2. • São proteínas que aumentam a velocidade das reações químicas
• Na ausência destas, diversas reações químicas do metabolismo
celular não ocorreriam
Enzimas
8. Enzimas de Restrição- Histórico
• Avery, MacLeod, McCarty (1944) demonstraram a
transformação de uma cepa avirulenta de Streptococcus
penumoniae;
• DNA como elemento transformante
9. Enzimas de Restrição - Histórico
• Watson & Crick (1953):
propõem o modelo da dupla
hélice de DNA, baseados nos
resultados de difração de raio
X de Franklin & Wilkins.
10. Procurar um gene dentro de um genoma humano é
comparável a procurar uma pessoa sem sobrenome
em uma casa sem endereço em uma rua
desconhecida em uma cidade não identificada de um
país estrangeiro.
Solange Farah
Enzimas de Restrição- Histórico
11. • Estudos em Microbiologia sugeriam que bactérias
apresentavam mecanismos de defesa para proteção
contra infecções virais.
Enzimas de Restrição- HISTÓRICO
13. Enzimas de Restrição- HISTÓRICO
• Arber (1962): microscopia eletrônica de bactérias E. coli
e bacteriófagos Lambda fornecem a primeira evidência da
existência de enzimas que restringem o crescimento viral
devido ao reconhecimento e a quebra do DNA estranho.
Arber & Linn. DNA modification and restriction. Ann Rev Biochem, 1969 .
• Smith & Wilcox (1970): enzimas que cortam DNA em
Haemophilus influenzae.
Por que o DNA bacteriano também não é clivado?
15. Enzimas de Restrição- HISTÓRICO
• Nathans & Smith (1975): purificação das enzimas por
métodos de cromatografia e digestão do DNA de SV40.
Eletroforese
16. Enzimas de Restrição- DEFINIÇÃO
• São enzimas que atuam como tesouras químicas
cortando DNA em seqüências específicas.
17. • Tipo I: reconhece específicas sequências de DNA
porém cortam em locais que podem estar a 1000 pb
de distância do sítio de reconhecimento da enzima;
Ex: EcoAI GAGNNNNNNNGTCA
EcoKI AACNNNNNNGTGC
StySPI AACNNNNNNGTRC
Enzimas de Restrição - TIPOS
18. • Tipo II: que reconhece e corta diretamente dentro do
sítio de reconhecimento;
Ex: EcoRI G/AATTC
BalI TGG/CCA
PstI CTGCA/G
Enzimas de Restrição - TIPOS
19. • Tipo III: Corte a 24-26 pb a jusante da sequência de
reconhecimento que é assimétrica e de 5 a 7 pb
Ex: EcoP151 CAGCAG
EcoPI AGACC
HinfIII CGAAT
Enzimas de Restrição - TIPOS
28. • Reconhecem e cortam o DNA em pontos específicos,
geralmente em seqüências de 4 a 8 pares de bases,
chamados palíndromos.
Enzimas de Restrição- DEFINIÇÃO
RADAR ARARA ANA
5’-GAATTC-3’
3’-CTTAAG-5’
29. Enzimas de Restrição- NOMENCLATURA
• Nome da enzima é a abreviação do nome da espécie
bacteriana do qual foi isolada.
- 1ª letra: Maiúscula e representa o gênero
- Duas outras letras: representam a espécie
- Outras letras indicam a linhagem ou cepa bacteriana
- Algarismos romanos indicam a ordem da descoberta
36. - Mutações dentro de sítios de restrição altera o
tamanho dos fragmentos gerados e assim a posição
das bandas na eletroforese .
- A existência de diversidade genética em uma
população é denominada polimorfismo, porém
mutações podem causar doenças e algumas podem
ser detectadas por RFLP.
Enzimas de Restrição- Aplicações
• RFLP (Restriction fragment length polymorphism)
39. • RFLP- Genotipagem
Enzimas de Restrição- Aplicações
Fig. 1. Restriction fragments obtained by digestion with Hinf I and Hae III of PCR’s amplicom using
primers PM2 lower and PM2 upper and template DNA of reference strains ATCC 33270, HG 1467
and HG1259 and some clinical isolates (26, 36, 243 and 583). (MM – molecular marker 100bp –
Fermentas).
(a) profiles not expected andobservedduring the tests.
41. Enzimas de Restrição- Mapas de Restrição
ATIVIDADE
O tratamento de uma molécula de DNA com tamanho de 8
kb com a endonuclease de restrição EcoRI resulta em dois
fragmentos: de 3 e 5 Kb. A digestão da mesma molécula com
Hin DIII gera os fragmentos de 1,5 e 6,5 Kb. Finalmente, a digestão
com as duas enzimas resulta em fragmentos de 1,5, 3 e 3,5.
Desenhe o mapa de restrição, indicando os sítios de clivagem de
EcoRI e HinDIII.
