tubos 2 a 6 na tabela abaixo: TUBOS 1 2 3 4 5 6 ABSORBÂNCIA Branco 0.030 0.059 0.092 0.120 0.156 4.3 DETERMINAÇÃO DA CONCENTRAÇÃO DE PROTEÍNAS NA AMOSTRA PROBLEMA Foram separados dois tubos de ensaio e identificados como tubo A (amostra-problema) e tubo B (amostra-problema diluída), e adicionaram-se os reagentes conforme tabela abaixo: Tubos Reagentes (ml) A B* Amostra problema 1,0 0,5 Água destilada - 0,5 Reagente de Biureto 5,0 5,0 Depois de preparados, os tubos foram deixados em repouso por 10 minutos. Utilizau-se o tubo 1 para calibrar o espectrofotômetro: 0 de absorbância no comprimento de onda que apresentou maior absorbância conforme a curva de absorção Tubos A B* Absorbância 0,080 0,047 (*Fator de diluição da amostra = ___2_______) Resultado do volume total dividido pela amostra que foi colocada. Fator de diluição é quantas vezes a amostra cabe no volume total após a diluição.
  • 9. 9 Conforme os valores obtidos na curva de calibração, a concentração de proteínas (mg/mL) presente nas amostras problema utilizando regra de três. Utilizamos como referencia qualquer um dos valores obtidos na curva de calibração: Amostra problema – absorbância: 0, 047 concentração: x Tubo 2 absorbância: 0,03 concentração 1mg/ml 0, 047 -------------------x 0,03x= 0,047 0,03---------------------1 x= 0,047 / 0,03 x=1,57mg/ml. Utilizando o programa EXCEL®, encontramos a equação da reta referente a curva de calibração conforme gráfico abaixo: Finalmente, para calcular a concentração de proteínas (mg/mL) presente nas amostras problema utilizando a equação da reta obtida com a curva de calibração, obteve-se os seguintes resultados: Y= a.x + b (excluímos b porque passa no 0) Tubo A: Abs = 0,03 . conc  0,08/0,03 = conc.  Conc. = 2,7 mg/ml concentração original. Tubo B: Abs = 0,03 . conc  0,047/0,03 = conc.  Conc. = 1,6 mg/ml amostra diluída.
  • 10. 10 5 CONCLUSÃO Com o experimento pudemos abordar a espectrofotometria para determinar as concentrações de algumas amostras e a concentração de proteína na amostra problema, conseguimos determinar a curva de absorção para o reagente de biureto em presença da proteína albumina. Também pudemos aplicar conhecimentos do programa EXCEL®, elaborando a curva de calibração para dosagem de proteína e montamos a curva de referencia agregando novos conhecimentos ao experimento. Então concluímos que os objetivos do experimento foram alcançados com êxito.
  • 11. 11 6. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS Universidade federal do rio grande do sul. Espectrofotometria. Disponível em: < http://www.ufrgs.br/leo/site_espec/espectrodeantipiril.html>. Acesso em 28 de agosto de 2012. NELSON, D.L.; COX, M.M. Lehninger: Principles of Biochemstry. 3ed. New York: Worth Publishers, 2000. 1152p.
  • 12. 12 7. APÊNDICE 1. Qual a finalidade e o fundamento da técnica espectrofotométrica? A espectrofotometria é o método de análises óptico mais usado nas investigações biológicas e fisico-químicas. O espectrofotômetro é um instrumento que permite comparar a radiação absorvida ou transmitida por uma solução que contém uma quantidade desconhecida de soluto, e uma quantidade conhecida da mesma substância. Todas as substâncias podem absorver energia radiante, mesmo o vidro que parece completamente transparente absorve comprimentos de ondas que pertencem ao espectro visível. A água absorve fortemente na região do infravermelho. A absorção das radiações ultravioletas, visíveis e infravermelhas dependem das estruturas das moléculas, e é característica para cada substância química. Quando a luz atravessa uma substância, parte da energia é absorvida (absorbância): a energia radiante não pode produzir nenhum efeito sem ser absorvida. A cor das substâncias se deve a absorção (transmitância) de certos comprimentos de ondas da luz branca que incide sobre elas, deixando transmitir aos nossos olhos apenas aqueles comprimentos de ondas não absorvidos. 2. O que significa a linearidade dos métodos colorimétricos e como ela é determinada? Linearidade – corresponde à capacidade do método de fornecer resultados diretamente proporcionais à concentração da substância em exame (analito). 3. Que critério deve ser usado para selecionar determinado comprimento de onda para uma técnica colorimétrica? Deve-se levar em conta a relação entre quantidade de luz absorvida e concentração da substância. A absorção da luz é tanto maior quanto mais concentrada for a solução por ela atravessada e quanto maior for a distância percorrida pelo feixe luminoso através da amostra.
  • 13. 13 4. Qual o conteúdo e a finalidade do tubo “branco”? O tubo 1 (branco) foi usado para calibrar/zerar o equipamento nos diferentes comprimentos de onda (λ) a serem analisados antes da leitura de absorbância dos outros tubos. O tubo branco foi preparado com 1,0 ml de água destilada e 5,0 ml de reagente de biureto. 5. De acordo com as Leis de Lambert-Beer, se um determinado composto apresenta um máximo de absorção em 545nm e para uma concentração de 3mg/mL foi obtida uma absorbância de 0,22, calcule a concentração deste composto correspondente a uma absorbância de 0,15, sabendo-se que a linearidade do método utilizado é de 0,5 a 5mg/mL. 0,22-------------------------3 0,22x=0,45 x=0,45/0,22 x= 2,41 0,15-------------------------x