C I T O M E T R I A D E F L U X O

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Aula prática de Imunologia ICS - UFBA: Citrometria de Fluxo

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  1. 1. UNIVERSIDADE FEDERAL DA BAHIA INSTITUTO DE CIÊNCIAS DA SAÚDE – ICSDEPARTAMENTO DE BIOINTERAÇÃODISCIPLINA: IMUNOLOGIA I – ICS 045<br />CITOMETRIA DE FLUXO<br />Trabalho realizado pela Doutoranda de Imunologia da UFBA Danielle Dantas Lima sob orientação dos Professores Robert Schaer, Roberto Meyer, Cláudia Brodskin e Ricardo Portela. Atualizado em Fevereiro de 2010.<br />
  2. 2. CARACTERÍSTICAS BÁSICAS<br />
  3. 3. CARACTERÍSTICAS BÁSICAS<br /><ul><li>DEFINIÇÃO:
  4. 4. É umatécnicautilizadaparacontar, examinar e classificarpartículasmicroscópicassuspensasemmeiolíquidoemfluxo. Permite a análise de váriosparâmetrossimultaneamente, sendoconhecidatambémporcitometria de fluxomultiparamétrica. Através de um aparelho de detecçãoóptico-eletrônicosãopossíveisanálises de característicasfísicas e/ouquímicas de uma simples célula. O citômetro de fluxo é um aparelhoutilizadoparaavaliaçãodaemissão de fluorescência das células (FACS – Fluorescence Activated CellSorter). </li></li></ul><li>CARACTERÍSTICAS BÁSICAS<br /><ul><li>Os anticorposmonoclonaissãoosreagentes de escolhadevido à suaespecificidade, reaçãocruzadamínima e reprodutibilidade. O citômetro de fluxomede as propriedades de dispersão de luzpelas as células e a emissão de luz de anticorposmonoclonaisassociados a fluorocromos e ligados à superfície de umacélula.</li></li></ul><li>CARACTERÍSTICAS BÁSICAS<br /> VANTAGENS<br /><ul><li>Mede múltiplos parâmetros em células individuais;
  5. 5. Grande número de células analisadas com rapidez;
  6. 6. Disponibilidade de amplo perfil de anticorpos específicos;
  7. 7. Análise de antígenos de superfície, intracitoplasmáticos e intranucleares;</li></li></ul><li>CARACTERÍSTICAS BÁSICAS<br /><ul><li>APLICAÇÕES
  8. 8. Fenotipagem dos leucócitos
  9. 9. Fenotipagem de células tumorais</li></ul>- Diagnóstico e classificação das leucemias e dos linfomas<br /><ul><li>Análise de DNA
  10. 10. Análise da função dos neutrófilos
  11. 11. Contagem de reticulócitos</li></li></ul><li>CARACTERÍSTICAS BÁSICAS<br /><ul><li>APLICAÇÕES EM MEDICINA VETERINÁRIA
  12. 12. Quantificação de subpopulações linfocitárias
  13. 13. Quantificação das células CD34+ como indicação da capacidade de reconstituição hematopoiética após o transplante de células-tronco
  14. 14. Avaliação de eritrócitos
  15. 15. Avaliação de plaquetas</li></li></ul><li>METODOLOGIA<br />
  16. 16. METODOLOGIA<br /><ul><li>As células, umavezemsuspensão, sãoorientadasem um fluxo laminar e interceptadasuma a umapor um feixe de luz (LASER).
  17. 17. Um número de detectoressãoapontadosao local onde o fluxopassaatravés do feixe de luz; um nalinha do feixe de luz (Forward ScatterouFSC) e váriosperpendiculares a este (Side ScatterouSSC) além de um oumaisdetectoresfluorescentes. Cadapartículasuspensapassandoatravés do feixedispersa a luz de uma forma, e osfluorocromosfluorescentesencontradosnapartículapodem ser excitadosemitindoluz de menorfrequência do que o dafonte de luz. Estacombinação de luzdispersa e fluorescente é melhoradapelosdectetores, e analisando as flutuações de brilho de cada detector (umaparacadapico de emissãofluorescente) é possívelexplorarváriostipos de informaçãosobre a estruturafísica e química de cadapartícula. </li></li></ul><li>METODOLOGIA<br />Detector de dispersão de luz frontal Tamanho celular<br />FSC (Forward Scatter)‏<br />Fonte de Luz Incidente: Laser de Argon a 488 nm <br />Detector de dispersão de luz em ângulo de 90º Complexidade celular<br />SSC (Side Scatter)‏<br />
  18. 18. METODOLOGIA<br />ÂNGULO DE DISPERSÃO LATERAL (SSC)‏<br />LASER<br />CÉLULA<br />ÂNGULO DE DISPERSÃO FRONTAL (FSC)‏<br />
  19. 19. METODOLOGIA<br />4)Filtro <br />1)Suspensão de células<br />6) Análise de dados<br />5)A luz refletida passa através de filtros e é detectada por tubos fotomultiplicadores que convertem o sinal luminoso em sinal eletrônico<br />3)Dispersão lateral de luz<br />Laser<br />3)Dispersão de luz para a frente<br />2) Anticorpos monoclonais associados a fluorocromos e ligados à superfície de uma célula<br />
  20. 20. Anticorpos monoclonais marcados<br />Linfócito TCD8<br />Citometria de fluxo<br />Luz fluorescente<br />Laser<br />METODOLOGIA<br />Linfócito TCD4<br />Contagem das células<br />
  21. 21. METODOLOGIA<br />Gráfico de análise de leucócitos (dispersão lateral e frontal) <br />Cada ponto significa uma célula identificada pelo citômetro.<br />Estão divididas pela dispersão frontal (forward) – tamanho da célula - horizontalmente<br />E também pela dispersão lateral (side) - granulação e complexidade – verticalmente<br />Os círculos indica células que pertencem a um grupo de tamanho e complexidade próximos<br />
  22. 22. METODOLOGIA<br />Gráfico de análise de leucócitos (com fluorescência) <br />Neste quadrante estão as <br />células CD4+ e CD3-<br />Neste quadrante estão as <br />células CD4+ e CD3+<br />(linfócitos Th)<br />Neste quadrante estão as <br />células CD4- e CD3+<br />(outros linfócitos que não Th)<br />Neste quadrante estão as <br />células CD4- e CD3-<br />(células que não linfócitos)<br />

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