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Enzimas de Restrição
Profª Drª Marta F. Bastos
• São proteínas que aumentam a velocidade das reações químicas
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celular não ocorreriam
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O tratamento de uma molécula de DNA com tamanho de 8
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com as duas enzimas resulta em fragmentos de 1,5, 3 e 3,5.
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Aula de Engenharia Genética sobre Enzimas de restrição

  • 1. Enzimas de Restrição Profª Drª Marta F. Bastos
  • 2. • São proteínas que aumentam a velocidade das reações químicas • Na ausência destas, diversas reações químicas do metabolismo celular não ocorreriam Enzimas
  • 8. Enzimas de Restrição- Histórico • Avery, MacLeod, McCarty (1944) demonstraram a transformação de uma cepa avirulenta de Streptococcus penumoniae; • DNA como elemento transformante
  • 9. Enzimas de Restrição - Histórico • Watson & Crick (1953): propõem o modelo da dupla hélice de DNA, baseados nos resultados de difração de raio X de Franklin & Wilkins.
  • 10. Procurar um gene dentro de um genoma humano é comparável a procurar uma pessoa sem sobrenome em uma casa sem endereço em uma rua desconhecida em uma cidade não identificada de um país estrangeiro. Solange Farah Enzimas de Restrição- Histórico
  • 11. • Estudos em Microbiologia sugeriam que bactérias apresentavam mecanismos de defesa para proteção contra infecções virais. Enzimas de Restrição- HISTÓRICO
  • 13. Enzimas de Restrição- HISTÓRICO • Arber (1962): microscopia eletrônica de bactérias E. coli e bacteriófagos Lambda fornecem a primeira evidência da existência de enzimas que restringem o crescimento viral devido ao reconhecimento e a quebra do DNA estranho. Arber & Linn. DNA modification and restriction. Ann Rev Biochem, 1969 . • Smith & Wilcox (1970): enzimas que cortam DNA em Haemophilus influenzae. Por que o DNA bacteriano também não é clivado?
  • 14. Enzimas de Restrição • Metilação do DNA bacteriano
  • 15. Enzimas de Restrição- HISTÓRICO • Nathans & Smith (1975): purificação das enzimas por métodos de cromatografia e digestão do DNA de SV40. Eletroforese
  • 16. Enzimas de Restrição- DEFINIÇÃO • São enzimas que atuam como tesouras químicas cortando DNA em seqüências específicas.
  • 17. • Tipo I: reconhece específicas sequências de DNA porém cortam em locais que podem estar a 1000 pb de distância do sítio de reconhecimento da enzima; Ex: EcoAI GAGNNNNNNNGTCA EcoKI AACNNNNNNGTGC StySPI AACNNNNNNGTRC Enzimas de Restrição - TIPOS
  • 18. • Tipo II: que reconhece e corta diretamente dentro do sítio de reconhecimento; Ex: EcoRI G/AATTC BalI TGG/CCA PstI CTGCA/G Enzimas de Restrição - TIPOS
  • 19. • Tipo III: Corte a 24-26 pb a jusante da sequência de reconhecimento que é assimétrica e de 5 a 7 pb Ex: EcoP151 CAGCAG EcoPI AGACC HinfIII CGAAT Enzimas de Restrição - TIPOS
  • 21.
  • 23. Importância do íon Magnésio para o reconhecimento específico Enzimas de Restrição
  • 28. • Reconhecem e cortam o DNA em pontos específicos, geralmente em seqüências de 4 a 8 pares de bases, chamados palíndromos. Enzimas de Restrição- DEFINIÇÃO RADAR ARARA ANA 5’-GAATTC-3’ 3’-CTTAAG-5’
  • 29. Enzimas de Restrição- NOMENCLATURA • Nome da enzima é a abreviação do nome da espécie bacteriana do qual foi isolada. - 1ª letra: Maiúscula e representa o gênero - Duas outras letras: representam a espécie - Outras letras indicam a linhagem ou cepa bacteriana - Algarismos romanos indicam a ordem da descoberta
  • 30. Enzimas de Restrição- NOMENCLATURA Microorganismo Enzima Sítio de reconhecimento
  • 31. Enzimas de Restrição • Tipos de extremidades formadas após digestão Extremidades cegas
  • 32. Enzimas de Restrição • Tipos de extremidades formadas após digestão Extremidades coesivas
  • 35. Enzimas de Restrição- Aplicações • Clonagem Molecular
  • 36. - Mutações dentro de sítios de restrição altera o tamanho dos fragmentos gerados e assim a posição das bandas na eletroforese . - A existência de diversidade genética em uma população é denominada polimorfismo, porém mutações podem causar doenças e algumas podem ser detectadas por RFLP. Enzimas de Restrição- Aplicações • RFLP (Restriction fragment length polymorphism)
  • 37. • RFLP- Detecção de Mutações Enzimas de Restrição- Aplicações
  • 38. • RFLP- Genotipagem Enzimas de Restrição- Aplicações
  • 39. • RFLP- Genotipagem Enzimas de Restrição- Aplicações Fig. 1. Restriction fragments obtained by digestion with Hinf I and Hae III of PCR’s amplicom using primers PM2 lower and PM2 upper and template DNA of reference strains ATCC 33270, HG 1467 and HG1259 and some clinical isolates (26, 36, 243 and 583). (MM – molecular marker 100bp – Fermentas). (a) profiles not expected andobservedduring the tests.
  • 40. Enzimas de Restrição- Mapas de Restrição
  • 41. Enzimas de Restrição- Mapas de Restrição ATIVIDADE O tratamento de uma molécula de DNA com tamanho de 8 kb com a endonuclease de restrição EcoRI resulta em dois fragmentos: de 3 e 5 Kb. A digestão da mesma molécula com Hin DIII gera os fragmentos de 1,5 e 6,5 Kb. Finalmente, a digestão com as duas enzimas resulta em fragmentos de 1,5, 3 e 3,5. Desenhe o mapa de restrição, indicando os sítios de clivagem de EcoRI e HinDIII.