1. O documento é um relatório sobre uma aula prática de espectrofotometria realizada por alunos da Universidade Estadual do Centro-Oeste. 2. O relatório apresenta os objetivos, materiais e métodos, resultados e discussão da aula prática que incluiu a determinação da curva de absorção, curva de calibração e concentração de proteínas em uma amostra problema utilizando espectrofotometria. 3. Os alunos conseguiram alcançar os objetivos propostos para a aula prática ao

1. UNIVERSIDADE ESTADUAL DO CENTRO-OESTE
SETOR DE CIÊNCIAS AGRÁRIAS E AMBIENTAIS
DEPARTAMENTO DE BIOLOGIA
DANIELLY DE CASTRO SCHUPCHEK
FELIPE M. BUCO
SAULO BALLS
SHARONN M. HARTMANN
AULA PRÁTICA N° 5
ESPECTROFOTOMETRIA
Relatório apresentado como requisito para
obtenção de nota parcial, na disciplina de
Bioquímica do curso de Ciências Biológicas da
Universidade Estadual do Centro-Oeste –
UNICENTRO.
Professora: Franciely Grose Colodi
GUARAPUAVA

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2012

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SUMÁRIO
1. INTRODUÇÃO........................................................................................................................03
2. OBJETIVOS.............................................................................................................................04
2.1 OBJETIVOS GERAIS...........................................................................................................04
2.2 OBJETIVOS ESPECIFICOS...............................................................................................04
3. MATERIAIS E MÉTODOS....................................................................................................04
3.1 REAGENTES.........................................................................................................................04
3.2 PROCEDIMENTOS..............................................................................................................04
4. RESULTADOS E DISCUSSÃO.............................................................................................06
4.1 CURVA DE ABSORÇÃO.................................................................................................... 06
4.2 CURVA DE REFERÊNCIA OU CURVA DE CALIBRAÇÃO....................................... 07
4.3 DETERMINAÇÃO DA CONCENTRAÇÃO DE PROTEÍNAS NA AMOSTRA
PROBLEMA.................................................................................................................................07
5. CONCLUSÃO..........................................................................................................................09
6. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS...................................................................................10
7. APÊNDICE...............................................................................................................................11

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1. INTRODUÇÃO
O termo medida fotométrica foi definido originalmente como o ato de medir a
intensidade da luz, independente do comprimento de onda (energia). Neste tipo de medida é
utilizada a espectrofotometria que se baseia na absorção da radiação nos comprimentos de onda
entre o ultravioleta e o infravermelho. O aparelho espectrofotômetro faz passar um feixe de luz
monocromática através de uma solução, e mede a quantidade de luz que foi absorvida por essa
solução. Um prisma contido no aparelho separa a luzem feixes com diferentes comprimentos de
onda. Assim é possível passar um feixe de luz monocromática através da amostra. O
equipamento permite saber que quantidade de luz é absorvida a cada comprimento de onda.
O conjunto das absorbâncias aos vários comprimentos de onda para um composto
chama-se espectro de absorção e varia de substância para substância. Como diferentes
substâncias têm diferentes padrões de absorção, a espectrofotometria permite identificar e
quantificar substâncias com base no seu espectro. A quantificação é realizada com a relação entre
quantidade de luz absorvida e concentração da substância. A absorção da luz é tanto maior
quanto mais concentrada for a solução por ela atravessada e quanto maior for a distância
percorrida pelo feixe luminoso através da amostra. Esses princípios formam a Lei de Lambert –
Beer
Para determinação da concentração de um soluto em uma amostra por
espectrofotometria, temos a comparação da absorbância da amostra com uma solução padrão, na
qual já é conhecida a concentração do soluto. Em geral, é utilizada uma solução-padrão com
diferentes concentrações (padrões de referência), que tem sua absorbância determinada. Esses
padrões são preparados diluindo-se a solução-padrão na proporção necessária para a obtenção das
concentrações desejadas.
Com os valores de absorbância e de concentração conhecidos, pode-se traçar um gráfico
cujo perfil é conhecido como “curva-padrão” ou “curva analítica”. Nesse gráfico, a reta indica a
proporcionalidade entre o aumento da concentração e da absorbância e a porção linear
correspondente ao limite de sensibilidade do método espectrofotométrico para o soluto em
questão.

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2 OBJETIVOS
2.1 OBJETIVO GERAL
Abordar a espectrofotometria como método analítico na determinação da concentração.
2.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS
• Determinar a curva de absorção do Reagente de Biureto em presença da proteína
albumina;
• Elaborar uma curva de calibração para dosagem de proteínas pelo método do
Biureto;
• Determinar a concentração de proteína em uma amostra-problema;
• Exercitar a prática de diluição na determinação da concentração,
• Montar a curva de referência com auxílio do programa EXCEL® no computador.
3 MATERIAIS E MÉTODOS
3.1 REAGENTES
Foram utilizados como reagentes: solução padrão de proteína (albumina) 5 mg/mL,
amostra problema de concentração desconhecida e reagente de Biureto.
3.2 PROCEDIMENTOS
Utilizamos seis tubos de ensaio que foram numerados de 1 a 6 para realizar o
experimento.
Cada tubo foi preparado da seguinte forma:
1° Tubo: (branco) 1,0 ml de água destilada e 5,0 ml de reagente de biureto;

6. 6
2° Tubo: 0,2 ml de solução padrão de proteína (5mg/mL), 0,8 ml de água destilada e 5,0
ml de reagente de biureto;
3° Tubo: 0,4 ml de solução padrão de proteína (5mg/mL), 0,8 ml de água destilada e 5,0
ml de reagente de biureto;
4° Tubo: 0,6 ml de solução padrão de proteína (5mg/mL), 0,4 ml de água destilada e 5,0
ml de reagente de biureto;
5° Tubo: 0,8 ml de solução padrão de proteína (5mg/mL), 0,2 ml de água destilada e 5,0
ml de reagente de biureto,
6° Tubo: 1,0 ml de solução padrão de proteína (5mg/mL) e 5,0 ml de reagente de
biureto.
Logo após todos os tubos estarem prontos, foram agitados e deixados de repouso por 10
minutos.
Depois de passado o tempo de repouso, calculou-se a concentração final de cada um,
usando a formula C1 . V1 = C2 . V2, e anotamos os resultados na tabela abaixo:
TUBOS 1 2 3 4 5 6
5 . 0,2 = 5 . 0,4 = 5 . 0,6 = 5 . 0,8 = 5 . 1,0 =
CALCULO -
C2.1 C2 . 1 C2 . 1 C2 . 1 C2 . 1
CONCENTRAÇÃO BRANCO 1mg/ml 2mg/ml 3mg/ml 4mg/ml 5mg/ml
Então, dando continuidade ao experimento, utilizou-se o espectrofotômetro para
determinar a curva de absorção do Reagente de Biureto em presença da proteína albumina,
utilizando os tubos 1 e 6 do experimento montado, para determinar:
a) Curva de absorção de proteína com Reagente de Biureto;
b) Curva de referência para determinar a concentração de uma amostra-problema,
c) Concentração de proteínas na amostra-problema.

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4. RESULTADOS E DISCUSSÃO
4.1 CURVA DE ABSORÇÃO
Para determinar a curva de absorção, foi ligado o espectrofotômetro e colocado o
conteúdo dos tubos 1 e 6 em duas cubetas diferentes que foram inseridas ambas no interior do
equipamento.
O tubo 1 (branco) foi usado para calibrar/zerar o equipamento nos diferentes
comprimentos de onda (λ) a serem analisados antes da leitura de absorbância do tubo 6.
Verificou-se a absorbância da solução do tubo 6 em diferentes λ no espectrofotômetro,
anotando os valores de absorbância para cada comprimento de onda utilizado na tabela abaixo:
ʎ (nm) Absorbância ʎ (nm) Absorbância
1 460 5 540 0.156
2 480 6 560 0.154
3 500 0.107 7 580 0.142
4 520 0.142 8 600
De acordo com os resultados da tabela acima, foi montado um gráfico correlacionando
comprimento de onda com absorbância do tubo 6, e de acordo com o gráfico, o tubo 5
apresentou o ponto Maximo de absorbância:

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4.2 CURVA DE REFERÊNCIA OU CURVA DE CALIBRAÇÃO
Para calibrar/zerar o espectrofotômetro foi utilizado o tudo 1: 0 de absorbância no
comprimento de onda que apresentou maior absorbância conforme a curva de absorção.
Anotamos a absorbância das soluções dos tubos 2 a 6 na tabela abaixo:
TUBOS 1 2 3 4 5 6
ABSORBÂNCIA Branco 0.030 0.059 0.092 0.120 0.156
4.3 DETERMINAÇÃO DA CONCENTRAÇÃO DE PROTEÍNAS NA AMOSTRA
PROBLEMA
Foram separados dois tubos de ensaio e identificados como tubo A (amostra-problema) e
tubo B (amostra-problema diluída), e adicionaram-se os reagentes conforme tabela abaixo:
Tubos
Reagentes (ml)
A B*
Amostra problema 1,0 0,5
Água destilada - 0,5
Reagente de Biureto 5,0 5,0
Depois de preparados, os tubos foram deixados em repouso por 10 minutos.
Utilizau-se o tubo 1 para calibrar o espectrofotômetro: 0 de absorbância no comprimento
de onda que apresentou maior absorbância conforme a curva de absorção
Tubos A B*
Absorbância 0,080 0,047
(*Fator de diluição da amostra = ___2_______)
Resultado do volume total dividido pela amostra que foi colocada. Fator de diluição é
quantas vezes a amostra cabe no volume total após a diluição.

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Conforme os valores obtidos na curva de calibração, a concentração de proteínas
(mg/mL) presente nas amostras problema utilizando regra de três. Utilizamos como referencia
qualquer um dos valores obtidos na curva de calibração:
Amostra problema – absorbância: 0, 047 concentração: x
Tubo 2 absorbância: 0,03 concentração 1mg/ml
0, 047 -------------------x 0,03x= 0,047
0,03---------------------1 x= 0,047 / 0,03 x=1,57mg/ml.
Utilizando o programa EXCEL®, encontramos a equação da reta referente a curva de
calibração conforme gráfico abaixo:
Finalmente, para calcular a concentração de proteínas (mg/mL) presente nas amostras
problema utilizando a equação da reta obtida com a curva de calibração, obteve-se os seguintes
resultados:
Y= a.x + b (excluímos b porque passa no 0)
Tubo A: Abs = 0,03 . conc  0,08/0,03 = conc.  Conc. = 2,7 mg/ml
concentração original.
Tubo B: Abs = 0,03 . conc  0,047/0,03 = conc.  Conc. = 1,6 mg/ml amostra
diluída.

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5 CONCLUSÃO
Com o experimento pudemos abordar a espectrofotometria para determinar as
concentrações de algumas amostras e a concentração de proteína na amostra problema,
conseguimos determinar a curva de absorção para o reagente de biureto em presença da proteína
albumina. Também pudemos aplicar conhecimentos do programa EXCEL®, elaborando a curva
de calibração para dosagem de proteína e montamos a curva de referencia agregando novos
conhecimentos ao experimento.
Então concluímos que os objetivos do experimento foram alcançados com êxito.

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6. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
Universidade federal do rio grande do sul. Espectrofotometria. Disponível em: <
http://www.ufrgs.br/leo/site_espec/espectrodeantipiril.html>. Acesso em 28 de agosto de 2012.
NELSON, D.L.; COX, M.M. Lehninger: Principles of Biochemstry. 3ed. New York: Worth
Publishers, 2000. 1152p.

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7. APÊNDICE
1. Qual a finalidade e o fundamento da técnica espectrofotométrica?
A espectrofotometria é o método de análises óptico mais usado nas investigações
biológicas e fisico-químicas. O espectrofotômetro é um instrumento que permite comparar a
radiação absorvida ou transmitida por uma solução que contém uma quantidade desconhecida de
soluto, e uma quantidade conhecida da mesma substância.
Todas as substâncias podem absorver energia radiante, mesmo o vidro que parece
completamente transparente absorve comprimentos de ondas que pertencem ao espectro visível.
A água absorve fortemente na região do infravermelho.
A absorção das radiações ultravioletas, visíveis e infravermelhas dependem das
estruturas das moléculas, e é característica para cada substância química.
Quando a luz atravessa uma substância, parte da energia é absorvida (absorbância): a
energia radiante não pode produzir nenhum efeito sem ser absorvida.
A cor das substâncias se deve a absorção (transmitância) de certos comprimentos de
ondas da luz branca que incide sobre elas, deixando transmitir aos nossos olhos apenas aqueles
comprimentos de ondas não absorvidos.
2. O que significa a linearidade dos métodos colorimétricos e como ela é
determinada?
Linearidade – corresponde à capacidade do método de fornecer resultados diretamente
proporcionais à concentração da substância em exame (analito).
3. Que critério deve ser usado para selecionar determinado comprimento de onda
para uma técnica colorimétrica?
Deve-se levar em conta a relação entre quantidade de luz absorvida e concentração da
substância. A absorção da luz é tanto maior quanto mais concentrada for a solução por ela
atravessada e quanto maior for a distância percorrida pelo feixe luminoso através da amostra.

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4. Qual o conteúdo e a finalidade do tubo “branco”?
O tubo 1 (branco) foi usado para calibrar/zerar o equipamento nos diferentes
comprimentos de onda (λ) a serem analisados antes da leitura de absorbância dos outros tubos. O
tubo branco foi preparado com 1,0 ml de água destilada e 5,0 ml de reagente de biureto.
5. De acordo com as Leis de Lambert-Beer, se um determinado composto apresenta
um máximo de absorção em 545nm e para uma concentração de 3mg/mL foi obtida uma
absorbância de 0,22, calcule a concentração deste composto correspondente a uma absorbância
de 0,15, sabendo-se que a linearidade do método utilizado é de 0,5 a 5mg/mL.
0,22-------------------------3 0,22x=0,45 x=0,45/0,22 x= 2,41
0,15-------------------------x