Precipitacao

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Aula sobre Precipitacao da disciplina Imunologia I

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Precipitacao

  1. 1. UNIVERSIDADE FEDERAL DA BAHIA INSTITUTO DE CIÊNCIAS DA SAÚDE – ICSDEPARTAMENTO DE BIOINTERAÇÃODISCIPLINA: IMUNOLOGIA I – ICS 045<br />REAÇÕES DE PRECIPITAÇÃO<br />TEIXEIRA, A.C.O.; Ferreira, M.A.S.V. e Marques, A.S.A.. Detecção de Erwinia psidii via enriquecimento em extrato de folhas de goiabeira e imunodifusão radial dupla. Tropical Plant Patology, vol. 33, nº 3. Brasilia, Junho de 2008.<br />Trabalho realizado pelo Mestrando em Ciências Animais nos Trópicos Dan Loureiro Nascimento sob orientação do Prof. Dr. Ricardo Wagner Dias Portela do Laboratório de Imunologia e Biologia Molecular (LABIMUNO). Atualizado em Fevereiro de 2010.<br />
  2. 2. CARACTERÍSTICAS BÁSICAS<br />http://www.analiselaboratorios.com.br/imagem/prodts/014.jpg<br />
  3. 3. CARACTERÍSTICAS BÁSICAS<br /><ul><li>Teste utilizado para detectar a presença de anticorpo (ac) específicos em fluidos corporais
  4. 4. Possui boa especificidade, porém apresenta falhas de sensibilidade
  5. 5. A formação do complexo ag/ace sua precipitação permite a visualização do teste
  6. 6. Facilidade de confecção do teste
  7. 7. Antígeno e anticorpo são colocados em meio sólido ou líquido, interagem e precipitam formando uma linha de precipitação, que indica a presença do anticorpo no soro.</li></li></ul><li>CARACTERÍSTICAS BÁSICAS<br /><ul><li> Utiliza-se, em geral, uma placa de Petri, lâmina de microscopia ou placa de poliestireno onde se adiciona o gel contendo ou não antígeno,
  8. 8. O gel geralmente é composto de agarose ou ágarnobre (a depender do teste e o tipo de malha e afinidade eletrônica que o mesmo exige). Depois de preparado e colocado na placa o gel é perfurado e nestes poços anticorpo e/ou antígeno são colocados, de onde se difundirão.
  9. 9. Na região onde o antígeno e o anticorpo se encontrarem (zona de precipitação) formar-se-á uma linha de precipitação que indica a positividade da amostra e/ou controle,
  10. 10. É um método qualitativo (na medida em que indica um resultado através da presença ou não das zonas de precipitação).</li></li></ul><li>CARACTERÍSTICAS BÁSICAS<br /><ul><li> Elementos necessários para a realização:
  11. 11. Gel de Agarose ou Ágar (o gel pode ser impregnado com Ac ou não a depender do tipo de imunodifusão),
  12. 12. Antígeno purificado (imunodifusão dupla),
  13. 13. Anticorpo purificado (controle positivo),
  14. 14. Amostras a serem testadas,
  15. 15. Placa de poliestireno, Petri, ou lâmina de microscopia,
  16. 16. Cuba de eletroforese horizontal.</li></li></ul><li>CARACTERÍSTICAS BÁSICAS<br /><ul><li> Elementos necessários para a realização:</li></ul>http://eximlab.com.br/images/fotos/fotop_DGH12_3.jpg<br />http://www.analiselaboratorios.com.br/imagem/prodts/014.jpg<br />Placas Imunodifusão<br />http://www.biomol.com.br/Imagens/Fotos/%7B1isqt6495xo2bv02u0i43dlgfdrxh4%7D_Cubas%20de%20Eletroforese%20Horizontal%2014%20x%2014.JPG<br />Acervo pessoal.<br />Placa de Petri<br />Cuba de eletroforese horizontal<br />
  17. 17. CARACTERÍSTICAS BÁSICAS<br /><ul><li> Vantagens
  18. 18. É um método de fácil execução,
  19. 19. Não necessita de aparato sofisticado,
  20. 20. Teste com boa especificidade (característica que indica que o teste em questão identificará somente o ag ou ac desejado) – menor risco de falsos-positivos,
  21. 21. Permite que várias amostras sejam testadas ao mesmo tempo,
  22. 22. Realização relativamente rápida, simples e de custo baixo em comparação com outras técnicas.</li></li></ul><li>CARACTERÍSTICAS BÁSICAS<br /><ul><li>Desvantagens
  23. 23. Falhas em sensibilidade, o que indica um alto risco de falsos negativos,
  24. 24. É um teste que apresenta alguns problemas com a reprodutibilidade,
  25. 25. Apesar de ser um texte de rápida execução, o tempo de incubação é muito grande, de 24 até 72 horas em alguns casos.
  26. 26. Difícil peservaçãodo gel
  27. 27. Não aplicável a alguns isotipos de imunoglobulinas.</li></li></ul><li>PRINCIPAIS TIPOS<br />
  28. 28. PRINCIPAIS TIPOS<br />EM MEIO SEMI-SÓLIDO <br /><ul><li>IMUNODIFUSÃO RADIAL: dosagem de ac ou ag
  29. 29. IMUNODIFUSÃO DUPLA: detecção de ac
  30. 30. IMUNOELETROFORESE: avaliação de imunoglobulinas</li></li></ul><li>-<br />-<br />+<br />Anticorpo livre<br />-<br />-<br />+<br />Antígeno livre<br />Precipitação de anticorpo<br />Zona de excesso <br /> de anticorpo<br /> Zona de <br />equivalência<br />Zona de excesso <br /> de antígeno<br />Quantidade de antígeno adicionado <br />CURVA DE PRECIPITAÇÃO<br />
  31. 31. IMUNODIFUSÃO RADIAL (Mancini e Fahey, 1965)<br />1) A placa se encontra cheia de gel impregnado com um anticorpo específico, <br />2) Coloca-se os controles positivos e as amostras a serem testadas nos poços perfurados no gel, <br />3) Incuba-se a placa por 48 horas,<br />Porf. Cruvinel, W.M.. PRECIPITAÇÃO, Laboratório de Apoio Didático – UCG –Go.<br />4) Os halos (zona de equivalência) formados em tono dos poços são medidos, <br />Porf. Cruvinel, W.M.. PRECIPITAÇÃO, Laboratório de Apoio Didático – UCG –Go.<br />
  32. 32. IMUNODIFUSÃO RADIAL<br /><ul><li>Interpretação dos resultados:
  33. 33. Durante a incubação ocorre a difusão do antígeno na agarose e a formação de complexos ag-ac.,
  34. 34. Os complexos precipitam e formam um halo ao redor do orifício,
  35. 35. Existe uma relação linear entre o quadrado do diâmetro do halo (d2) e a concentração do antígeno,
  36. 36. Utilizando antígeno de concentrações conhecidas pode-se fazer uma curva padrão, permitindo determinar a concentração em amostras desconhecidas.</li></ul>Porf. Cruvinel, W.M.. PRECIPITAÇÃO, Laboratório de Apoio Didático – UCG –Go.<br />http://www.anflalab.com.br/images/Hoja%20Diffuplate%20051.jpg<br />Porf. Cruvinel, W.M.. PRECIPITAÇÃO, Laboratório de Apoio Didático – UCG –Go.<br />
  37. 37. IMUNODIFUÃO RADIAL<br /><ul><li>Aplicações na medicina humana e veterinária:
  38. 38. Diagnóstico de doenças infecto-contagiosas, onde a detecção de imunoglobulinas e proteinas séricas seja significativa
  39. 39. Exemplos: dosagem de imunoglobulinas e proteina séricas (tanto em humanos como em animais).</li></li></ul><li>IMUNODIFUSÃO DUPLA (Ouchterlony, 1947)<br />1) O gel de agarose ou agaré preparado e colocado na placa,<br />2) Após a solidificação do gel, poços são perfurados com um molde (perfurador ou roseta),<br />3) adiciona-se antígeno , controle positivo e a amostra a ser testada nos poços perfurados,<br />4) Incuba-se a placa por 48 horas.<br />5) Os complexos ac-ag se formam e precipitam formando linhas de precipitação que indicam o resultado.<br />Acervo Pessoal.<br />Porf. Cruvinel, W.M.. PRECIPITAÇÃO, Laboratório de Apoio Didático – UCG –Go.<br />Porf. Cruvinel, W.M.. PRECIPITAÇÃO, Laboratório de Apoio Didático – UCG –Go<br />
  40. 40. IMUNODIFUSÃO DUPLA<br /><ul><li>Interpretação dos resultados:
  41. 41. A formação e localização da banda de precipitação indicam a presença de ac bem como sua concentração em relação ao ag,
  42. 42. Quanto mais perto do ag maior a concentração de ac na amostra . </li></ul>Acervo pessoal.<br />
  43. 43. IMUNODIFUSÃO DUPLA<br /><ul><li>Aplicações na medicina humana e veterinária:
  44. 44. Muito usado no diagnóstico de doenças infecto-contagiosas,
  45. 45. Exemplos na Medicina Humana: Candidísase, Histoplasmose e Aspergilose
  46. 46. Exemplos na Medicina Veterinária: Doença de Maedi-visna, Brucella ovis.</li></li></ul><li>IMUNOELETROFORESE<br />1) O gel é preparado e perfurado após sua solidificaçação,<br />2) O pH do gel éescolhido de forma que partículas negativas migrem para o eletrodo positivo,<br />3) É colocado o ac e/ou ag (a depender do tipo de imunoeletroforese) nos poços ou canaleta perfurados,<br />4) O gel numa cuba de eletroforese horizontal,<br />5) É aplicada carga no gel, esta carga é a responsável pela migração de ag,<br />6) É cortada uma canaleta entre os poços, a qual será preenchida com ac,<br />BURMESTER, G.R.; Pezzutto, A.. Color Atlas of Immunology. Thieme, Germany, 2003.<br />7) Ac e ag formam arcos de precipitação no gel<br />
  47. 47. IMUNOELETROFORESE<br /><ul><li>Interpretação dos resultados:
  48. 48. Proteínas podem ser identificadas baseado na intensidade, forma e posição das linhas de precipitação,
  49. 49. Cada arco de precipitação representa um antígeno.</li></ul>Imunoeletroforese<br />Rocket Eletroforese<br />
  50. 50. IMUNOELETROFORESE<br /><ul><li>Aplicações na Medicina Humana e Veterinária:
  51. 51. Utilizada em pacientes com suspeitas de gamopatias monoclonais e policlonais. Imunoglobulinas policlonais são distribuídas uniformemente através da fração de gama-globulina depois da separação eletroforética.
  52. 52. Diagnóstico sorológico de algumas doenças
  53. 53. Exemplo na Medicina Humana: detecção de ac e ag bacterianos (Meningite e Septicemia), Cisticercose.
  54. 54. Exemplo na Medicina Veterinária: cisticercose, alérgenos.</li></li></ul><li>REFERÊNCIAS<br /><ul><li> BURMESTER, G.R.; Pezzutto, A.. Color Atlas of Immunology. Thieme, Germany, 2003.
  55. 55. ROITT,I.M.; Rabson, A.; Delves, P.J.. Really Essential Medical Immunology. Ed – 2. Blackwell Publishing. Massachusetts – USA, 2005.
  56. 56. TEIXEIRA, A.C.O.; Ferreira, M.A.S.V. e Marques, A.S.A.. Detecção de Erwinia psidii via enriquecimento em extrato de folhas de goiabeira e imunodifusão radial dupla. Tropical Plant Patology, vol. 33, nº 3. Brasilia, Junho de 2008.
  57. 57. http://www.analiselaboratorios.com.br/imagem/prodts/014.jpg
  58. 58. http://pathmicro.med.sc.edu/Portuguese/13.GIF
  59. 59. http://eximlab.com.br/images/fotos/fotop_DGH12_3.jpg
  60. 60. http://www.biomol.com.br/Imagens/Fotos/%7B1isqt6495xo2bv02u0i43dlgfdrxh4%7D_Cubas%20de%20Eletroforese%20Horizontal%2014%20x%2014.JPG
  61. 61. http://www.anflalab.com.br/images/Hoja%20Diffuplate%20051.jpg
  62. 62. http://www.fcf.usp.br/Ensino/Graduacao/Disciplinas/LinkAula/imunoprecipitacao.pdf
  63. 63. http://www.unirio.br/DMP/Graduacao/Medicina/Imunologia/Ag-Ab%20Reactions.pdf
  64. 64. http://www.scielosp.org/img/revistas/rsp/v12n1/11f1.gif</li>

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