REVISTA DE BIOLOGIA E CIÊNCIAS DA TERRA ISSN 1519-5228 
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  1. 1. REVISTA DE BIOLOGIA E CIÊNCIAS DA TERRA ISSN 1519-5228 64 Volume 15 - Número 2 - 2º Semestre 2015 PADRONIZAÇÃO DA TIPAGEM SANGUÍNEA PARA ANTI- H LECITINA E ANÁLISE DO LIMITE DE DETECÇÃO DA TÉCNICA DE TIPAGEM ABO Maria de Jesus Rodrigues de Castro1; Jocileide dos Reis Moraes1; Rubens Alex de Oliveira Menezes2; Luiz Carlos Nascimento da Silva3; Flávio Henrique Ferreira Barbosa4; Pablo Abdon da Costa Frances5 RESUMO Testes laboratoriais de identificação do fenótipo dos grupos sanguíneos do sistema ABO, em manchas secas de sangue, fornecem evidências em casos forenses com grande auxilio na elucidação desses casos. O objetivo deste estudo é analisar o limite de detecção da técnica de tipagem ABO e implantar uma padronização do uso do soro anti-H-lecitina para esclarecer tipagens do grupo O e subgrupo de A, além de identificar possíveis fenótipos de Bombay. A técnica empregada inicialmente foi Absorção-eluição em 144 amostras de sangue, coletadas e previamente fenotipadas para os grupos O, A e B, em iguais proporções, em duas Unidades Básicas de Saúde de Macapá. Os testes foram feitos em diferentes diluições, para confrontar esses resultados analisou-se mais 36 amostras de sangue, dos grupos A e B, usando técnica modificada, apresentando resultados de maior sensibilidade. Os testes realizados com o anti-H lecitina evidenciaram a importância do seu uso nas manchas do grupo O, confirmando o fenótipo em questão. Palavras-chave: Aglutinações, diluições, grupo sanguíneo, manchas de sangue. STANDARDIZATION OF BLOOD TYPING FOR ANTI H LECITHIN AND ANALYSIS OF THE LIMIT OF DETECTION ABO TECHNIQUE TYPING ABSTRACT Laboratory tests to identify the phenotype of the ABO blood group system in dried blood spots, provide evidence in forensic cases with great aid in the elucidation of these cases. The aim of this study is to analyze the detection limit of the technique of ABO and implement a standardization of the use of anti-H serum-lecithin to clarify the group's typing and subgroup of A, and identify possible phenotypes of Bombay. The technique was initially Absorption-elution in 144 blood samples collected and previously phenotyped for groups O, A and B, in equal proportions, two Basic Health Units of Macapa. The tests were conducted at different dilutions, to compare these results was analyzed over 36 blood samples from groups A and B, using modified technique, with higher sensitivity results. Tests conducted with lecithin anti-H showed the importance of its use in the group's spots, confirming the phenotype in question. Keywords: Aggregations, dilutions, blood group, blood stains.
  2. 2. 65 INTRODUÇÃO A tipagem sanguínea em manchas de sangue seco fornece evidências em casos de homicídios, estupros, acidentes e tem se mostrado de grande auxilio na elucidação desses crimes, conjuntamente com outras provas e testemunha. O sistema de grupos sanguíneos ABO, consiste em três pares de alelos: A, B e O (BAIN, 2003; DACIE; LEWIS, 1998). Os genes A e B controlam a síntese de enzimas específicas responsáveis pela adição de um único resíduo de carboidrato (N- acetil-galactosamina no grupo A e D- galactosamina no grupo B) em uma glicoproteína básica antigênica ou em um glicolipídio com terminal em açúcar de L-fucose no eritrócito, conhecida como substância H (HOFFBRAND, 2008; FERGUSON-SMITH et al., 1976). O gene O é amorfo e não transforma a substância H, segundo Hoffbrand (2008), antígenos A, B e H estão presentes na maioria das células do organismo, incluindo linfócitos, plaquetas, endotélio capilar venular e arterial, células do baço, medula óssea, mucosa gástrica, além de secreções e outros fluidos como saliva, urina e leite (VERRASTRO, 1996; HILLMANN, 1998). A determinação do fenótipo ABO, baseia-se na aglutinação de eritrócitos, através de agregados visíveis como resultado da interação de anticorpos específicos do tipo aglutinogênios, naturalmente encontradas no soro através do uso de reagentes específicos imuno-hematológicos, que irão identificar os açúcares específicos dos glóbulos vermelhos, pela presença ou ausência das substâncias: A, B, e H no soro e/ou saliva e utilizando a técnica de Absorção-eluição (YAMAMOTO, 2000; LEE; REID, 2000). Diferentes níveis de expressão de antígenos A ou B nos eritrócitos podem ser encontrados, sendo chamados de subgrupos de A ou B, conforme a intensidade de aglutinação dos eritrócitos com os reagentes anti-A, anti- B, anti- A1 e anti-H. A reatividade do reagente anti-H com as hemácias dos reagentes dos diferentes grupos sanguíneos ABO tende a ser: O>A2> B>A2B> A1> A1B. Os dois subgrupos de A, A1 e A2, são diferenciados sorologicamente com o uso da reagente lecitina anti-A1, (LORENZI, 1992; VENGELEN-TYLER, 1999). O fenótipo A2 comum em caucasianos é detectado por meio da capacidade de aglutinarem com soro anti A e de não aglutinarem com soro lecitina anti A1, ao contrário do fenótipo A1, cujas hemácias são aglutinadas na presença desse reagente. Os dois alelos são comuns, porém com frequência extremamente diferente nas populações estudadas. Atualmente os procedimentos técnicos laboratoriais para a diferenciação dos grupos sanguíneos disponíveis no laboratório forense da Polícia Técnica Cientifica do Amapá- POLITEC-AP, baseia-se na técnica de absorção-eluição em mancha de sangue seco no tubo de ensaio (TOCCHETTO; ESPINDOLA-2005). Esta técnica muito trabalhosa, com resultados subjetivos principalmente para os subgrupos A (A1 e A2), e como um resultado pericial não pode ser duvidoso, surgiu a necessidade de introduzir, durante os experimentos, uma técnica que proporcione maior segurança que a atual, que é a técnica de Absorção-eluição modificada por Rolim e Sawaya (1997), que é reconhecida mundialmente, mais sensível que a utilizada pela POLITEC, possibilitando assim resultados mais confiáveis. O resultado obtido com a técnica padronizada pelo laboratório forense permite a detecção até a 3% para os grupos A e B, com a modificação da técnica, usando Albumina bovina a 6%, houve aumento da sensibilidade, permitindo a visualização de aglutinação até a 1% para os referidos grupos. Quanto ao uso do anti-H lecitina, houve positividade, nos fenótipos O, A, B, comprovando sua escala de reatividade. O presente trabalho objetiva estudar a padronização da tipagem para o soro anti-H lecitina, bem como o limite de detecção da técnica de tipagem ABO: Absorção-eluição para uso no laboratório forense da POLITEC/AP. MATERIAL E MÉTODOS O material utilizado neste trabalho para padronização das manchas teste e controle foram obtidas nas Unidades Básicas de Saúde Congós e Lélio Silva do município de Macapá, e duas amostras vítima e arma branca provenientes do Laboratório da POLITEC-AP. As amostras
  3. 3. 66 Testes e Controle foram fenotipadas por Tipagem Direta de Soro precipitação em tubo de ensaio, no mesmo dia da coleta para os grupos sanguíneos: A, B e O. As amostras foram mantidas em tubos de ensaio e posteriormente, processadas diluições a: 5%, 3%, 2%, 1%, ½%, e na diluição a 3% titulamos até 1/100 para cada grupo, em seguida preparadas suas respectivas manchas e acondicionadas em placas de plástico, cobertas com papel alumínio perfurado, por 24 horas, secando a temperatura ambiente. Quando secas, acondicionadas em envelopes de papel devidamente identificados e guardadas a temperatura ambiente antes de ser submetidos aos ensaios. - Método de Fenotipagem Direta ou Globular em Tubo de Ensaio De acordo com Beth Vincent (1992), para determinação do sistema ABO através da prova direta utilizam-se dois tubos de ensaio identificados como anti-A e anti-B, acrescentando seus respectivos anti-soros, centrifugando e analisando macroscopicamente os resultados, comparando as aglutinações obtidas com os tubos controles anti-A e anti-B preparados simultaneamente aos testes. Como demonstra a figura 01. Figura 01 - Presença de Aglutinação Fonte: Instrumento de Coleta de Dados - Absorção-eluição em tubo de ensaio Nas primeiras cento e quarenta e quatro amostras foi utilizada a técnica descrita por Tochetto e Espíndola (2005) nas 36 amostras subsequentes empregou-se a técnica modificada de Rolim e Sawaya, (1997). Das manchas controle, testes e branco previamente preparadas em papel filtro retira-se uma porção padronizada em 6 ml x 6 ml e inicia-se a montagem da bateria. Coloca-se um pedaço da mancha de cada diluição em dois tubos diferentes um referente ao anti-A e outro ao anti- B. Adiciona-se 100 μl de solução salina (NaCl) a 0,9% a temperatura ambiente e duas gotas de soroclone anti-A e anti-B (Anticorpos Monoclonais Humanos – SEM-NPBI), respectivamente nos tubos A e B. Deixando na geladeira em overnight a 4° C. No dia seguinte procede-se a lavagem com solução salina gelada a 4° C, seguida de agitação por dois minutos, consecutivamente por seis vezes. Após a última lavagem, retira-se totalmente a solução salina gelada e adiciona-se aos tubos 100 μl de solução salina a temperatura ambiente. Incubando a 56ºC por quinze minutos (YAMAMOTO; MCNEILL; HAKOMORI, 1992). Retiram-se as manchas dos tubos e deixa o eluato chegar à temperatura ambiente. Adicionam-se 100 μl de suspensão de células (hemácias) a 3% em salina A e B, sendo hemácia A no tubo que foi colocado anti-A e hemácia B no outro tubo. Acrescenta-se 50 μl de Albumina Bovina a 6% (albumina bovina 22%) em todos os tubos coloca-se para agitar por dez minutos acompanhados de centrifugação por um minuto a 3000 rpm (BAIN, 1997). Analisando macroscopicamente os resultados das amostras questionadas, comparando as aglutinações obtidas com os tubos controles anti-A e anti-B realizados concomitantemente aos testes, conforme visualizado na figura 02. Figura 02 - Aglutinações nos tubos nos controles e amostras testes Fonte: Instrumento de Coleta de Dados
  4. 4. 67 - A técnica para a Padronização do soro anti- H. Segundo Rolim e Sawaya, (1997) inicia-se a montagem da bateria colocando um pedaço da mancha de cada diluição testada em um tubo referente ao anti-H, dois tubos controles anti-A e anti-B e um Branco. Adiciona-se 100 μl de solução salina (NaCl) a 0,9% a temperatura ambiente e três gotas de soro anti-H lecitina não diluído (Anticorpos Monoclonais Humanos – SEM-NPBI), em todos os tubos. Seguindo os passos da técnica anterior substituindo a temperatura de incubação de 56 º C para 60ºC (LORENZI et al., 2003; TOCHETTO; ESPÍNDOLA, 2005). Colocar uma gota de suspensão de células “O” a 3% e 50 μl de Albumina Bovina a 6% em todos os tubos. Em seguida agita-se por dez minutos seguidos de centrifugação por um minuto a 3000 rpm. Analisando macroscopicamente os resultados das amostras questionadas, comparando as aglutinações obtidas com os tubos controles anti-A e anti-B realizados simultaneamente aos testes. Ocorre aglutinação de acordo com escala de reatividade deste anti-soro (AULER-BITTENCOURT; NEGRINI-NETO, 1996). RESULTADOS As 144 amostras processadas através do Método de Absorção-eluição foram alcançadas uma fraca aglutinação tanto nas amostras controle quanto nas diluições testadas: A até 3%, e B até 2%. Método de Fenotipagem Direta segundo Beth Vincent (1992), obteve-se aglutinação no grupo A e B até diluição 3% na titulação 1/10. Nas 42 amostras testadas pelo Método Absorção-eluição segundo Rolim e Sawaya (1997), foi visualizada uma sensibilidade maior, permitindo caracterizar a fenotipagem até 1% conforme demonstrado tabela 1.
  5. 5. 68 Tabela 1 – Quadro comparativo das Metodologias de Absorção-eluição SEM AMOSTRAS (diluições, testes e controles) ALBUMINA BOVINA AGLUTINAÇÃO COM ALBUMINA BOVINA AGLUTINAÇÃO A 5% 08 ++ 06 ++++ A 3% 08 + 06 +++ A 2% 08 - 06 ++ A 1% 08 - 04 + A ½ % 08 - - - A 3% 1/10 08 - - - A 3% 1/100 06 - - - B 5% 06 +++ 02 ++++ B 3% 06 ++ 02 ++++ B 2% 06 + 04 +++ B 1% 06 - 04 ++ B ½ % 06 - - - B 3% 1/10 06 - - - B 3% 1/100 06 - - - Amostra Forense I (arma 02 - 04 - branca) Amostra Forense II (vítima) 02 - 04 - Controle A anti-A + +++ Controle B Anti-A - - Controle A Anti-B - - Controle B Anti-B ++ ++++ Fonte: Instrumento de Coleta de dados (-) ausência de aglutinação (+)/(++) aglutinação fraca (+++)/(++++) aglutinação forte Das oito amostras testadas com o anti-H lecitina houve novamente uma maior reatividade com a adição da albumina bovina comprovando a maior sensibilidade da Metodologia modificada conforme tabela 2. Tabela 2 – Quadro quantitativo de resultados das amostras para Testes Anti-H AMOSTRAS (diluições, testes, controles) SEM ALBUMINA BOVINA AGLUTINAÇÃO COM ALBUMINA BOVINA AGLUTINAÇÃO O 10% 01 + 01 ++ O 5% - - 01 ++ O 3% 01 - - - O 2% 01 - - - O 1% 01 - - - Amostra Forense I (arma 01 - - - branca) Amostra Forense II (vítima) 01 - - - Controle A anti-H 01 + 01 ++ Controle B anti-H 01 + 01 + Branco 01 - 01 - Fonte: Instrumento de Coleta de dados (-) ausência de aglutinação (+)/(++) aglutinação fraca
  6. 6. 69 Devido às variações de aglutinação 5 % a 1 % para o grupo A evidenciou-se empiricamente que apenas quatro voluntários (II) apresentaram como resultados uma fraca reatividade, compatível com subgrupo A2 de acordo com tabela 3. Tabela 3 – Quadro comparativo de resultados dos subrupos de A AMOSTRAS/DILUIÇÕES A 5% A 3% A 2% A 1% Voluntário I Grupo A +++ ++ + - Voluntário II Grupo A ++ + - - Voluntário III Grupo A ++++ +++ ++ + Voluntário IV Grupo A +++ ++ + - Controle I ++++ +++ ++ + Controle II + - - - Branco - - - - Fonte: Instrumento de Coleta de dados DISCUSSÃO Frente aos resultados alcançados nos ensaios iniciais tornou-se necessária a otimização da Metodologia, introduzindo a técnica descrita por Rolim e Sawaya, (1997) a qual foi adaptada e padronizada para nossos estudos, tendo em vista, ter demonstrado ser mais eficaz e sensível na determinação dos fenótipos desse sistema (ALCANTARA, 1982). A variação no grupo A, ocorre em função dos subgrupos que reagem distintamente como demonstrados na tabela 3, confirmando os achados de Vengelen-Tyler, (1999) evidenciando sua reatividade decrescente A1B>A1>A2B>B>A2>O, onde os dois principais subgrupos de A, A1 e A2 são diferenciados sorologicamente com o uso do reagente lecitina anti-A1 e apresentam reação diferenciada frente a lecitina anti-H conforme tabela 4. Tabela 4 – Quadro descritivo dos subgrupos de A frente às lecitinas SUBGRUPOS LECITINA LECITINA DE A ANTI-A1 ANTI-H SG A1 +++ - ou + SG A + ++ intermediário SG A2 - ou + +++ Fonte: Instrumento de Coleta de dados (-) ausência de aglutinação (+)/(++) aglutinação fraca (+++) aglutinação forte Nos ensaios para padronização do soro anti-H lecitina a reação do antígeno-H foi possível nas amostras do Grupo O a 10%, na técnica descrita por Tochetto e Espíndola (2005). Com o uso da metodologia modificada obteve-se uma reatividade maior, inclusive nos controles comprovando achados de Girello e Kuhn (2000) onde sua proporção está na ordem decrescente de O>B>A>AB. A pesquisa do antígeno H nas amostras testadas destaca a importância nos casos em que o sangue presente na mancha pertence ao grupo O. A presença do mesmo afirma o fenótipo em questão descartando a possibilidade de tal resultado ser inferido devido as ausências de antígenos, este fato é relevante no caso em que se questiona a exiguidade de material (OLSSON; CHESTER al., 2001). Excepcionalmente devido à dificuldade em conseguir uma quantidade maior de soro anti-H Lecitina não foi possível à realização de um quantitativo mais expressivo das amostras. Nas amostras forenses analisadas não houve aglutinação, possivelmente por tratar-se de amostras coletadas em período superior a três meses, o que inviabiliza a reação antígeno-anticorpo ou a influência de alguns fatores como pH do meio, temperatura, classe do antígeno, presença de fungos e bactéria que podem interferir na reação antígeno-anticorpo. CONCLUSÃO Os avanços da biologia molecular aplicados a ciências forenses, não descartou a importância da determinação do grupo sanguíneo do sistema ABO, que ainda é largamente usado nessa área. A possível discrepância entre o grupo sanguíneo entre vítima e provável suspeito, demonstra a necessidade desta técnica, por que pode inocentar um indivíduo envolvido em um crime. A técnica de absorção-diluição em tubo de ensaio, tem como vantagem ser de baixo custo e boa sensibilidade sendo ainda largamente usada, já que outras técnicas de maior sensibilidade e custo elevado como a automação (gel centrifugação) ainda não está disponível na POLITEC- AP. A técnica de Absorção-eluição modificada por Rolim e Sawaya (1997) mostrou-se mais sensível, permitindo chegar ao limite de detecção da técnica de tipagem sanguínea ABO,
  7. 7. 70 1% para o Grupo B, 3% subgrupo A2 e 1% subgrupo A1, essa variação de aglutinação para os subgrupos provoca numerosas discussões. Atualmente pesquisas sugerem está ligada, ao número de sítios receptores e a sua distribuição na superfície da hemácia. O fenótipo A1 possui 1.000.000 de sítios/hemácia e o fenótipo A2, 200.000 sítios/hemácias. Com a técnica modificada citada cima, as reações obtidas com o Anti-H lecitina, apresentou aglutinação positiva para o grupo O, nas diluições 10% e 5% e no controle A, possivelmente subgrupo A2, devido a aglutinação presente. Como realizamos poucos testes para este anti-soro existe a necessidade de novos estudos para se disponibilizar na rotina forense em Macapá. AGRADECIMENTOS A equipe dos laboratórios das Unidades Básicas de Saúde: Congos e Lélio Silva, pelo apoio e incentivo na realização dos experimentos. À Rose, que contribuiu significativamente na coleta de dados deste trabalho. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS ALCANTARA, Hermes Rodrigues. Perícia Médica Judicial: Guanabara, 1982. AULER-BITTENCOURT, E.A.; NEGRINI-NETO, O. Problemas para aplicação das Técnicas de DNA nas Ciências Forense - Abstracts of the III World Congresso Legal de Medicine, I Jornada Brasileira de Criminalística, São Paulo, 1996. BAIN, B. J. Células sanguíneas: Um Guia Prático. 2ª ed. São Paulo, Artes Médica, 1997. BAIN, B. J. Diagnóstico em Leucemias. 2ª ed. Rio de Janeiro, Revinter, 2003. BETH VINCENT. Técnicas aplicadas à imuno-hematologia eritrocitária. In. Alves de Lima L, Callado MRL, Santos J A. Curso de Imuno-hematologia. Botucatu. Faculdade de Medicina, p. 122, 1992. DACIE, J.V; LEWIS, S. M. Practical Haematology. 3ª ed. Editora El Manual Moderno, 1998. FERGUSON-SMITH MA, AITKEN DA, TURLEAU C, GROUCHY J. Localization of the human ABO:Np-1:AK-1 linkage group by regional assignment of AK-1 to 9q34. Hum Genet. 1976;34:35-43. GIRELLO, Ana Lúcia; KUHN, Telma Ingrid Borges de Bellis. Apostila I-Bases Imunológicas: Bioline consultoria, 2000. HOFLBRAND, A. V; MOSS, P. A. H; PETTIT J. E. Fundamentos Hematológicos. 5ª edição, 2008. HILLMANN, R. S. Manual de Hematologia. 2ª ed. Editora El Manual Moderno, 1998. LEE AH, REID ME. ABO blood group system: a review of molecular aspects. Immunohematology. 2000;16(1):01-06. LORENZI, T.F. Manual de Hematologia. Propedêutica e Clínica, Editora Médica e Científica, 1992. LORENZI, T.F., D’ AMICO, E., DANIEL, E.E., SILVEIRA, P.A., BUCCHER, V. Manual de Hematologia propedêutica e clínica. 3ª edição. Guanabara Koogan, 2003. OLSSON ML, CHESTER MA. Polymorphism and recombination events at the ABO locus: a major challenge for genomic ABO blood grouping strategies. Transfusion Medicine.2001;11(4):295-313. ROLIM, M. R. S.; SAWAYA, M. C. T. Análises químicas e imunológicas aplicadas à medicina legal: Fluidos do corpo. Curitiba: Associação de Criminalística do Estado do Paraná, 1997. VENGELEN -TYLER V. Technical Manual, 12th ed. Bethesda: American Association of Blood Banks, 1999. VERRASTRO, Terezinha: Lorenzi, T.F.; Wendel, S.N. Hematologia e Hemoterapia. São Paulo,1996.
  8. 8. 71 YAMAMOTO F, MCNEILL PD, HAKOMORI S. Human histo-blood group A transferase coded by A2 allele, one of the A subtypes, is characterized by a results in an additional domain at the carboxyl terminal. Biochem. Biophys Res Commun. 1992;187:366-374. YAMAMOTO F. Molecular Genetics of ABO. Vox Sang. 2000;78(suppl):91 103. ______________________________________ 1-Farmacêutica-bioquímica do Governo do Estado do Amapá (GEA) - Macapá (AP), Brasil. 2-Graduação em Enfermagem pela Universidade Federal do Amapá e Mestrado pelo Programa de Pós Graduação em Ciências da Saúde da Universidade Federal do Amapá, UNIFAP. Funcionário do Governo do Estado do Amapá lotado no Laboratório Central de Saúde Pública do Amapá - LACEN-AP, Macapá, Amapá, Brasil. 3-Tecnologia em Radiologia pela Faculdade Santa Emília de Rodat. Especialista em Proteção Radiologica pela Faculdade Santa Emília de Rodat, tecnólogo em Radioloiga - secretaria de estado da Saúde-AP e coordenador do curso de tecnologia em radiologia da Faculdade de Tecnologia do Amapá - Meta. 4-Professor Adjunto A - Nível 1 (Dedicação Exclusiva) da Universidade Federal de Sergipe - UFS, vinculado ao Departamento de Morfologia na Área de Conhecimento: Microbiologia e Imunologia. 5-Graduação em Ciências Biológicas modalidade Licenciatura e Bacharelado pela Universidade Federal do Pará. Mestrado em Genética e Biologia Molecular pela Universidade Federal do Pará. Doutorado em Genética e Biologia Molecular pela Universidade Federal do Pará. Perito Criminal - Polícia Técnico- Científica. Correspondência: Rubens Alex de Oliveira Menezes – Avenida João Guerra, nº1566, Bairro dos Congós. CEP: 68904360. Macapá – AP, Brasil. E-mail: ra-menezes@hotmail.com

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