O documento descreve os princípios e componentes da cromatografia líquida de alta eficiência (HPLC). Explica que a HPLC envolve a separação de componentes de uma amostra líquida através da interação diferencial desses componentes com fases móvel e estacionária. Detalha os principais componentes de um cromatógrafo HPLC, incluindo a bomba, injetor, coluna e detectores, e discute os tipos comuns de fases estacionárias e modos de separação.

1. Cromatografia Liquida – CLAECromatografia Liquida – CLAE
professora ; adrianne mendonçaprofessora ; adrianne mendonça

2. O que é Cromatografia ?O que é Cromatografia ?
Definição:
A cromatografia é uma técnica de separação
na qual os componentes a serem separados
de uma mistura migram entre duas fases
sendo uma fase móvel e a outra estacionária.
A natureza química e física dos componentes
da mistura definem o grau de afinidade entre
as duas fases, acontecendo o fenômeno de
migração diferencial .

3. O que é Cromatografia a LíquidoO que é Cromatografia a Líquido
HPLC?HPLC?
Definição:
Na técnica de cromatografia a líquido a
fase móvel é um líquido e a fase
estacionária é um sólido .
O processo cromatográfico acontece na
fase líquida , sendo que os componentes da
amostras devem estar dissolvidos.

4. Instrumentação para HPLCInstrumentação para HPLC

5. CLAE -HPLCCLAE -HPLC
Fase móvel
(amostra)
Fase estacionária
(Componentes retidos)
Migrações diferenciais
Analitomov ⇋ Analitoest
K = Analitoest / Analitomov= coeficiente de
partição

7. INSTRUMENTAÇÃO
pump
injector
column
oven
detector
One pump used to
control 4 reservoirs;
mixing is done
before pump.
MIXER
data
processor
Fase móvel

8. Instrumentação para HPLCInstrumentação para HPLC
PURGAINJETOR
COLUNA
FM
BOMBA
DETECTOR

9. Componentes de umComponentes de um
Cromatógrafo a Líquido HPLCCromatógrafo a Líquido HPLC
Um cromatógrafo a líquido é composto de 3 partes
principais :
 Injetor :
É o dispositivo que tem a função de introduzir a
amostra na fase móvel ;
 Coluna cromatografia :
É o dispositivo que tem a função de separar os
componentes da amostra ;
 Detector :
É o dispositivo que tem a função de detectar os
componentes eluídos da coluna cromatográficas

10. Componentes auxiliares deComponentes auxiliares de
um HPLCum HPLC
Bomba :
É o dispositivo que bombeia e controla o
fluxo e a pressão da fase móvel ( solvente );
É composta de um ou mais pistão acoplados a
um sistema de válvulas.
Fornece uma alta pressão.

11. BOMBA
- Fluxo deve ser constante (0,01-10 mL/min)
- Opções: Simples, gradiente binário, quaternário
- Mede a pressão sobre o sistema
- Manutenção preventiva (selos, pistões, check valves, etc.)

13. Componentes auxiliares de umComponentes auxiliares de um
HPLCHPLC
Válvula de purga:
É o dispositivo que permite a troca rápida de
solvente desviando o fluxo de solvente para o
dreno.
Misturador:
É o dispositivo que homogeneíza a mistura de
solventes quando operando com gradiente de
eluição .

14. Fase estacionáriaFase estacionária

15. Colunas CromatográficasColunas Cromatográficas
Fases estacionárias :
 Sílica- C8
 Sílica- C18
 Sílica- C18 ( ODS)
 Sílica- NH2
 Sílica- Diol
 Sílica
 Troca Iônica
 Resinas DVB-ST Sulfonadas Ca
 Resinas DVB-ST porosas
Pré-Coluna:
 É o uma pequena coluna instalada a montante
da coluna analítica .
 Tem como objetivo reter sólidos e em muitos
casos reter materiais que por reações químicas
podem precipitar sobre a fase estacionária.

16. SÍLICA (suporte + usado):
- Resistência mecânica
- Variedade de forma, tamanho de partículas e
poros
- Instabilidade frente a fases móveis ácidas ou
básicas
- Superfície não homogênea
COLUNAS CROMATOGRÁFICAS

17. Si
OH
Si
HO OH
Si
OH
Si
OH
SÍLICA – GRUPOS SILANÓIS
LIVRES GEMINAL VICINAIS
influenciam no grau de acidez da sílica

18. Fase EstacionáriaFase Estacionária
A fase estacionária mais utilizada
é composta de partículas
microporosas de sílica.
São permeáveis ao solvente e
possuem uma área superficial de
varias centenas de metros por
gramas.
Não deve ser utilizada em
sistemas com pH acima de 8,0.

19. MODIFICAÇÃO SUPERFICIAL
- QUIMICAMENTE LIGADAS
- HÍBRIDAS
- RECOBERTAS COM POLÍMEROS ORGÂNICOS

20. Fases Quimicamente Ligadas
C18 (ODS)
forte
C8
amostra
amostra
amostra
C4
média
fraca

21. POLIMÉRICAS
Pré-hidrólise do agente silanizante
- Rede tridimensional mais espessa
- Maior estabilidade
- Dificuldade de controlar reações entrecruzamento

22. FASES ESTACIONÁRIAS HÍBRIDAS
Matriz orgânica-inorgânica
- Mais estáveis do que as quim. ligadas convencionais
- Menor quantidade de grupos de silanóis
- Ultra-fast cromatografia
Tetraalcoxissilano alquiltrialcoxissilano
(RO)4Si + n(RO)3SiR’ + (1,5n+2)H2O → SiO2 (R’SiO1,5)0,5 + (3n+4)ROH

23. RECOBRIMENTO COM POLÍMEROS
-RESISTÊNCIA MECÂNICA DA MATRIZ
INORGÂNICA
- SELETIVIDADE E INÉRCIA QUÍMICA DOS
POLÍMEROS ORGÂNICOS

24. - Maior recobrimento dos sítios ativos do suporte
- Maior seletividade (natureza e quantidade dos grupos
funcionais nas cadeias dos polímeros, espessura dos
filmes, área superficial e estrutura de poros do suporte)
• Poli(etileno)
• Poli(butadieno)
• Poli(estireno)
• Poli(dimetilsiloxano)
• Poli(metiloctilsiloxano)
• Poli(metiloctadecilsiloxano)
• Poliéteres
• Polissacarídeos
• Poliaminas
• Polinucleotídeos
• Poliamidas
• Proteínas
Sílica
Zircônia
Titânia
Alumina

25. PRINCÍPIOS DE SEPARAÇÃO
INTERAÇÃO DO SOLUTO NAS 2 FASES (EQUILÍBRIO)
INTERAÇÕES DE VAN DER VALLS
LIGAÇÕES DE HIDROGÊNIO
INTERAÇÕES DIPOLO-DIPOLO
ATRAÇÃO ELETROSTÁTICA

26. Fases estacionárias Interações
C8
PH
C2
van der Waals
van der Waals
van der Waals
Si
Si
Si

27. Fases estacionárias Interações
CN
NH2
2OH
Dipolo/Dipolo
O
H
Si N
H
H
OSi
O
H
OO
H
H
Si
N
O
H
C
Ligação de
hidrogênio
Ligação de
hidrogênio
Fase Estacionária

28. PRS
CBA
SAX
Eletrostática
Eletrostática
Eletrostática
H3
+N
SO3
-Si
Si
H3
+N
O-
O
N+(CH3)3Si
-O3S
Fases estacionárias Interações
Fase Estacionária

29. Processo de EluiçãoProcesso de Eluição
Definição:
Pode ser descrita como deslocamento do soluto na
fase estacionária.
Série eluotrópica
 Ordena os solventes de acordo com suas habilidades
relativas de deslocar soluto de um dado adsorvente.

30. Força eluente:
 É uma medida da energia de adsorção do solvente
Cromatografia com fase normal:
 Utiliza uma fase estacionária polar e um solvente
menos polar.
Cromatografia com fase reversa:
 Utiliza uma fase estacionária apolar ou fracamente
polar e um solvente polar.

31. DETECTORES - Classificação
UNIVERSAIS:
Geram sinal para qualquer
substância eluída.
SELETIVOS:
Detectam apenas substâncias
com determinada propriedade
físico-química.
Dispositivos que geram um sinal elétrico proporcional à quantidade
eluída de um analito

32. DETECTORES
UV
FLUORESCÊNCIA
MS
ELETROQUÍMICO
IR
POLARÍMETRO

33. É mais comum, usado na
CLAE.
 Porque muitos solutos
absorvem a luz ultravioleta.
 São bons para a eluição
por gradiente com
solventes não-absorventes.
DetectoresDetectores Ultra violeta:Ultra violeta:

34. Princípio: Absorção de luz ultravioleta ou visível pela
amostra, quando nela passa radiação eletromagnética.
- Seletivo (moléculas com cromóforos)
- Comprimento de onda (λ) fixo
- λ pode ser selecionado (190 – 600 nm)
- Varredura (DAD)
- Solventes também absorvem
Ultra violeta (UV-visível):
Água
MeOH
ACN
Acetona
Hexano
Clorofórmio
THF
190
210
200
330
200
245
215
λ nmSolvente

35. Princípio: Emissão de energia fluorescente de um
soluto que foi excitado por radiação UV
- Seletivo (moléculas que fluorescem)
- Exemplo: Aromáticos policíclicos e duplas ligações conjugadas
- Mais sensível que UV por ser emissão
- Podem ser feitas reações de derivação pré ou pós-coluna para
que o analito se torne fluorescente.
- Reagentes de derivatização comuns: fluorescamina e cloreto de
dansila
Fluorescência:

37. Detectores por Índice de RefraçãoDetectores por Índice de Refração::

38. Princípio: Mede a diferença no índice de refração da
fase móvel e do eluente vindo da coluna
- Não- seletivo
- Sensível a variações de:
- Temperatura
- Pressão
- Fluxo
- Composição fase móvel
- Baixa sensibilidade e difícil de estabilizar
- Muito usado em cromatografia preparativa
Indice de refração:

39. Princípio: Determinação da massa de solutos através da
ionização e determinação da relação massa-carga (m/z)
- Destrutivo
- Pode ser extremamente seletivo (SIM e massas tandem MS/MS)
- Interfaces de ionização mais comuns: ESI, ApCI
- Análise de micro e macromoléculas.
- Alta sensibilidade
Espectrometria de massas:

41. MODOS DE SEPARAÇÃOMODOS DE SEPARAÇÃO
NORMAL
REVERSO
TROCA IÔNICA

42. MODO NORMAL
MECANISMO DE INTERAÇÃO:
ADSORÇÃO
Fase estacionária: + POLAR que a fase móvel
Fase móvel: mistura de solventes orgânicos
Colunas: Sílica, Ciano, fenil, amino

43. MODO REVERSO
INTERAÇÃO DA PARTE NÃO POLAR DO
SOLUTO E A FASE ESTACIONÁRIA
HIDROFOBICIDADE
Fase estacionária: APOLAR
Fase móvel: H2O, MeOH, CH3CN
ÁREA DE C SOLUTO RETENÇÃO

44. Tempo de Retenção e
Hidrofobicidade
OH
OH
C18 (ODS)
forte
Interação
fraca

45. HidrofobicidadeHidrofobicidade
 Se a amostra possui
 CH3CH2CH2--- : cadeia carbônica
 : grupo aromático
 Se a amostra possui
 -COOH : grupo carboxílico
 -NH2 : grupo amino
 -OH : grupo hidróxi
A
hidrofobicidade
será forte
A
hidrofobicidade
será fraca

46. TROCA IÔNICA
MECANISMO DE INTERAÇÃO :
ATRAÇÃO ELETROSTÁTICA
Fase estacionária: Resinas trocadoras de íons (catiônicas / aniônicas)
Fase móvel: Tampão (pH, , força iônica, temperatura)
Aniônicas: amônio quaternário, aminas
Catiônicas: ácido sulfônico, ácido carboxílico

47. Microsseringas para Injeção
LÍQUIDOS Capacidades típicas: 1 µL, 5 µL e 10 µL
êmbolo
corpo (pirex)
agulha (inox 316)
Obs: Seringa de HPLC

48. SeqüênciaSeqüência
Lavagem da coluna -MeOH por
30 minutos
Condicionamento da coluna com
fase móvel
Monitoramento da linha de base
Injeção das amostras

49. PARÂMETROS CROMATOGRÁFICOS
FATOR DE RETENÇÃO (k)
FATOR DE SEPARAÇÃO (α)
NÚMERO DE PRATOS (N)

50. Cromatograma
tR
tM
TEMPO
SINAL
tR = Tempo de Retenção (tempo decorrido entre a injeção e o ápice do pico cromatográfico)
tM (tempo morto) = Tempo de Retenção do Composto Não-Retido (tempo mínimo para um
composto que não interaja com a FE atravesse a coluna)

51. A migração de um analito pela
coluna provoca inevitavelmente
o alargamento da sua banda:
TEMPO
Efeitos do alargamento excessivo de picos:
EFICIÊNCIA Capacidade de eluição com o mínimo de dispersão do analito.

52. w
2 na linha de base
BANDA CROMATOGRÁFICA

53. Representa a capacidade de distribuição do soluto nas fases
Não leva em conta o tempo morto da coluna
FATOR DE RETENÇÃO (k)
tr – to
k =
to
tr = tempo retenção analito
to = tempo morto da coluna

54. t
r o
o
k =
t t
Se:
t0 = 1,5 min
t1 = 3,5 min
t2 = 4,2 min
k1 = 1,3
k2 = 1,8

55. FATOR DE SEPARAÇÃO (α)
α
k2
=
k1
AVALIA A SELETIVIDADE

56. Se:
k1 = 1,3
k2 = 1,8
α = 1,38
k1 = 1,3
k2 = 1,8
α
k2
=
k1
α = 1 não houve separação

57. NÚMERO DE PRATOS (N)
Mede a eficiência do sistema
Depende da coluna, da amostra e do fluxo da fase móvel
tr
N= 5,54
w0,5
2

58. ResoluçãoResolução
é função da
Seletividade (α)
Eficiência da coluna (N)
Fator de retenção (k)

59. ResoluçãoResolução
Rs = 0.8 Rs = 1.25Rs = 1.05

61. FASE MÓVEL
- Solvente grau HPLC (alta pureza)
- Filtração (membrana 0.45 μm)
- Degaseificação do solvente (ultrassom, borbulhamento
de He ou automático)
- Purgar os solventes

62. MODOS DE ELUIÇÃOMODOS DE ELUIÇÃO
ISOCRÁTICO:
Uma única composição de fase móvel ao longo da
corrida; a composição ds FM é CONSTANTE.
GRADIENTE:
- Variação da composição da fase móvel (FM) ao longo
da corrida.
- Amostras com ampla faixa de k (0,5 < k < 20)

63. Mudança no modificador orgânicoMudança no modificador orgânico
a
b
c
d
a
b
c
d
[ MeOH/H2O ]
par crítico : c,d
[ THF/H2O ]
par crítico : a,b
a
b
c
d
[ MeOH/THF/H2O ]

64. 1) COLETA/OBTENÇÃO (QUANTIDADE, LUGAR, ETC..)
2) ESTOCAGEM E PREPARAÇÃO (ESTABILIDADE)
3) EXTRAÇÃO:
- LÍQUIDO-LÍQUIDO
- LÍQUIDO-SÓLIDO
- SOXHLET
- FLUÍDO SUPER CRÍTICO
- EXTRAÇÃO EM FASE SÓLIDA (EFS / SPE)
PREPARAÇÃO DA AMOSTRA

65. FiltraçãoFiltração
É necessária, previamente à injeção,
usualmente com membranas de 0.45 µm
mesh para a remoção do material insolúvel.

66. DESENVOLVIMENTO DE MÉTODO
Fixas as condições operacionais, o tempo de retenção ajustado
de um analito é uma constante
AMOSTRA
PADRÃO
Comparação de
cromatogramas da
amostra e de uma
solução padrão do
analito suspeito

67. ANÁLISE QUANTITATIVAANÁLISE QUANTITATIVA
A área do pico é proporcional a massa que
passa pelo detector
Cálculo de área:

68. ANÁLISE QUANTITATIVAANÁLISE QUANTITATIVA
Se ambos os compostos
respondessem igualmente ao
detector poderíamos usar a relação:
Massa A Área A
Massa B Área B
No entanto, a mesma massa de compostos diferentes nos dá
áreas diferentes, em função da resposta ao detector.

69. PADRONIZAÇÃO EXTERNAPADRONIZAÇÃO EXTERNA
Este método baseia-se na comparação de uma certa
substância presente na amostra com seu respectivo padrão.
Primeiramente deve-se construir um gráfico de (área x
concentração) da substância padrão:

70. PADRONIZAÇÃO EXTERNAPADRONIZAÇÃO EXTERNA
Em seguida, injeta-se a amostra, e a partir da área obtida no
cromatograma tira-se do gráfico traçado a concentração
dessa substância na amostra.
É importante salientar que o gráfico deve ser construído com
concentrações próximas da concentração esperada na
amostra. Outro fator muito importante é que o volume
injetado do padrão tem de ser exatamente igual ao volume
injetado de amostra. Por esta razão este tipo de
padronização é mais conveniente quando se utiliza válvulas
para injeção da amostra, que reproduzem fielmente o volume
injetado.
Neste método não são usados fatores de correção para
corrigir as áreas, por haver comparação da mesma substância

71. PADRONIZAÇÃO INTERNAPADRONIZAÇÃO INTERNA
Uma quantidade de amostra é pesada juntamente
com um padrão de massa conhecida. Esta
mistura é injetada e, a partir dos dados obtidos
no cromatograma, compara-se a área corrigida
de cada componente que se deseja determinar
com a área corrigida do padrão adicionado, do
qual se conhece a concentração.
Mx = massa do componente x
Ma = massa da amostra
Mp = massa do padrão
Ap = área do padrão
Ax = área corrigida do componente x

72. PADRONIZAÇÃO INTERNAPADRONIZAÇÃO INTERNA
A escolha do padrão deve ser feita, sempre que
possível, entre compostos semelhantes aos que
existem na amostra, não devendo coincidir com
nenhum composto da mesma, e estar próximo ou
entre os picos da amostra. Deve ser também uma
substância pura para que apresente apenas um pico
no cromatograma, e para que esse pico possa ser
relacionado à massa pesada
Este método possibilita a determinação de
apenas um dos componentes de uma mistura, sem
haver necessidade de conhecer os outros
componentes.

73. APLICAÇÕESAPLICAÇÕES

74. APLICAÇÕES cont…APLICAÇÕES cont…

75. APLICAÇÕES cont…APLICAÇÕES cont…

76. ReferênciasReferências
 TRINDADE, Magno Aparecido Gonçalves; RINALDO, Daniel;
VILEGAS, Wagner and ZANONI, Maria Valnice Boldrin.
Determinação de corantes marcadores do tipo azo e
antraquinona em combustíveis por cromatografia líquida
com detecção eletroquímica. Quím. Nova [online]. 2010,
vol.33, n.1, pp. 146-150. ISSN 0100-4042.

AFLATOXINAS EM ALIMENTOS DESTINADOS A
BOVINOS E EM AMOSTRAS DE LEITE DA REGIÃO DE
LAVRAS, MINAS GERAIS – BRASIL - Maria Marlucia
Gomes Pereira1, Eliana Pinheiro de Carvalho2, Guilherme
Prado3, Carlos Alberto da Rocha Rosa4, Thaís Veloso5,
Leandro Augusto Ferreira de Souza5,Jéssika Mara Martins
Ribeiro6